刘 勇1，裴国献2，江 汕2，梁双武2，赵培冉2
Dynamic changes in tissue-engineered bone encapsulated with fascial flap for repairing rabbit large bone defects
Liu Yong1, Pei Guo-xian2, Jiang Shan2, Liang Shuang-wu2, Zhao Pei-ran2
Abstract
BACKGROUND: The vascularization is the key point to construct tissue-engineered bone.
OBJECTIVE: To dynamically study the vascularization and bone defect reparation rule about tissue-engineered bone wrapped by pedicle fascial flap to repair large bone defect.
DESIGN, TIME AND SETTING: The randomized control animal experiment was performed at the Laboratory of Orthopaedic Trauma, Nanfang Hospital, Southern Medical University from October 2005 to April 2006.
MATERIALS: Bone marrow stromal stem cells (BMSCs) harvested from the bilateral iliac bone of twelve six-month old healthy New Zealand rabbits were used to induce osteoblasts. (3×15) mm cylindrical porous β-tricalcium phosphate was purchased from France Beiaolu.
METHODS: After co-culture of osteoblasts and β-tricalcium phosphate for 7 days, tissue-engineered bone was obtained when cell number was 1×109L-1. Tissue-engineered bone wrapped by pedicle fascial flap was implanted into the 1.5 cm radial defect region of anterior left limb of rabbits in the experimental group. Tissue-engineered bone was implanted into the 1.5 cm right radial defect region of the same rabbits in the control group.
MAIN OUTCOME MEASURES: At 2, 4, 6, 8 and 12 weeks after operation, specimen observation, histology, radiology, bone density and radionuclide bone scan were used.
RESULTS: Bone reparation in the experimental group was better than in the control group from 4 weeks after operation. The quantitative analysis on X-ray was higher in the experimental group than in the control group (P < 0.05). Bone density and the intensity of radioactivity were higher in the experimental group than in the control group (P < 0.05). After 4 weeks, at every time point, the experimental group was better than the control group not only in vascularized degree, new bone formation and materials degradation speed, but also in bone repair time and bone rebuild quality.
CONCLUSION: Four weeks later, vascularized degree, new bone formation, materials degradation speed and bone repair time were better in rabbits treated with tissue-engineered bone wrapped by pedicle fascial flap for repair bone defect than in rabbits only treated with tissue-engineered bone. This indicates that early quick vascularization directly influences the whole course of bone defect reparation.

Liu Y, Pei GX, Jiang S, Liang SW, Zhao PR. Dynamic changes in tissue-engineered bone encapsulated with fascial flap for repairing rabbit large bone defects.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(24):4672-4676(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-24/24k-4672(ps).pdf]

摘要
背景：组织工程骨的血管化是构建过程中的关键环节。
目的：动态观察带蒂筋膜瓣包裹组织工程骨的血管化过程，以及其修复大段骨缺损的一般规律。
设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2005-10/2006-04在南方医科大学南方医院创伤骨科实验室完成。
材料：6月龄健康新西兰大白兔12只双侧髂骨抽取骨髓分离骨髓基质干细胞诱导分化成骨细胞。圆柱状（3×15）mm多孔β-磷酸三钙为法国贝奥路公司产品。
方法：将成骨细胞与β-磷酸三钙复合培养7 d后细胞量达到1×109 L-1为组织工程骨，实验组兔左侧前肢内侧剥离带蒂筋膜瓣（2×1.5）cm包裹圆柱状组织工程骨植入1.5 cm桡骨缺损处，对照组于同一只兔右侧桡骨1.5 cm骨缺损处植入未包裹组织工程骨。
主要观察指标：植入后2，4，6，8，12周进行大体观察、组织学、放射学、骨密度和放射性核素骨显像检测。
结果：①从第4周以后各时间点实验组修复效果均优于对照组，Ｘ射线相对阻射值定量分析实验组的评分高于对照组（P < 0.05），骨密度值高于对照组（P < 0.05），放射性强度高于对照组（P < 0.05）。②从第4周以后各个观察点实验组在血管化程度、新骨形成量、材料降解速度、骨缺损修复时间、骨修复改建质量都优于对照组。
结论：采用蒂筋膜瓣包裹组织工程骨修复骨缺损，4周后，在血管化程度、新骨形成量、材料降解速度及骨缺损修复时间方面均优于无筋膜包裹的组织工程骨，提示早期的快速血管化直接影响到骨缺损修复的全过程。
关键词：组织工程骨；血管化；组织构建

刘勇，裴国献，江汕，梁双武，赵培冉. 筋膜瓣包裹组织工程骨修复兔大段骨缺损的动态变化[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(24):4672-4676 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-24/24k-4672(ps).pdf]

>>本文导读<<

0 引言

在体外构建的组织工程骨是细胞与材料的复合体，本身没有营养来源，体内植入后小组织可通过周围组织液获取营养，或通过周围血管长入，使其逐渐与周围组织建立血液循环获得营养。而构建大块组织工程化骨过程中，依靠周围组织血管长入速度太慢，所需时间较长，且很难使长入的血管达到组织的深层，从而导致在建立新的血循环之前，复合在材料上的细胞已经死亡。因此促进移植物的血管化是组织工程领域的重点，当今许多方法对组织工程骨的血管化具有明显的促进作用[1-10]。本文采用带蒂筋膜瓣包裹组织工程骨的方法，以及自身对照，多种方法，从不同的角度对其修复兔桡骨大段骨缺损的过程进行动态观察，借以探索其一般规律。

1 材料和方法

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：实验于2005-10/2006-04在南方医科大学南方医院创伤骨科实验室完成。
材料：清洁级健康新西兰大白兔12只（由南方医科大学南方医院动物所提供，许可证号：2006A024）, 6个月龄，雌雄不限，体质量2~3 kg。材料和试剂：多孔β-磷酸三钙(圆柱状，直径 3 mm，长15 mm) 由法国贝奥路公司提供，气孔率75(士10)%(球型孔>80%，微孔<20%，球型孔孔径550(±100)μm，孔与孔的内连接径130(±50)μm，孔与孔的沟通率达100％，力学强度> 2 MPa。胎牛血清(Hyclone)，DMEM培养基、胰蛋白酶、抗坏血酸、地塞米松、β-甘油磷酸钠均购自Sigma公司。
技术路线：
每只兔双侧髂骨抽取骨髓，细胞培养按文后参考文献[11]的方法，将骨髓基质干细胞分离扩增诱导为成骨细胞，并与β-磷酸三钙（直径 3 mm，长1.5 cm）复合培养7 d后细胞量达到 109 L-1备用；实验组于兔左侧前肢内侧做一纵形切口，长约3 cm, 切开皮肤、仔细剥离带蒂筋膜瓣，长2 cm，宽1.5 cm，备用；沿指伸肌间隙锐性分开，显露桡骨。直尺测量1.5 cm长度桡骨，并用线锯截取，将复合细胞的圆柱状β-磷酸三钙植入骨缺损处，并用带蒂筋膜瓣将之包裹，将筋膜瓣与周围组织固定，生理盐水冲洗伤口后逐层缝合，切口用敷料包扎；对照组于同一只兔右侧桡骨制作1.5 cm骨缺损，植入复合细胞的圆柱状β-磷酸三钙，而不用筋膜瓣包裹。术后青霉素钠40万U肌注，2次/d，共3 d预防感染。
观察检测指标：分别在术后2，4，6，8，12周进行：①大体观察，观察术后兔饮食活动及伤口愈合情，取材后观察缺损部位的骨痂变化,骨修复情况。②X射线片观察，在麻醉下拍摄双前肢正位片，条件为55 kV，50 mA，0.2 s,观察各组动物骨缺损修复情况，并运用Image- Proplus5.0图像处理软件对X射线片骨缺损部位的阻射值进行定量分析。③骨密度检测，利用双能骨密度仪(DXA)观察骨缺损部位的成骨质量，并对骨密度值进行定量分析。④放射性核素骨显像检测，经兔的耳缘静脉注射99Tcm-MDP (18.5 MBq/kg)，4 h后检测，以1帧/5 min采集一副静态图像，能峰140 keV，窗宽20％，矩阵256×256，缩放1.5。影像处理：分别以骨缺损区和正常肱骨5 mm×10 mm大小的矩形为感兴趣区。使用ROI计数，计算T/ NT（骨缺损区单位象素的计数（每pixel）/正常肱骨单位象素的计数（每pixel），并对数值进行定量分析。⑤组织学分析，标本取材后常规制作组织切片进行masson染色，对成骨情况进行观察。

主要观察指标：①大体及X射线片观察结果。②骨密度和ECT放射性核素骨显像检测结果。③各时间点组织学分析结果。
设计、实施、评估者：实验设计为第二作者，实施、评估为第一作者。
统计学方法：由第一作者对所测数据采用SPSS 13.0软件包进行配对样本的t检验，P < 0.05时为有显著性差异。

2 结果

2.1 实验动物数量分析 实验选用新西兰大白兔12只，无脱失，进入结果分析12只。
2.2 统计描述
2.2.1 两组兔大体观察 术后第1天所有兔的精神状况稍差，进食略减少，活动减少。全身无皮疹及畏寒发热，无血尿。2 d后逐渐恢复正常活动，饮食增加，精神好转。实验过程中无感染及死亡。
实验组标本术后2周材料表面和缺损区有多量纤维结缔组织填充，骨痂少量；4周时骨痂量明显增多；6周时骨痂将材料大部分包裹；8周时材料表面及骨缺损区骨痂增多更明显，大部分桥接部与截骨端愈合；术后12周材料完全被骨痂所包裹，骨痂成熟，与周围骨组织界限不清，完全填充骨缺损区。图1a。
对照组标本术后2周材料表面和缺损区可见少量纤维结缔组织填充，未见明显骨痂；4周时少量骨痂形成；6周时骨痂增多，但还未将材料大部分包裹；8周时材料表面及骨缺损区骨痂增多，大部分桥接部与截骨端还未愈合；术后12周增多的骨痂将材料大部分包裹，但骨痂还未完全成熟，与周围骨组织界限还很明显。见图1b。

2.2.2 两组兔X射线片观察结果 实验组术后2周时，材料清晰可见，骨缺损区断端明显，与对照组无明显差别；4周时实验组骨缺损区及材料周围出现模糊，有点状及絮状阻射影，而对照组表现仍相对清晰；6周时实验组骨缺损区及材料周围比对照组更加模糊；8周时实验组材料周围及骨缺损区呈斑片状阻射影，材料可见吸收，组织工程化骨成骨量增多，与两截骨部间隙变模糊，而对照组材料吸收不明显，组织工程骨成骨量较少,与两截骨部间隙变仍可见；12周时实验组植入组织工程骨和桥接部连成大片状阻射影，组织工程骨与截骨两端断以骨性连接，材料大部分降解、吸收，骨缺损基本愈合，对照组可见组织工程骨与截骨两端断间隙模糊，材料可见部分降解、吸收，骨缺损还未完全愈合。见图2。

2.3 统计推断
2.3.1 两组X射线片相对阻射值 见表1。

参考Yang氏评分法[12]，对两组X射线片进行Ｘ线相对阻射值定量分析，可见自第4周后，实验组的评分都高于对照组，差异具有显著性(P < 0.05)。
2.3.2 两组兔骨密度 见表2。

两组在术后2周差异不明现，从4周开始，实验组的骨密度显著性的大于对照组，见图3。

2.3.3 ECT放射性核素骨显像结果 见表3。

2周时实验组的放射性强度显著性的大于对照组，并在4周时达到高峰，以后逐渐下降，但在各个时间点，实验组的放射性强度都大于对照组，见图4。

2.3.4 各时间点组织学分析(masson染色) 2周时实验组可见大量绿染的胶原纤维，并见大量的微血管端面及少量的新生骨，而对照组胶原纤维量少且稀疏，微血管及新生骨少见；4周时实验组仍见较多胶原纤维，新生骨明显增多，材料部分降解，对照组胶原纤维量相对增多，可见少量新生骨及开始降解的材料；6周以后的各个时间段，实验组的新生骨量，材料降解量均明显大于对照组，见图5。

3 讨论

组织工程骨移植过程由再血管化、骨再生、骨端融合几个基本环节组成，其中再血管化是最基本的环节，组织工程骨修复骨缺损的基础依然是它的血管化,再血管化能将成骨细胞、前体细胞、相关信号分子、营养物质及其他参与骨发生与修复的细胞大量携带到局部微环境中，并带走局部旺盛的新陈代谢产生的废物及坏死分解产物，维持局部为一个动态的微环境。
组织工程骨植入骨缺损后首先是一个软骨化成骨的过程[13]，植入的β-磷酸三钙是一种良好的组织工程骨支架材料[14]，带蒂筋膜瓣包裹β-磷酸三钙可见其表面弥散的毛细血管能从各个方向长入β-磷酸三钙接触面，增加β-磷酸三钙血供促进骨化过程。血管的重建贯穿骨愈合修复的全过程，毛细血管是肉芽组织的重要组成成分，毛细血管生成的时间、量及质量会直接影响到创伤愈合的结局，是决定骨愈合的重要因素[15]。在形成血管组织时，创伤诱导血液凝集，血小板失去颗粒释放多种生长因子，启动修复过程。而快速的血管化可以加速这一过程，组织学显示毛细血管以出芽方式弥散性长入β-磷酸三钙，筋膜瓣包裹的组织工程骨内再血管化的速度明显快于未用筋膜瓣包裹的对照组。其再血管化的方式主要是毛细血管活跃增生，可能是在窦隙状毛细血管形成基础上，彼此相互交通、吻合，形成复杂的球形毛细血管网络。组织学上在早期（2周）Masson染色可见致密的胶原纤维形成,以及内含红细胞的新生血管,且炎症细胞浸润已不明显。血管化作用活跃的部位有成团或成片的间充质细胞群，伴有较少的纤维肉芽组织。揭示了其促进血管化的靶目标可能是通过早期快速毛细血管增生，大量运转宿主定向间充质细胞至骨移植体中，李文革等[16]研究了早期血管生成与骨生成的关系，发现其存在着明显的正相关，早期血管生成对成骨活动至关重要。随着时间的延长，胶原纤维的成熟、矿化，移植物内的血管数量逐渐达到平台期（4周），而此时骨痂数量则达到高峰，β-磷酸三钙降解也加快，伴随着成骨量明显增加，直至移植物完全降解、骨化，修复骨缺损。而对照组在2周时血管形成量很少，相应的骨痂形成量和胶原纤维含量显著减少，进而整个骨修复过程延迟，可能是由于移植物血管化的过程延迟（主要靠周围组织的毛细血管长入），使之不能在早期将机体由于创伤反应产生的一系列促成骨因素（生长因子、间充质细胞等）运往骨缺损处。延迟的血管化与机体创伤应激的不平行产生的迟滞效应，使胶原纤维、骨的生成量无论在量与质上都降低，从而延缓了骨的修复。
从X射线摄片结果表明，2周时，实验组和对照组差异不显著，植入β-磷酸三钙都清晰可见，这与此时期胶原还未矿化成熟有关。随着时间的延长，胶原纤维逐渐矿化成熟，在4周时，实验组已经明显的优于对照组，并且在随后的观察期内一直具有明显的修复优势，可见早期的血管化直接影响了骨缺损修复的全过程。
骨骼的主要无机成分为羟基磷灰石晶体,依靠化学吸附和离子交换从血液中获取磷酸盐来进行代谢更新。99Tcm-MDP静脉注射后,通过吸附方式与晶体表面结合沉积在骨骼内, 且主要与骨内未成熟的胶原结合。无论何种原因促使成骨细胞活跃、新骨形成加快，均可导致放射性核素摄取增加。因此,作为一种亲骨性示踪剂显示骨骼影像, 99Tcm-MDP在骨骼内的沉积量受局部血流量、骨骼无机盐代谢和成骨活跃程度的影响[17]。由本实验的骨显像可见兔双侧桡骨植入β-磷酸三钙处不同时期均有不同程度的放射性浓聚，表明局部建立血循环。同时发现实验组在2~4周为放射性核素摄取高峰期，尤以4周时更为明显，是由于血管重建迅速，局部血供丰富，代谢旺盛的缘故；而4周后两组摄取核素量又显著下降，是由于材料降解增多，新骨逐渐成熟，未成熟胶原迅速减少的缘故。这与X射线表现和组织学变化是一致的。
骨密度定量检测法是估测骨生物力学特性的研究方法之一，并且是检测骨质量的良好方法[18-19]，在诸多骨密度测定法中,双能骨密度仪(DXA)可消除软组织影响而精确求得骨密度。β-磷酸三钙植入后，随着时间的延长，移植物内部新骨替代比例逐渐增大，血管化也愈来愈完全，β-磷酸三钙逐渐转变为一个对应力起反应的活骨组织，患肢活动、负重刺激，移植物适应新的力学环境进行自身改建、塑造。此时移植物的生物力学性能就会得到改善和提高。本实验结果显示在从第4周开始，实验组的骨密度就明显的优于对照组，这可能是因为早期快速的血管化加强了骨的改建能力，骨的破坏与重建加速，使得成骨质量大大提高，使之更接近正常骨。
总之，本实验应用了多种手段，从不同的侧面，不同的角度对带蒂筋膜瓣促进组织工程骨血管化的过程进行了相对动态的观察，认为带蒂筋膜瓣可以很好的促进组织工程骨的血管化[20]，并且关键在于早期，可能早期的血管化与机体创伤应激产生的有利于骨修复的综合因素相平行，并且使这一过程具有“正反馈”的特点，直至完成骨缺损的修复。这对指导临床工作具有重要的意义。当然，对于血管化的影响程度、方式及机制等还需进一步的研究。

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