李云鹏1，吕厚山2，王 宁2，关振鹏2
Expression and significance of programmed cell death 5 in fibroblast-like synoviocytes of rheumatoid arthritis
Li Yun-peng1, Lü Hou-shan2, Wang Ning2, Guan Zhen-peng2
Abstract
AIM: Programmed cell death 5 (PDCD5) has an important effect in the development of many diseases. However, the studies of effects on rheumatoid arthritis are few. The present study aimed to verify expression and localization of PDCD5 in fibroblast-like synoviocytes (FLS) of rheumatoid arthritis and to investigate feasible effect of PDCD5 in onset of rheumatoid arthritis.
METHODS: Experiments were performed at the Arthritis Clinic & Research Center, People's Hospital, Peking University from June 2005 to October 2006. Synovialis were collected from patients with rheumatoid arthritis or ostarthritis undergoing artificial total knee arthroplasty at the Arthritis Clinic & Research Center, People's Hospital, Peking University. All patients were diagnosed according to the criteria of American College of Rheumatology. Informed consents were obtained before the surgery and the experiment was approved by People's Hospital Ethics Committee of Peking University. Primarily cultured and passaged FLS were obtained to extract cell RNA and protein. Real-time fixed quantity polymerase chain reaction (PCR) and Western Blot were applied to detect PDCD5 mRNA and protein levels in FLS of rheumatoid arthritis and ostarthritis. Immunohistochemical analysis also revealed the localization of PDCD5 in these cells.
RESULTS: Compared to ostarthritis, down-regulation of PDCD5 mRNA and protein levels in FLS of rheumatoid arthritis was detected. The decreased PDCD5 expression was corresponded to the up-regulation of Bcl-2 in FLS of rheumatoid arthritis. PDCD5 protein was mainly localized to the cytoplasm of in vitro cultured FLS.
CONCLUSION: PDCD5 may contribute to inhibition of apoptosis induced by stimulatory signal in FLS from rheumatoid arthritis patients. Pathogenesis of rheumatoid arthritis may have inhibitory effect on apoptosis.

Li YP, Lü HS, Wang N, Guan ZP. Expression and significance of programmed cell death 5 in fibroblast-like synoviocytes of rheumatoid arthritis.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(24):4667-4671(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-24/24k-4667(ps).pdf]

摘要
目的：程序性细胞死亡分子5作为一个重要的凋亡正调控分子，在许多疾病的发生发展过程中起着重要的作用，但有关其在类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中的作用研究甚少。实验拟验证程序性细胞死亡分子5在类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中的表达水平及细胞定位分布，探讨程序性细胞死亡分子5在类风湿关节炎发病中的可能作用。
方法：实验于2005-06/2006-10在北京大学人民医院关节病诊疗研究中心完成。①实验材料：滑膜均取材于北京大学人民医院关节病诊疗研究中心行人工全膝关节表面置换术的类风湿关节炎或骨关节炎患者。所有患者均参照美国风湿病学会标准确诊。术前获得患者知情同意，并经北京大学人民医院伦理委员会批准。②实验方法：原代培养并传代分离获得型别均一的成纤维样滑膜细胞，提取细胞RNA和蛋白。③实验评估：实时定量聚合酶链反应及蛋白免疫印迹检测类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞和骨关节炎成纤维样滑膜细胞中程序性细胞死亡分子5 mRNA和蛋白的表达水平；制备细胞爬片采用免疫组织化学技术分析程序性细胞死亡分子5在成纤维样滑膜细胞中的定位分布特征。
结果：①相对于骨关节炎，分离培养的类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中程序性细胞死亡分子5在mRNA和蛋白水平上表达下调。②类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中程序性细胞死亡分子5的下调与抗凋亡分子Bcl-2的上调是协调一致的。③程序性细胞死亡分子5蛋白主要定位于体外培养的成纤维样滑膜细胞的胞浆中。
结论：程序性细胞死亡分子5可能参与类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞对凋亡刺激信号所产生的凋亡抑制过程，在类风湿关节炎的病理演变过程中可能具有抑制凋亡的作用。
关键词：程序性细胞死亡分子5；类风湿关节炎；成纤维样滑膜细胞；骨关节炎；凋亡；组织构建

李云鹏，吕厚山，王宁，关振鹏. 程序性细胞死亡分子5在类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中的表达与意义[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(24):4667-4671 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-24/24k-4667(ps).pdf]

>>本文导读<<

0 引言

类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis，RA）是以累及全身滑膜关节的增生性和侵蚀性滑膜炎为主要表现的慢性系统性自身免疫病。其主要病理特点是滑膜增殖、炎性浸润、软骨和骨侵蚀，最终导致关节畸形和功能障碍[1]。成纤维样滑膜细胞（Fibroblast-like synoviocytes，FLS）已被公认在类风湿关节炎病理演变中起着非常重要的作用[2]。类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞释放多种细胞因子，并因类风湿关节炎关节微环境变化而产生了转化特性，呈现肿瘤样细胞的内源性活化，存在异常凋亡与增殖。滑膜异常增殖与滑膜细胞凋亡缺陷有关，类风湿关节炎滑膜细胞凋亡缺陷是类风湿关节炎发病及病情进展的一个重要病理机制[3]。
人程序性细胞死亡分子5（Programmed Cell Death 5，PDCD5），最初被称为TFAR19 (TF-1 cell apoptosis related gene 19)，是北京大学人类疾病基因中心利用cDNA-RDA (cDNA Representational Differences Analysis) 技术从撤除生长因子诱导凋亡的人红白血病细胞系TF-1中克隆得到的凋亡表达上调基因[4]。
PDCD5作为一个重要的凋亡正调控分子，在许多疾病的发生发展过程中起着重要作用。目前已经发现PDCD5与白血病[5-7]、胃癌[8]、肺癌[9]等恶性肿瘤有关，并与肿瘤的发生、进展及预后相关；但国内外关于PDCD5在类风湿关节炎病理机制中的作用研究较少，本实验旨在观察PDCD5在类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中的表达水平，阐明PDCD5在滑膜中的表达模式及细胞定位分布。

1 材料和方法

设计：以细胞为观察对象，随机对照实验。
单位：北京大学人民医院关节病诊疗研究中心。
材料：实验于2005-06/2006-10在北京大学人民医院关节病诊疗研究中心完成。滑膜均取材于北京大学人民医院关节病诊疗研究中心行人工全膝关节表面置换术的类风湿关节炎或骨关节炎患者。所有患者均参照美国风湿病学会标准确诊[10-11]。术前获得患者知情同意，并经北京大学人民医院伦理委员会批准。
设计、实施、评估者：实验设计为第一、二作者，干预实施为第一作者，评估为第三、四作者。实验人员均经过专业培训。
方法：
滑膜细胞的培养：切取滑膜组织，无菌条件下剪碎，用40 g/L 胶原酶Ⅰ（Sigma公司）于37 ℃ 消化1 h，再加等量2.5 g/L 胰蛋白酶消化30 min。离心收集细胞沉淀，加0.5 g/L 胰蛋白酶-0.2 g/L EDTA于37 ℃ 温育10 min，离心收集细胞并接种于含体积分数为0.1胎牛血清+DMEM培养液（Gibco公司）的75 cm2 培养瓶中，置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中孵育。待贴壁细胞生长汇合至85%~90%时，2.5 g/L 胰蛋白酶消化进行1∶3传代。本实验中连续传6代以获得型别均一的成纤维样滑膜细胞。
实时定量聚合酶链反应：待成纤维样滑膜细胞在 60 mm2 培养皿生长汇满至85%~90%时收获细胞，应用Trizol试剂（Invitrogen Life Technologies，USA），按照说明书所述实验程序进行成纤维样滑膜细胞总RNA提取。使用GeneQuant Pro分光光度计进行RNA的定量，同时RNA凝胶电泳鉴定其质量。采用ImProm-ⅡTM反转录试剂盒（Promega公司）以Oligo（dT）为引物合成cDNA。采用TaqMan探针技术，应用美国ABI PRISM 7500 型荧光定量PCR仪 (Applied Biosystems公司)进行定量PCR检测。实时定量聚合酶链扩增引物：(a) PDCD5引物，正义链 5’-GTG ATG CGG CCC AAC AG-3’；反义链5’-ATC CAG AAC TTG GGC TAA GAT ACT G-3’。PDCD5探针：5’-FAM-TCT CAT TTC TGC TTC CCT GTG CTT TGC T-TAMARA-3’。(b) β2-MG (β2- microglobulin) 引物，正义链5’-GAG TAT GCC TGC CGT GTG-3’；反义链5’-AAT CCA AAT GCG GCA TCT-3’。β2-MG探针：5’-FAM-CCT CCA TGA TGC TGC TTA CAT GTC TC-TAMARA-3’。实时定量聚合酶链反应体系25 μL：1×TaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems)12.5 μL，1 μL cDNA模板，上、下游引物400 nM，探针200 nM。反应条件：50 ℃，2 min→95 ℃，10 min→95 ℃，15 s→60 ℃，1 min，共40个循环。结果以实时定量聚合酶连反应扩增后的PDCD5及β2-MG的Ct值分别计算，扩增结果以对内参基因β2-MG的相对表达单位（REU）表示。
蛋白免疫印迹分析：成纤维样滑膜细胞经2.5 g/L 胰酶消化后，离心沉淀，加入预冷的裂解Buffer (10 mmol/L Hepes pH7.4，0.15 mol/L NaCl，1 mmol/L EDTA， 1 mmol/L EGTA，1% Triton X-100，0.5% NP-40，with proteinase inhibitor cocktail freshly added)，冰上裂解细胞30 min。细胞裂解液在4 ℃ 18 000 g 离心20 min，取上清。用BCA蛋白分析试剂盒(Pierce，USA)测定上清的蛋白浓度，测定前先用已知浓度的牛血清白蛋白(BSA)做标准曲线。取40 μg 总蛋白，加入适当体积的5×上样缓冲液热变性后，按序上样进行15%SDS-PAGE电泳分离，然后利用Mini Trans-Blot湿式电转系统(Bio-Rad)将凝胶蛋白带转膜至PVDF膜（OSMONICS公司），50 g/L 脱脂奶粉室温封闭1 h，分别加入鸡抗人PDCD5多克隆抗体（1∶400）、鼠抗Bcl-2单克隆抗体相应一抗，4 ℃ 孵育过夜。TBS-T洗膜3次，10 min/次；然后将膜用相应的IRDye 800-标记的抗鸡或抗鼠IgG二抗室温避光孵育 1 h；TBS-T洗膜3次，10 min/次。固定于膜上的可被红外线激发的荧光团在800 nm 激发光的作用下，其波长为820 nm 的发射光可被Odyssey红外荧光成像系统(Odyssey Infrared Imaging System，Odyssey，Lincoln，NE)的信号检测器检测，所得信号可经LI-COR Biosciences公司提供的软件进行定性分析。
免疫细胞化学染色分析：将成纤维样滑膜细胞（第3代）按1×104 cm-2 的密度接种至放置于6孔板中灭菌处理的洁净盖玻片上，在DMEM培养基中孵育24 h 制备细胞爬片。待成纤维样滑膜细胞生长汇满至80%左右，细胞爬片用含有0.2% Triton X-100的30 g/L 多聚甲醛于室温下固定、穿膜30 min；磷酸盐缓冲液漂洗3次，5 min/次。室温下用体积分数为0.03的双氧水孵育10 min 以消除内源性过氧化物酶活性；磷酸盐缓冲液漂洗后，滴加体积分数为0.05的胎牛血清，室温封闭30 min。倾去血清，滴加抗PDCD5单克隆抗体（3A3）一抗溶液(稀释度 1∶200)并于4 ℃ 孵育过夜，鼠IgG1为阴性对照；复温15 min，用磷酸盐缓冲液漂洗后，滴加EnVisionTM二抗工作液（DAKO公司），室温下孵育30 min。磷酸盐缓冲液漂洗，滴加新鲜配置的DAB-H2O2显色液（DAKO公司）光镜下控制显色，然后苏木精复染，1 %(质量分数) 盐酸乙醇分色，1%氨水碱化，脱水，透明和封固。显微镜下观察到的图像应用Leica显微成像系统（德国LEICA公司）进行细胞爬片的图像采集、分析处理。
主要观察指标：①实时定量聚合酶链反应及蛋白免疫印迹检测类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞和骨关节炎成纤维样滑膜细胞中PDCD5 mRNA和蛋白的表达水平。②免疫组织化学技术分析PDCD5在成纤维样滑膜细胞中的定位分布特征。
统计学分析：由第一作者采用SPSS 11.0软件完成统计处理，对正态分布的定量资料进行独立样本t检验，实验结果以x(_)±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 类风湿关节炎和骨关节炎成纤维样滑膜细胞中PDCD5 mRNA的表达 原代培养并传代分离成纤维样滑膜细胞，提取细胞总RNA，比较类风湿关节炎和骨关节炎患者来源的成纤维样滑膜细胞中PDCD5 mRNA的表达情况。实时定量聚合酶链反应分析表明，类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中PDCD5 mRNA水平比骨关节炎成纤维样滑膜细胞中的低3倍多，见图1。

2.2 类风湿关节炎和骨关节炎成纤维样滑膜细胞中PDCD5蛋白的表达 为了进一步证明类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞和骨关节炎成纤维样滑膜细胞中PDCD5蛋白的表达差异，从类风湿关节炎和骨关节炎患者的滑膜组织中分离成纤维样滑膜细胞，提取细胞总蛋白并进行免疫印记分析。
蛋白免疫印迹检测结果提示，与骨关节炎成纤维样滑膜细胞相比，4个代表性的类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞样本中PDCD5蛋白表达皆不同程度地下调，见图2a。另外，Bcl-2是一典型的抗凋亡基因，且研究发现Bcl-2在类风湿关节炎滑膜组织中表达上调。鉴于此，为了进一步说明PDCD5是否与类风湿关节炎滑膜的凋亡缺陷相关，本实验选择Bcl-2作为参照，在相同的实验条件下，同时检测PDCD5和Bcl-2在类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中的蛋白水平。如图2b所示，免疫印记分析结果显示Bcl-2在类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中的表达比骨关节炎成纤维样滑膜细胞增强，这说明类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中PDCD5表达下调与Bcl-2表达增强是一致的。

2.3 PDCD5蛋白在类风湿关节炎和骨关节炎成纤维样滑膜细胞中的表达差异及定位 本实验利用特异的PDCD5单抗进行免疫细胞化学染色，对比类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞和骨关节炎成纤维样滑膜细胞中PDCD5的表达和定位。
如图3所示，在体外培养的成纤维样滑膜细胞中，类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞的PDCD5阳性染色强度明显弱于骨关节炎成纤维样滑膜细胞的阳性染色强度；另外，值得注意的是无论在体外培养的类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞还是骨关节炎成纤维样滑膜细胞中，PDCD5阳性染色主要位于胞浆内，这说明PDCD5蛋白主要定位于体外培养的成纤维样滑膜细胞的胞浆中。

3 讨论

类风湿关节炎是以多个滑膜关节受累为主要表现的慢性系统性自身免疫病。目前，关于滑膜增殖的机制尚不完全明晰，但是类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡受抑与类风湿关节炎的发病密切相关[12]。越来越多的证据表明，类风湿关节炎滑膜组织中，尤其是附着于骨、软骨侵蚀处的类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞被广泛激活，活化的类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞对刺激信号诱导的凋亡具有抗性而表现凋亡缺陷现象[3]。
细胞凋亡是由基因控制的细胞自主的、有序的死亡，其生理意义是维持内环境稳定。病理状态下，这种平衡可能被破坏而导致细胞凋亡紊乱；所以，促凋亡基因和抗凋亡基因之间平衡的破坏，与许多疾病病理机制相关[13]。已有研究表明，许多基因如Sentrin[14]、FLIP[15-16]、PUMA[17]等和类风湿关节炎滑膜细胞的凋亡缺陷相关。

PDCD5是从凋亡的TF-1细胞中克隆的新基因，能够促进不同凋亡诱导因素触发的细胞凋亡[4]。因此，作为细胞凋亡调控子的PDCD5和疾病的相关性及其作用已经备受关注。许多研究已经证明PDCD5在恶性肿瘤中表达下调，如白血病[5-7]、肝癌[18]、胃癌[8]、肺癌[9]等，而且PDCD5表达异常与某些肿瘤（如胃癌）的预后相关；但是PDCD5与自身免疫病的关系国内外研究较少，已有研究发现PDCD5参与骨关节炎病理过程，骨关节炎关节软骨细胞中凋亡明显增加，PDCD5表达上调，且在细胞核内积聚，PDCD5导致表层及深层软骨的丢失，并伴随软骨下骨增生[19]。而类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞具有转化特性，具有肿瘤细胞样的某些行为特性。国内外关于PDCD5在类风湿关节炎病理机制中的作用研究较少。
笔者既往应用免疫组织化学染色技术发现PDCD5在类风湿关节炎和骨关节炎滑膜组织中具有不同的表达特征，即在成纤维样滑膜细胞富集的滑膜衬里层，PDCD5的表达明显不同[20]。成纤维样滑膜细胞占正常滑膜衬里层细胞的70%~80%。PDCD5在滑膜组织中特定的表达模式，启示作者预测到成纤维样滑膜细胞可能是PDCD5作用的靶细胞。于是对PDCD5在类风湿关节炎滑膜中的作用及其机制进行了进一步深入研究。首先原代培养并传代分离出型别较为均一的成纤维样滑膜细胞，在mRNA和蛋白水平上观察PDCD5的表达，证明类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中PDCD5表达下调，而且PDCD5蛋白主要定位于体外培养的成纤维样滑膜细胞的胞浆中。此外，进一步观察到类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞PDCD5的下调与抗凋亡分子Bcl-2的上调协调一致。PDCD5在类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中的异常表达初步提示PDCD5可能参与了类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞对凋亡刺激信号所产生的凋亡抑制过程，因而在类风湿关节炎的病理演变过程中具有一定的作用。
促凋亡基因PDCD5在类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中的低水平表达对于进一步阐明类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡抵抗的机制有一定意义。这种凋亡缺陷可能含有两种含义：一是滑膜细胞丧失了完成凋亡诱导因素促发凋亡过程的能力，二是对凋亡诱导因素产生了抗性，这可能由于滑膜细胞能够超表达抗凋亡因子或者下调促凋亡因子。目前，调节类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞对凋亡易感性的关键因子尚不完全清楚。但可以预测随着对PDCD5在类风湿关节炎中作用机制精确而详尽的研究及阐明，有助于将来可能利用PDCD5对类风湿关节炎进行治疗干预。

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