崔云华，周 爽，吴焕淦，王晓梅，谭琳蓥，刘慧荣
Regulatory effect of herbs-partition moxibustion on cycloxygenase and prostaglandin E2 in ulcerative colitis rats at apoptosis directions
Cui Yun-hua, Zhou Shuang, Wu Huan-gan, Wang Xiao-mei, Tan Lin-ying, Liu Hui-rong
Abstract
BACKGROUND: Previous researches show that moxibustion can regulate the expression of cycloxygenase (COX-2) and prostaglandin E2 (PGE2) and affect cell apoptosis through cytokine.
OBJECTIVE: The study observed the correlation of the expression of COX-2, Bax, Bcl-2, PGE2 content to ulcerative colitis, and explored the effects of the moxibustion, compared the differences between herbs-partition moxibustion and mild moxibustion.
DESIGN, TIME AND SETTING: Randomized control animal experiments were performed at the Animal Experimental Center of Shanghai University of TCM and Laboratory of Acupuncture and Immunity of State Administration of Traditional Chinese Medicine from April 2006 to March 2007.
MATERIALS: Total 40 male SD rats (SPF grade) with body weight of (140±20) g were selected to establish rat models of ulcerative colitis by immunology and local excitation.
METHODS: Forty rats were randomly divided into a normal control group, a model group, a herbs-partition moxibustion group, a mild-warm moxibustion group and each group have 10 rats. Rat models in the normal control group did not do any therapy. Rat models in the model group did grip fixation as the therapy group. Rat models in the mild-warm moxibustion group were treated by suspense moxibustion at the Tianshu (ST 25) and Qihai (RN 6) acupoints for 10 minutes. Rat models in the herbs-partition moxibustion group were treated by herbs-partition moxibustion at the Tianshu (ST 25) and Qihai (RN 6) acupoints for 2 zhuang. All treatments were used once a day for 14 days.
MAIN OUTCOME MEASURES: Expression of COX-2, Bax, Bcl-2 was detected by immunohistochemistry. PGE2 content in colon tissue of ulcerative colitis rats was measured by radioimmunity.
RESULTS: Thirty-nine SD rats were included in the final analysis. One rat was dead during modeling. Dissection showed that the rat's colon was obviously expanded, but did not perforate. The expression of COX-2, Bcl-2 and the content of PGE2 in colon tissue were significantly higher compared with control rats (P < 0.01). The Bax expression was significantly lower than normal rats (P < 0.01). After moxibustion therapy, the expression of COX-2, Bcl-2 and the content of PGE2 in the herbs-partition moxibustion group and the mild-warm moxibustion group were reduced compared with the model group (P < 0.01). The Bax expression in the herbs-partition moxibustion group was upregulated (P < 0.05).
CONCLUSION: The expression of COX-2, Bax, Bcl-2 and the content of PGE2 can be regulated by moxibustion therapy. The effect of herbs-partition moxibustion is superior to mild moxibustion.

Cui YH, Zhou S, Wu HG, Wang XM, Tan LY, Liu HR. Regulatory effect of herbs-partition moxibustion on cycloxygenase and prostaglandin E2 in ulcerative colitis rats at apoptosis directions.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008; 12(24):4680-4684(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-24/24k-4680(ps).pdf]

摘要
背景：研究证实，艾灸有可能通过细胞因子调节环氧合酶2及前列腺素E2表达、影响细胞凋亡。
目的：实验拟观察环氧合酶2、Bcl-2、Bax的表达及前列腺素E2的含量与溃疡性结肠炎的关系，探讨灸疗的影响作用并比较隔药灸和温和灸治疗作用的差异。
设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2006-04/2007-03在上海中医药大学实验动物中心和国家中医药管理局针灸免疫实验室完成。
材料：SPF级雄性SD大鼠40只，体质量(140±20)g，采用免疫学方法加局部刺激制备溃疡性结肠炎大鼠模型。
方法：40只大鼠随机数字表法分为正常组、模型组、隔药灸组、温和灸组，每组10只。正常组：不做任何治疗。模型组：只作与各治疗组相同的抓取固定。温和灸组：选取天枢、气海穴悬灸，每次每穴灸10 min。隔药灸组：选取天枢、气海穴隔药灸，每次每穴灸2壮。疗程：1次/d，共灸14次。
主要观察指标：免疫组织化学法检测溃疡性结肠炎大鼠结肠组织中环氧合酶2、Bcl-2、Bax的表达；放射免疫法测定溃疡性结肠炎大鼠结肠组织中前列腺素E2的含量。
结果：纳入SD大鼠40只，造模过程有1只大鼠死亡，解剖见结肠明显扩张，未见穿孔，39只进入结果分析。模型组大鼠结肠组织环氧合酶2、Bcl-2的表达及前列腺素E2的含量高于正常组(P < 0.01)；而Bax的表达低于正常大鼠(P < 0.01)。经过灸治后，与模型组比较，隔药灸组和温和灸组环氧合酶2、Bcl-2的表达及前列腺素E2的含量均显著降低(P < 0.01)；隔药灸组Bax的表达上调(P < 0.05)。
结论：灸疗干预可调节溃疡性结肠炎大鼠结肠组织环氧合酶2、Bax、Bcl-2的表达并降低前列腺素E2的含量，隔药灸的作用优于温和灸。
关键词：隔药灸；溃疡性结肠炎；环氧合酶2；前列腺素E2；细胞凋亡

崔云华，周爽，吴焕淦，王晓梅，谭琳蓥，刘慧荣. 从细胞凋亡角度验证隔药灸对溃疡性结肠炎大鼠环氧合酶2及前列腺素E2的调节作用[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(24):4680-4684
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-24/24k-4680(ps).pdf]

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0 引言

溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis，UC)，又称非特异性溃疡性结肠炎，是一种是以腹痛、腹泻、黏液脓血便以及里急后重为主要症状，以直肠、乙状结肠黏膜慢性炎症和溃疡形成为主要病理特点的、原因不明的结肠黏膜和黏膜下层的慢性炎症。本课题组近年来运用隔药灸治疗溃疡性结肠炎取得了较为满意的临床疗效，在既往的研究中，已从多角度探讨过其作用机制，证实了针灸通过调整紊乱的免疫功能，尤其是细胞因子的表达起到治疗作用[1-7]。鉴于细胞因子(如白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α等)在诱生型环氧合酶2的产生过程中起重要作用，艾灸有可能通过抑制环氧合酶2(cyclooxygenase2，COX-2)、Bcl-2的表达和前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)的含量起到治疗作用，因此本文建立溃疡性结肠炎大鼠模型，从结肠黏膜环氧合酶2、Bcl-2(B cell leukemia/lymphoma-2)、Bax的表达及前列腺素E2的含量角度探讨隔药灸治疗溃疡性结肠炎的作用机制。

1 材料和方法

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：实验于2006-04/2007-03在上海中医药大学实验动物室和国家中医药管理局针灸免疫三级实验室完成。
材料： SPF级雄性SD大鼠40只，体质量(140±20) g，由上海中医药大学实验动物中心提供(许可证号：SK(沪)2003-0002)。所有动物饲养于上海中医药大学实验动物中心动物室，室温(23±10)℃，适应性喂养1周，无不良反应，饮食、饮水正常者，即纳入实验。
主要试剂及仪器：兔抗大鼠环氧合酶2单克隆抗体、兔抗大鼠Bcl-2单克隆抗体、兔抗大鼠Bax单克隆抗体、羊抗兔SABC试剂盒、DAB显色试剂盒(均为Boster，Wuhan公司提供)；前列腺素E2 RIA Kit(苏州医学院提供)。石蜡切片机(AO 820 rotary microtome)；Olympus BH2生物显微镜、Panasonic摄像机(Japan)；IMS细胞图像分析系统(上海申腾信息技术有限公司)；PT 1200细胞超声破碎仪(Switzerland)；AEL-200精密电子天平(Shimadaz，Japan)；低温高速离心机(Heraeus，Germany)；SH-682γ放射免疫计数器(原子核所)；可调移液器 [1 000，200，40，10 μL，Finnpiprettes (Labsystems)]、1.5 mL 离心管及0.5 mL 薄壁PCR管(USA)；J-30I高速冷冻离心机、Φ320 pH Meter(Beckman，USA)。
方法：
实验分组：40只大鼠随机数字表法分为正常组、模型组、隔药灸组、温和灸组，每组10只。
模型制备：参照《药理实验方法学》[8]，采用免疫学方法，并加局部刺激制备溃疡性结肠炎大鼠模型。即采用人体术后的新鲜结肠粘膜，加适量生理盐水制成粘膜匀浆，冷冻24 h，溶冻后以3 000 r/min 离心30 min，取上清液提纯测定蛋白质含量，并与Freund佐剂混合配成乳剂。除正常组外其他各组大鼠首次每只足趾内注射抗原3 mg，并在10，17，24，31 d 分别于足趾、背部、腹股沟、腹腔内注射抗原6 mg(末次注射不加Freund佐剂)，至血清抗结肠抗体达到一定效价，对造模大鼠用 20 g/L 戊巴比妥钠30 mg/kg 行腹腔内注射麻醉，用体积分数为0.03的甲醛2 mL 灌肠，留置1 h，以生理盐水洗净后排出，再用抗原液(10 g/L 不加佐剂)2 mL 灌肠，留置2 h，洗净排去。正常组大鼠用生理盐水作与造模各组相同处理。
干预方法：①用材：特制细艾条。②药饼灸组成：附子(四川)、肉桂(广西)等辗成极细粉，过100目筛，加黄酒拌成厚糊状，用自制相同规格的药饼模具制成直径0.5 cm，厚0.3 cm 大小的药饼备用。③选穴：参照林文注主编的《实验针灸学》定位，取天枢穴(双)、气海穴。天枢定位相当于脐中旁开0.5 cm 左右，气海定位脐下1.0 cm 处。④治疗方法：正常组：不做任何治疗。模型组：只作与各治疗组相同的抓取固定，而不做任何治疗。温和灸组：每穴悬灸，每次每穴灸10 min。隔药灸组：每穴隔药灸2壮。疗程：1次/d，共灸14次。
样本制备：于治疗结束后次日麻醉并断头处死各组大鼠，剖开腹腔，切取远端结肠，用预冷的4 ℃ 生理盐水漂洗，滤纸吸干，称取200 mg 左右，置于冰浴中盛有生理盐水的匀浆器中，进行组织粉碎匀浆后，37 ℃ 温育15 min，3 500 r/min 离心15 min，将上清液移入EP管，-20 ℃ 保存备测前列腺素E2。另取3.0~4.0 cm 置体积分数为0.1的甲醛中固定，用于环氧合酶2、Bcl-2、Bax免疫组织化学检测。
观察指标与测定方法：
环氧合酶2、Bcl-2、Bax表达的测定：按免疫组织化学染色SABC法常规步骤操作，具体如下：标本石蜡包埋、切片5 μm 厚。常规脱蜡至水。玻片预先经多聚赖氨酸处理。将标本片置入体积分数为0.03的H2O2中，室温10 min，以灭活内源性过氧化物酶。双蒸水洗，2 min×3次。滴加复合消化液，室温10 min。双蒸水洗，2 min×3次。滴加抗原修复液，室温10 min。双蒸水洗，2 min×3次。滴加正常山羊血清，室温10 min。吸干液体，不洗。滴加一抗(兔抗大鼠，工作浓度1∶150)。置4 ℃，48 h。0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液洗，3 min×3次。滴加生物素化山羊抗兔IgG，置37 ℃ 30 min。0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液洗，3 min×3次。滴加SABC，置37 ℃ 30 min。0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液洗，3 min×3次。DAB显色。苏木精轻度复染。脱水、透明、封固。同时设阴性替代片作对照：用正常山羊血清代替一抗。阳性染色呈棕黄色，阴性对照片无阳性染色。每张切片随机采集3个不同视野，运用IMS细胞图像分析系统检测阳性表达面积与强度，取平均值进行分析。并通过阳性表达面积×强度计算IHC阳性指数。
前列腺素E2含量测定：前列腺素E2含量测定用放射免疫法，具体操作依据试剂盒说明书进行。
主要观察指标：①大鼠一般情况及结肠病理观察。②环氧合酶2、Bcl-2、Bax表达。③前列腺素E2含量。
设计、实施、评估者：实验设计为第一作者，干预实施为第一、二、三、四、五作者，评估为第六作者。均受过相应培训和学习。
统计学分析：由第一作者采用SPSS 11.0软件完成统计处理，实验数据以x(_)±s表示，组间比较采用F、q检验。

2 结果

2.1 实验动物数量分析 纳入SD大鼠40只，实验过程中，模型组有1只大鼠死亡，解剖见结肠明显扩张，但未见穿孔。39只进入结果分析。
2.2 大鼠一般情况观察 正常组大鼠表现为体质量自然增加，反应灵活，活动敏捷，被毛密集而有光泽、紧贴皮肤，鼻、唇湿润清洁，眼睛明亮，大便正常。实验过程中无死亡。模型组大鼠相继出现卷缩、扎堆、懒动，皮毛松乱不洁，毛色由洁白变为淡黄，无光泽，蓬松且易脱落，摄食减少，腹泻(表现为黄色稀便和/或肛周皮毛被稀便沾染)，部分有粘液血便，体质量增长缓慢。隔药灸、温和灸治疗后，大鼠的精神、饮食、皮毛、反应能力、活动能力、腹泻等症状有不同程度的改善。大鼠体质量均较模型组明显增加。
2.3 大鼠结肠病理观察 正常组大鼠无明显炎性细胞浸润，黏膜上皮完整、连续，腺体排列规则，结构清楚，黏膜下固有层与肌层无异常。模型组大鼠结肠黏膜糜烂、溃疡，部分黏膜缺损，有的形成深大溃疡，黏膜腺体排列紊乱，大小不规则，炎性细胞浸润累及肠壁全层，主要表现为淋巴细胞、中性粒细胞浸润及少量嗜酸性粒细胞。另可见增生的纤维母细胞。部分样本出现黏膜腺体异型增生，上皮细胞核分裂相增多。隔药灸、温和灸治疗后，结肠壁各层结构明显改善，结肠腺体排列较模型组规则，虽然仍可见黏膜下充血、水肿和炎性浸润，但较模型组减轻。肠壁溃疡处为增生的肉芽组织替代，溃疡表面出现单层柱状上皮增生覆盖，温和灸组结肠溃疡面尚未完全愈合，隔药灸组溃疡面已经基本愈合。
2.4 不同灸法对溃疡性结肠炎大鼠结肠环氧合酶2表达的影响 见表1，图1。

模型组大鼠结肠环氧合酶2的表达在阳性面积、强度以及免疫组织化学指数3方面与正常组相比，差异均有显著性意义(P < 0.01)；经不同灸法治疗后，环氧合酶2表达的阳性面积、强度，以及免疫组织化学指数显著下调，与模型组相比，差异显著(P < 0.01)；其中隔药灸组调节作用优于温和灸组(P < 0.01)。
2.5 不同灸法对溃疡性结肠炎大鼠结肠前列腺素E2含量的影响 见表2。

模型组大鼠结肠前列腺素E2含量与正常组比较显著上调(P < 0.01)；经不同灸法治疗后，前列腺素E2含量显著下调，与模型组相比，差异显著(P < 0.05，P < 0.01)。
2.6 不同灸法对溃疡性结肠炎大鼠结肠Bcl-2表达的影响 见表3，图2。

模型组大鼠结肠中Bcl-2的表达在阳性面积、强度、IHC指数3方面均显著上调，与正常组相比，差异具有显著性意义(P < 0.01)；灸疗后大鼠结肠中Bcl-2的表达明显下调，与模型组相比，差异具有显著性意义(P < 0.01)；隔药灸组与温和灸组相比，差异亦具有显著性(P < 0.05)。
2.7 不同灸法对溃疡性结肠炎大鼠结肠Bax表达的影响 见表4，图3。

模型组大鼠结肠中Bax的表达在阳性面积、强度、IHC指数3方面均显著下调，与正常组相比，差异具有显著性意义(P < 0.01)；隔药灸组对Bax表达的影响在IHC指数方面与模型组相比，差异显著(P < 0.05)。

3 讨论

中医认为溃疡性结肠炎是因脾胃虚寒，痰湿内阻，气滞血瘀所致，治疗以温养脾肾，除湿化痰，理气活血为法。天枢为足阳明胃经穴、大肠之募穴，灸之能健脾通腹、运肠利湿。气海属任脉经穴，足三阴经之交会处，灸之具有条畅气机、行气活血、健身强体之功效。故本法选用此二穴。附子具有回阳救逆，助阳补火，散寒止痛之功。肉桂辛温味甘，具有补火助阳，散寒止痛，温经通脉之功。所以，桂附相配，制成药饼，灸药同用，以增强温肾健脾，除湿化痰，散寒止痛，理气活血之功理气活血。
环氧合酶是一种完整的膜结合蛋白，是分解花生四烯酸生成各种内源性前列腺素过程中重要的限速酶。环氧合酶有两种亚型，其中环氧合酶2在正常情况下水平很低，但作为可诱导酶，在炎性刺激或细胞因子的诱导下，于炎症组织中有高表达，在溃疡性结肠炎的发生及其诱发癌变的病理过程中起着关键作用[9-11]。前列腺素E是体内花生四烯酸转化生成的生物活性物质之一，广泛存在于机体各组织器官内，在维护细胞自稳及增殖方面有着重要意义。前列腺素E2是一重要的免疫调节因子。丰富的底物花生四烯酸以及环氧合酶2高表达导致大肠癌组织超量分泌前列腺素E2，前列腺素E2通过抑制白细胞介素2分泌及淋巴细胞膜表面铁蛋白受体的表达而抑制大肠癌患者的细胞免疫功能[12]。近年来，诸多研究[10，13-14]显示抑制环氧合酶2及前列腺素E2可对抗或预防其诱发癌变的作用，如环氧合酶2与大肠炎相关腺瘤发生关系密切，由于抑制环氧合酶2进而抑制了环氧合酶2介导的增殖、逆转了Bcl-2的抑制凋亡，而产生抵抗促瘤因素的作用[15]。
UC的表现在于结肠上皮表浅广泛的缺失和固有层的炎症改变，关于UC结肠上皮层破坏的机制目前虽不完全清楚，但一般认为UC的发生与上皮细胞破坏和凋亡有着密切关系[16-17]。肿瘤的发生不仅与细胞过度增殖相关，也与细胞凋亡减少有关。在细胞凋亡过程中有多种癌基因和胞内信使参与调节，Bcl-2基因族所起的作用愈来愈受到重视。Bcl-2基因是一种广泛性的抗凋亡基因，可抑制许多因素引起的细胞凋亡，导致各种癌症的发生。Bcl-2蛋白本身活性证明是由一个与Bcl-2相关蛋白Bax来调节。Bax基因的作用与Bcl-2相反，起到促进细胞凋亡的作用。其主要机制是诱导细胞色素C从线粒体释放至细胞浆，与Apaf-1结合，然后再激活caspases，导致细胞凋亡。在此过程中，Bcl-2/Bax两蛋白之间的比例是细胞凋亡发生与否的关键因素[18-19]。
以往的研究证明隔药灸能够调节UC紊乱的免疫功能，减少炎性细胞的浸润，促进溃疡的愈合[20-21]。从实验结果来看，模型大鼠结肠组织环氧合酶2、Bcl-2的表达和前列腺素E2的含量显著高于正常组(P < 0.01)，而Bax的表达显著低于正常组(P < 0.01)。表明UC大鼠环氧合酶2、Bcl-2的表达增强、前列腺素E2含量增加，提示环氧合酶2、Bcl-2的表达和前列腺素E2的含量变化与大鼠UC的发生有密切关系。经过灸疗后，与模型组比较各治疗组环氧合酶2、Bcl-2的表达和前列腺素E2的含量均显著降低(P < 0.01)，隔药灸Bax的表达上调，结肠黏膜溃疡面损伤修复，表明艾灸取效与其调节结肠组织环氧合酶2、Bax、Bcl-2的表达和降低前列腺素E2的含量有关。治疗后改变了Bcl-2/Bax的比例关系，使细胞凋亡趋于正常而达到治疗UC并预防癌变的目的。另一方面，本实验也说明隔药灸对UC的治疗作用较温和灸好，这可能是灸疗与药物的功效发挥了协同作用。

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