杨玲凤，谢 辉，袁凌清，罗湘杭
Effect of adiponectin on the expression of nuclear factor kappa B ligand receptor activator in human osteoblasts

Yang Ling-feng, Xie Hui, Yuan Ling-qing, Luo Xiang-hang

Abstract
BACKGROUND: The main effect of receptor activator of nuclear factor-κB ligand (RANKL) excreted by osteoblasts is to maintain the differentiation and activity of osteoclasts and to inhibit apoptosis of osteoclasts.
OBJECTIVE: To observe the effect of adiponectin on the RANKL expression in osteoblasts and to approach the action of adiponectin on the osteoclastogenesis.
DESIGN, TIME AND SETTING: Single sample observation, the experiment was performed at the Institute of Endocrinology and Metabolism, The Second Xiangya Hospital of Central South University between August 2005 and March 2006.
MATERIALS: The 5 cancellous bone samples of normal adult (35-55 years old) anterior superior iliac spine were discarded in surgery and offered by donor voluntarily. Reconstituted human adiponectin was purchased from Calbiochem.
METHODS: We cultured osteoblasts using cancellous bone samples of normal adult anterior superior iliac spine in vitro. Human osteoblasts were incubated with different doses of adiponectin (0,3,10 and 30 mg/L) for 48 hours. Osteoblasts and CD14+peripheral blood mononuclear cells(PBMCs) were co-cultured for 14 days, and intervened by 30 mg/L adiponectin for 14 days, then intervened by 25μg/L M-SCF+ 50μg/L RANKL for 14 days. The co-cultured cells were used as positive controls for osteoclasts induction.
MAIN OUTCOME MEASURES: We determined the expression of RANKL by FQ-PCR and ELISA, intervened osteoblasts and PBMCs co-culture system by adiponcetin and observed its effect on the osteoclastogenesis.
RESULTS: Adiponectin promoted human osteoblast RANKL expression in a dose- and time-dependent manner. Adiponectin induced sPANKL production in a dose- and time-dependent manner in osteoblasts. Adiponectin induced the osteoclast formation in the co-culture systems of osteoblasts and PBMCs.
CONCLUSION: These findings show that adiponectin incduces osteoclast formation via stimulating RANKL production in osteoblasts.

Yang LF, Xie H, Yuan LQ, Luo XH. Effect of adiponectin on the expression of nuclear factor kappa B ligand receptor activator in human osteoblasts.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(24):4647-4650(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-24/24k-4647(ps).pdf]

摘要
背景：成骨细胞分泌的核核因子κB受体活化素配体的主要作用为保持破骨细胞的分化和活性，抑制破骨细胞的凋亡。
目的：观察脂联素对成骨细胞核因子κB受体活化素配体表达的影响，拟进一步探讨其对破骨细胞生成的作用。
设计、时间及地点：单一样本观察，于2005-08/2006-03在中南大学湘雅二医院代谢内分泌研究所完成。
材料：外科手术中弃之5份取正常成人（35~55岁）髂前上棘松质骨由供者自愿提供；人重组脂联素蛋白购自Calbiochem公司。
方法：正常成人髂前上棘松质骨体外培养成骨细胞。分别用0，3，10和30 mg/L脂联素干预人成骨细胞48 h。成骨细胞和CD14+外周血单核细胞共培养 14 d，用30 mg/L脂联素干预14 d，以25 μg/L 巨噬细胞集落刺激因子+ 50 μg/L 核因子 κB受体活化素配体干预14 d作为诱导破骨细胞阳性对照。
主要观察指标：分别采用荧光定量聚合酶链反应和酶联接免疫吸附剂测定的方法检测核因子κB受体活化素配体的表达；并用脂联素蛋白干预成骨细胞与外周血单核细胞共同培养系统，观察对破骨细胞生成的作用。
结果：①脂联素呈剂量和时间依赖性促进人成骨细胞核因子κB受体活化素配体的表达。②脂联素呈时间和剂量依赖性促进人成骨细胞可溶性破骨细胞异化因子蛋白的分泌。③脂联素干预成骨细胞与CD14+外周血单核细胞共同培养系统可诱导破骨细胞生成。
结论：脂联素可通过诱导成骨细胞核因子κB受体活化素配体表达，诱导破骨细胞生成。
关键词：成骨细胞；脂联素；NF-κB；组织构建

杨玲凤，谢辉，袁凌清，罗湘杭. 脂联素对成骨细胞核因子κB受体活化素配体表达的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(24):4647-4650 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-24/24k-4647(ps).pdf]

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0 引言

最近研究表明，脂联素可影响骨代谢[1-3]，但其具体的作用机制尚未明确。在骨组织中，核因子κB受体活化素配体的主要作用为刺激破骨细胞的分化和活性，抑制破骨细胞的凋亡。核因子κB受体活化素配体（RANKL）在破骨功能调控中起重要作用[4-6]。
本实验通过用重组脂联素蛋白干预人成骨细胞，观察核因子κB受体活化素配体表达的影响，并观察其对破骨细胞生成的作用。

1 材料和方法

设计：单一样本观察。
时间及地点：实验于2005-08/2006-03在中南大学湘雅二医院代谢内分泌研究所完成。
材料：外科手术中弃之5份正常成人（35~55岁）髂前上棘松质骨，均取得知情同意。人重组脂联素蛋白购自Calbiochem Corporation公司。
技术路线：
细胞培养：临床标本由湘雅二医院提供。正常成人成骨细胞培养方法参照作者前期的方法进行[1]。5份正常成人（35~55岁）髂前上棘松质骨并剪成2 mm3大小碎片，磷酸盐缓冲液冲洗摇荡3次，加入1 g/LIV型胶原酶37 ℃振摇消化，待松质骨变白并呈蜂窝状，加入含体积分数为0.2的胎牛血清的无酚红的MEM终止消化，用含体积分数为0.1的胎牛血清的MEM洗涤3次，待洗液中不含细胞时，将骨片贴于25 cm2 培养瓶壁，加含体积分数为0.15的胎牛血清的MEM，其中含50 mg/L 抗坏血酸，青霉素50 U/mL，庆大霉素50 mg/L，放至37 ℃，体积分数为0.05的CO2培养箱培养。2 d后换液，以后每3天换液1次，培养约15d后，可见有细胞游出，约25 d后达汇片，用 2.5 g/L胰酶-乙二胺四乙酸（Sigma公司）消化液消化，再接种25 cm2培养瓶，细胞数为5×105个/瓶。
荧光定量聚合酶链反应检测核因子κB受体活化素配体的表达：人成骨细胞按1×105个细胞/孔接种于24孔培养板。在含体积分数为0.1胎牛血清的α-MEM中培养4 d，细胞更换无血清培养基，分别用0、3，10和30 mg/L脂联素干预48 h。提取细胞总RNA，分别取1μg总RNA进行反转录。荧光定量聚合酶链反应采用Roche Molecular LightCycler。核因子κB受体活化素配体引物序列为：上游为5’TCG TTG GAT CAC AGC ACA TCA 3’，下游为5’TAT GGG AAC CAG ATG GGA TGT C3’。β-actin引物序列为：上游为5’CCC AGC CAT GTA CGT TGC TA3’,下游为5’AGG GCA TAC CCC TCG TAG ATG3’。扩增反应采用25μL体系，反应体系为：SYBR Green PCR Master Mix 10μL,上游引物(25μmol/L)1μL,下游引物(25μmol/L) 1μL, dNTPs (10 mmol/L) 1 μL, cDNA 2 μL, 加ddH2O至25μL。反应条件为：模板cDNA 94 ℃ 变性4 min 后进行循环，变性94 ℃，15ｓ，退火60 ℃，10ｓ，延伸72 ℃，10 s，共40个循环，最后于72 ℃延伸7 min。在每一循环的退火温度时收集荧光进行实时检测。再行融解曲线分析。反应结束后，根据目的基因及β-actin扩增标准曲线的Ct值算出基因表达的相对值。
可溶性破骨细胞异化因子（sRANKL）蛋白分泌：用酶联接免疫吸附剂测定试剂盒（(Biomedica Group, Windham, NH, USA）测定培养液可溶性破骨细胞异化因子的含量。
成骨细胞和CD14+外周血单核细胞共培养：CD14+外周血单核细胞是分离纯化的破骨细胞前身细胞。抽取健康自愿者全血，全血用Ficoll-Paque分离介质处理，外周血单核细胞从血沉棕黄层中分离。纯化前, 再用Ficoll-Paque分离处理使粒细胞污染小于1%。细胞纯化是用CD14 抗体覆盖的磁单元的磁力分离器进行细胞分选。纯度通过流式细胞计量仪评价。CD14+外周血单核细胞培养作为破骨细胞形成的前身细胞培养[7-8]。
人成骨细胞按1×105个细胞/孔接种于24孔培养板。然后CD14+外周血单核细胞(1×106 cells/well)加入培养板中与人成骨细胞共培养14 d（培养液含10-7 mol/L，1,25 (OH)2 vitamin D）[4]。细胞用30 mg/L脂联素干预14 d，25 μg/L巨噬细胞集落刺激因子+ 50μg/L 核因子κB受体活化素配体干预14 d作为诱导破骨细胞阳性对照。干预后细胞用抗酒石酸磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP, 破骨细胞标志酶）染色（TRAP染色试剂盒，Sigma），抗酒石酸磷酸酶染色阳性的多核细胞（细胞核≧3个）确定为破骨细胞[7]。
主要观察指标：①脂联素对核因子κB受体活化素配体表达的影响。②脂联素对可溶性破骨细胞异化因子蛋白分泌的影响。③脂联素对成骨细胞/CD14+外周血单核细胞共培养体系破骨细胞形成的影响。
设计、实施、评估者：实验设计为第一、二、四作者，实施为第一、二、三作者，评估为第一、三、四作者。所有人员均经过正规培训。
统计学方法：数据用x(_)±s表示，由第一、三作者经计算机统计软件SPSS 11.0处理，两组之间的均数比较采用配对t检验，P < 0.05表示差异有显著性意义。

2 结果

2.1 统计描述 脂联素对成骨细胞/CD14+外周血单核细胞共培养体系破骨细胞形成的影响：图1显示显微镜观察(200×)，与阴性对照组(0 mg/L 脂联素)相比，30 mg/L脂联素诱导红色抗酒石酸磷酸酶染色阳性多核破骨细胞形成。阳性对照25μg/L 巨噬细胞集落刺激因子+50μg/L 核因子κB受体活化素配体干预组诱导破骨细胞形成更明显。这表明脂联素可诱导破骨细胞形成。

2.2 统计推断
2.2.1 脂联素对核因子κB受体活化素配体表达的影响见图2。脂联素对人成骨细胞呈时间和剂量依赖性促进核因子κB受体活化素配体表达。3 mg/L 脂联素干预48 h后，核因子κB受体活化素配体表达较对照组明显增高(P < 0.05)。10 mg/L和30 mg/L脂联素干预时，核因子 κB受体活化素配体表达增加更为明显(P < 0.05)，见图2a。在脂联素干预培养12 h后，核因子κB受体活化素配体的mRNA表达较0 h明显增加[(180±12)％，P < 0.05]。干预24 h和48 h后，核因子κB受体活化素配体的mRNA增加更为显著[分别为对照组的(220±19)％和(316±14)％， P < 0.01]，见图2a。

2.2.2 脂联素对可溶性破骨细胞异化因子蛋白分泌的影响 见图3。

脂联素呈时间和剂量依赖性地促进成骨细胞可溶性破骨细胞异化因子蛋白的分泌。3~30 mg/L 脂联素干预人成骨细胞48 h后，可溶性破骨细胞异化因子的分泌较对照组明显增加(P < 0.05)，见图3a。30 mg/L 脂联素干预12 h 后，可溶性破骨细胞异化因子的释放轻微增高(P < 0.05)，而在24 h和48 h后，可溶性破骨细胞异化因子的分泌显著增高(P < 0.05)，见图3b。

3 讨论

实验结果表明脂联素呈时间和剂量依赖性地促进核因子κB受体活化素配体mRNA和蛋白的表达，脂联素诱导人成骨细胞/外周血单核细胞共同培养系统中的破骨细胞生成。
脂联素是新近发现的脂肪细胞因子，脂肪细胞可特异性地高表达脂联素。研究表明脂联素与胰岛素抵抗、2 型糖尿病、代谢综合征、动脉粥样硬化等病变的发生密切相关[9-13]。作者前面的研究证实人成骨细胞表达脂联素受体，脂联素诱导人成骨细胞增殖和分化[1]。但是脂联素对人成骨细胞分泌的核因子κB受体活化素配体作用尚未阐明。本实验表明，脂联素呈时间和剂量依赖性地促进核因子κB受体活化素配体mRNA和蛋白的表达，脂联素干预成骨细胞与外周血单核细胞共同培养系统可诱导破骨细胞生成。
核因子κB受体活化素配体是肿瘤坏死因子受体配体超家族成员11[4-5]，属Ⅱ型跨膜蛋白。在体内以细胞结合型和可溶性羰基末端两种形式存在，能直接启动破骨细胞前体细胞或破骨细胞细胞内信号转导过程，最终导致破骨细胞分化，增加其活性。核因子κB受体活化素配体基因敲除小鼠，表现为严重的全身性骨硬化，破骨细胞缺如，并有出牙障碍[4-5]。Yuan 等[14-15]研究表明，给大鼠持续皮下注射核因子κB受体活化素配体可引起低骨量和骨强度下降。系统研究证实核因子κB受体活化素配体是破骨细胞的分化、活化、成熟及凋亡过程中的最终调节因子[7]。核因子κB受体活化素配体一旦与核因子κB受体活化素结合就会刺激前体破骨细胞分化，活化成熟的破骨细胞，引起骨吸收。
临床研究发现，围绝经妇女血清中脂联素水平与骨密度呈负相关[16-18]。Misra等[19]研究表明血清脂联素水平与神经性厌食女性骨密度负相关。Jürimae 等[18,20]报道脂联素与绝经前后的妇女腰椎正位骨密度及全身骨密度负相关。Richards等[17]对绝经期妇女的研究发现，血清脂联素水平与身体各部位骨密度（包括非承重部位）呈负相关。作者的实验从分子细胞水平支持该结论，脂联素呈时间和剂量依赖性地促进核因子κB受体活化素配体mRNA和蛋白的表达，脂联素干预人成骨细胞与外周血单核细胞共同培养系统可诱导破骨细胞生成。脂联素可能通过促进核因子κB受体活化素配体表达，从而促进破骨细胞的形成和骨吸收功能，进而降低骨密度。虽然作者前期的实验发现脂联素促进人成骨细胞的增殖和分化[1]，推测，可能是由于骨代谢是相互偶联，破骨细胞和成骨细胞之间存在有机的联系，促进破骨细胞形成和功能的同时可促进人成骨细胞的增殖和分化，只是对破骨细胞的作用更明显些，从而在整体水平脂联素与骨密度呈负相关。脂联素是参与骨代谢调节的因子之一，关于脂联素与骨代谢的关系有待进一步深入研究。

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