韩焱福，宋建星，刘 军
Construction and identification of recombinant adenovirus containing human vascular endothelial growth factor 165 gene
Han Yan-fu, Song Jian-xing, Liu Jun
Abstract
AIM: Recombinant adenovirus possesses high transfection efficiency and wide host range. This study was designed to construct the recombinant adenovirus vector containing human vascular endothelial growth factor 165 (VEGF165), so as to lay a foundation for the subsequent gene transfection, microencapsulated genetically engineered cells and animal experiments.
METHODS: The experiment was conducted in the Laboratory of Cardiothoracic Surgery (the National Key Laboratory), Changhai Hospital of The Second Military Medical University of Chinese PLA from January to May in 2007. Experiment materials: pAxCAwt.VEGF165 was provided by Institute of Cardiothoracic Surgery of Changhai Hospital. pAxCAwt.VEGF165 and DNA-TPC were cotransfected into human embryonic kidney 293 cells by lipofection method. Being propagated, recombinant replication-deficient adenovirus named Ad.VEGF165 was obtained. The target gene of recombinant adenovirus was identified by polymerase chain reaction (PCR) and restriction enzyme digestion. The titer of virus was detected by 50% tissue culture infective dose method.
RESULTS: Construction of recombinant adenovirus Ad.VEGF165: The pAxCAwt.VEGF165 and DNA-TPC were successfully cotransfected into human embryonic kidney 293 cells by lipofection method, and replication-deficient adenovirus vectors coding for VEGF165 gene were generated. Identification of recombinant adenovirus Ad.VEGF165: Two fragments of PCR products (597 bp and 146 bp) were obtained by NcoI restriction enzyme. The result was consistent with that calculated with Gene Tool software. The virus titers was 2.2×1015 pfu/L.
CONCLUSION: DNA-TPC and pAxCAwt.VEGF165 can be used to construct replication-deficient recombinant adenovirus Ad.VEGF165 in a high titer, low toxicity, high efficiency and safe transfection in vitro.

Han YF, Song JX, Liu J. Construction and identification of recombinant adenovirus containing human vascular endothelial growth factor 165 gene.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(24):4651-4654(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-24/24k-4651(ps).pdf]

摘要
目的：基因重组腺病毒具有较高的转染率，且宿主范围广。实验拟构建携带人血管内皮细胞生长因子165基因的重组腺病毒载体（Ad.VEGF165），为后续基因转染、微囊化基因工程细胞及其动物模型研究提供实验基础。
方法：实验于2007-01/05在解放军第二军医大学长海医院胸心外科研究所实验室完成（国家级重点实验室）。①实验材料：pAxCAwt.VEGF165由长海医院胸心外科研究所惠赠。②实验方法：采用脂质体转染法，将pAxCAwt.VEGF165与DNA-TPC共转染人胚肾293细胞，扩增后获得载人血管内皮细胞生长因子165基因的复制缺陷型重组腺病毒。③实验评估：应用聚合酶链反应及酶切证实重组腺病毒中的目的基因。并根据50%组织培养感染剂量法计算病毒滴度。
结果：①重组腺病毒Ad.VEGF165的构建：采用脂质体法可使pAxCAwt.VEGF165与DNA-TPC有效转染人胚肾293细胞，扩增出载人血管内皮细胞生长因子165基因的复制缺陷型重组腺病毒。②重组腺病毒Ad.VEGF165的鉴定：聚合酶链反应的产物进行NcoⅠ酶切鉴定，可得到597 bp、146 bp 2个片段，与GeneTool软件理论上计算的结果完全一致，计算病毒滴度为2.2×1015 pfu/L。
结论：采用pAxCAwt.VEGF165与DNA-TPC系统经脂质体转染法成功构建的复制缺陷的重组腺病毒Ad.VEGF165滴度高、毒性低、效率高、体外转染安全。
关键词：血管内皮细胞生长因子；腺病毒；粘粒；同源重组；基因治疗；组织构建

韩焱福，宋建星，刘军. 血管内皮细胞生长因子165基因重组腺病毒的构建及其鉴定[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(24):4651-4654 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-24/24k-4651(ps).pdf]

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0 引言

血管内皮细胞生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）是1989年由Ferrara等[1]从牛垂体星状细胞体外培养分离出的一种糖蛋白，目前已发现的VEGF家族包括7个成员，即VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F和胎盘生长因子(Placeta Growth Factor，PIGF)[2]。VEGF-A发现最早，在组织和细胞含量最丰富，功能最强，经过不同的剪切方式可以7种不同的亚型出现，分别是VEGF121、VEGF145、VEGF148、VEGF165、VEGF183、VEGF189及VEGF206。VEGF165为最主要的同分异构体[3]。近年来VEGF基因治疗各种缺血性疾病成为国内外研究热点，VEGF促进内皮细胞增殖可以获得有效的血管新生，试验证实VEGF及其基因治疗有重要的血管化作用[4-5]。目前研究表明，直接将VEGF蛋白有费用高、副作用大、半衰期短等缺点，直接注射VEGF质粒又因转染效率低而限制了它的应用，而通过携带VEGF基因的重组腺病毒进行细胞转染则可以克服上述缺点。本实验通过将携带VEGF165基因的腺病毒粘粒载体导入人胚肾293细胞，制备VEGF重组腺病毒（Ad.VEGF165）。

1 材料和方法

设计：开放性实验。
时间及地点：实验于2007-01/05在解放军第二军医大学长海医院胸心外科研究所实验室完成。
材料： pAxCAwt.VEGF165系统由解放军第二军医大学长海医院胸心外科研究所惠赠。人胚肾293细胞(ATCC CRL1573)；Hela细胞(中国科学院上海细胞所)。
引物：腺病毒粘粒载体pAxCAwt公共PCR引物合成及测序由上海生物工程有限公司完成。上游引物5’-CTA GAG CCT CTG CTA ACC ATG TTC-3’；下游引物5’-GAT CTC AGT GGT ATT TGT GAG CC-3’，公共部分长度为230 bp。
试剂：限制性核酸内切酶(BioLabs公司)；PCR试剂和DNA-TPC(TaKaRa公司)；脂质体LF2000、Opti-MEMI(Invitrogen 公司)。
方法：
人胚肾293细胞和Hela细胞的培养：在含体积分数为0.1血清的培养基中（人胚肾293细胞用DMEM培养液，HeLa细胞用1640培养液），37 ℃、体积分数为0.05的CO2条件下培养。传代：对数生长期细胞，2.5 g/L 胰酶消化制成细胞悬液，按一定浓度加入新瓶中培养。
脂质体转染法：将1 mL 的脂质体、粘粒盒培养液混合物加入到铺满人胚肾293细胞25 cm2 培养瓶中，培养瓶置于体积分数为0.05的CO2、37 ℃ 湿度孵箱中培养2 h；加5 mL DMEM无血清培养液，继续培养24 h；转染细胞消化重悬后以70%的密度接种继续培养。
hVEGF165基因重组腺病毒的筛选和扩增：①第一代重组腺病毒的筛选：8~18 d 时将因病毒增殖引起细胞死亡的孔初步定为阳性孔，选择阳性孔10孔以上培养板中的阳性孔作为观察对象，将该板阳性孔的细胞悬液反复37 ℃/-80 ℃ 冻融6次，5 000 r/min 离心5 min，上清保存于-80 ℃，此为第一代重组腺病毒液。②将腺病毒液进一步感染人胚肾293细胞与Hela细胞，得到第2代、第3代重组腺病毒液。直至第4代重组腺病毒液。
Ad.VEGF165重组腺病毒的鉴定：收集病毒反应阳性的人胚肾293细胞，冻融破碎细胞得到病毒液后以酚/氯仿/异戊醇抽提病毒DNA进行PCR，同时抽提正常人胚肾293细胞基因组DNA并以携带VEGF165基因的腺病毒粘粒载体pAxCAwt.VEGF165行PCR作为对照。
根据GeneTool软件分析，VEGF165基因为513 bp，两端公共载体基因230 bp，PCR产物总长度为743 bp，VEGF165基因中有一个NcoⅠ酶切位点，位于146 bp处，因此理论上PCR产物经NcoⅠ酶切应得到146 bp和597 bp的两个片段。以此分析PCR产物是否为目的基因片段。
重组腺病毒的浓缩纯化及病毒滴度测定：采用氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒，收集病毒，-70 ℃ 保存备用。以50%组织培养感染剂量法(TCID50)测定病毒滴度，按KARBER法精确计算所测样本的病毒滴度[6]。
体外安全性研究：Hela细胞以5×104个/孔接种于12孔培养板，待细胞贴壁伸展后，按感染复数(Multiplicity of infection，MOI)值50计算所要加入Ad.VEGF165的体积，并以磷酸盐缓冲液定容至100 μL，分别加入12孔板的Hela细胞中，感染1 h 后，加入足量的5%NCS-1640培养液，共设2组：Ad.VEGF165组和未感染组，每组每个MOI值每个时间点设3个培养孔，观察细胞形态改变，每隔 2 天换液，分别于第1，3，5，7天消化细胞计数，绘制生长曲线。
主要观察指标：①正常及重组腺病毒感染后人胚肾293细胞生长状态。②重组腺病毒引物鉴定及hVEGF165 PCR扩增电泳图分析。③重组腺病毒滴度及Hela细胞感染重组腺病毒后的形态及细胞数变化。
设计、实施、评估者：实验设计为第一、二作者，干预实施为全部作者，评估为第一作者，均经过正规培训。
统计学分析：由第一作者采用SPSS 10.0软件进行 t检验，所有数据以x(_)±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.01为差异有非常显著性意义。

2 结果

2.1 细胞生长状态 生长状态良好的人胚肾293细胞贴壁快、伸展佳、边界清晰、细胞内颗粒少，一般3 d 需传代。
2.2 第1代Ad.VEGF165的产生 应用脂质体法，将重组腺病毒粘粒载体pAxCAwt.VEGF165与DNA-TPC导入人胚肾293细胞，经同源重组产生重组腺病毒。七八天后开始出现噬斑现象，见图1；12~15 d 时出现噬斑的孔中人胚肾293细胞发生肿胀、漂浮、死亡，见图2。

2.3 重组腺病毒的筛选及鉴定 以腺病毒空粘粒载体pAxCAwt和pAxCAi-LacZ粘粒为模板行聚合酶链反应，产物凝胶电泳分析可见230 bp和3 360 bp处各有一个高度特异性条带，与引物之间公共部分长度以及插入LacZ基因大小完全一致，见图3，证明引物序列是准确可靠的。

所制备腺病毒抽提DNA后进行聚合酶链反应，产物凝胶电泳分析可见在743 bp处有高度特异性条带，而人胚肾293细胞DNA进行PCR时不出现此条带，见图4。对PCR的产物进行NcoⅠ酶切鉴定，得到597 bp、146 bp 2个片段，与GeneTool软件理论上计算的结果完全一致，见图5。

2.4 重组腺病毒滴度测定 TCID50法测定第4代Ad.VEGF165的滴度约为1.2×1012 pfu/L。经氯化铯密度梯度离心后的滴度达到2.2×1015 pfu/L。
2.5 重组腺病毒体外转染的安全性 本实验中制备的重组腺病毒Ad.VEGF165以50的MOI值感染Hela细胞后，观察7 d，细胞未出现病态反应，各个时间点细胞计数两组间相比差异无显著性意义(P > 0.05)，细胞生长曲线见图6。

3 讨论

腺病毒载体可感染包括除造血细胞之外几乎所有类型的细胞，在鼠、兔以及人组织中均具有较高的转染率，与其他载体系统相比，腺病毒对分裂期和非分裂期细胞均能转染，且具有载体包装容量大，不与宿主细胞的染色体整合等许多优点。表达目的基因有2~4周的自限性，而宿主对腺病毒载体的免疫排斥反应也在一定程度上限制了腺病毒的表达时间，从而避免了目的基因的长期、过度表达，此外，腺病毒和细胞表面受体具有高亲和力的特性也有助于将载体局限，加强其靶向性，减少其对非靶细胞的毒性作用。故腺病毒载体是基因转移中最有前途的载体。李培建等[7]通过腺病毒介导转染的脑源性神经营养因子基因在大鼠坐骨神经内得到了有效表达，并通过轴突逆行转运到了相应的脊髓神经元。Giunta等[8]通过术前3~7 d 注射Ad.VEGF165 1×109 pfU，可使随意型皮瓣的比例从2∶1增加到3∶1，使其在皮瓣修复、创面愈合等整形外科应用研究中有较好的前景。
腺病毒作为基因载体有着不同的载体系统，以往常用的制备重组腺病毒是通过将转移质粒与腺病毒DNA共转染人胚肾293细胞，筛选得到重组腺病毒。该方法产生的腺病毒中野生型占了相当大的比例，重组腺病毒产生效率低且筛选较困难。而本实验采用Kanegae等[9]的方法，即将腺病毒基因组DNA末端蛋白复合物和重组粘粒共同转染人胚肾293细胞。DNA-TPC是腺病毒母病毒基因组Mr 55 000末端蛋白，发生同源重组后，腺病毒基因组的2个末端即具有末端蛋白，人胚肾293细胞可表达E1基因，通过重叠重组而复制，产生大量有目的基因的复制缺陷型重组腺病毒，这是本实验高效同源重组的关键。Sanae等[10]采用重组腺病毒粘粒pAxCAwt和Ad DNA-TPC的方法构建重组腺病毒，重组效率比转统方法提高了100倍。本实验应用TaKaRa公司的腺病毒重组试剂盒，其中DNA-TPC是经EcoT22I在7个位点以上切割，不仅同源重组效率高，而且降低野生型病毒的产生。已有研究表明用脂质体转染包装细胞效率高[11]。本实验采用脂质法构建重组腺病毒Ad.hEGF165，最后经氯化铯密度梯度离心后的滴度高达2.2×1015 pfu/L。
本实验设计了位于腺病毒粘粒载体pAxCAwt外源基因插入位点两端的公共引物，如果用此公共引物行PCR，产物经鉴定含有VEGF165基因，则目的基因必然已整合到腺病毒DNA中。PCR结果证明了引物的准确性。本实验抽提了人胚肾293细胞基因组DNA同时进行PCR，以排除人胚肾293细胞基因组DNA可能造成的假阳性结果，结果表明人胚肾293细胞基因组DNA行PCR未出现阳性条带。为进一步确证此条带即为VEGF165基因，本实验在PCR的基础上，对所得片段进行NcoⅠ酶切鉴定，得到597 bp、146 bp 2个片段，表明所获得的重组腺病毒中确实携带VEGF165基因。
目前绝大多数编码有潜在治疗作用的基因载体是用Ad5构建，其E1区的缺失，致使病毒复制缺陷，不会引起宿主细胞的损伤或病毒扩散，人胚肾293细胞能够通过提供E1蛋白进行反式互补。本实验中腺病毒粘粒pAxCAwt含5型腺病毒基因，其中E1区被删除。DNA-TPC与含5型腺病毒的粘粒pAxCAwt共转染人胚肾293细胞。在人胚肾293细胞内同源重组，包装成复制缺陷型腺病毒载体。在每次Ad载体扩增时，理论上均有产生野生型病毒的可能，由于Hela细胞对腺病毒具有显著的易感性，如果MOI低于100的病毒感染Hela细胞后就已出现CPEs，说明有野生型病毒污染。本实验结果显示没有发现野生型病毒，说明用脂质体/DNA-TPC方法构建的腺病毒载体具有纯度高、毒性低的优点。经过多次基因置换的复制缺陷性腺病毒载体仍不免有很强烈的免疫反应。Schaack等[12]证明E1A和E1B在腺病毒载体中的缺失是其重要原因，从而加深了人们对腺病毒的认识，并为腺病毒的进一步改造提供了思路。目前，重组腺病毒已从单一基因重组发展到2种以上基因融合的重组腺病毒，如Ye等[13]构建的VEGF165和Ang-1双顺反子融合基因重组腺病毒载体。
本实验成功地构建了携带人VEGF165基因的重组腺病毒，其滴度高、毒性低、效率高、体外转染安全，从而为进一步基因转染研究提供了实验基础。

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