Chitosan scaffold combined with recombinant human osteogenic protein-1 promotes proteoglycan synthesis of rabbit anulus fibrosus and nucleus pulposus cells
Tian Hai-quan1, Li Fang2, Ma Zhou-yong2, Chen Xiao-bin2, Wang Xiao-wei1

Abstract
BACKGROUND: Osteogenic protein-1 (OP-1) can effectively stimulate the proteoglycan and collagen synthesis by articular chondrocytes, and a single injection of OP-1 into intervertebral disc has been proved to raise the disc height in animal models.
OBJECTIVE: To in vitro determine the effect of recombinant human OP-1 (rhOP-1) on stimulating the cell proliferation and proteoglycan metabolism of rabbit intervertebral disc cells cultured in chitosan-gel.
DESIGN, TIME AND SETTING: The experiments at grouping design were carried out at the Orthopaedic Laboratory in General Hospital of Beijing Military Area Command of Chinese PLA (Beijing, China) from August 2007 to February 2008.
MATERIALS: Five Japanese rabbits of clean grade and four months old, were adopted in this study. The rhOP-1 was a product of Sigma Company (USA) in divided package. Medical chitosan, deacetylation degree 95.11%, viscosity mPa?s, Mr=870 000, was offered by Beijing Transglobal Biomedical Technology Co,. Ltd (China).
METHODS: Ten rabbit intervertebral discs were harvested, then nucleus pulposus and anulus fibrosus cells were isolated from the discs and inoculated on the self-made chitosan-gel scaffold. Culture solution was divided into three groups: control group without rhOP-1, 100 μg/L rhOP-1 group and 200 μg/L rhOP-1 group.
MAIN OUTCOME MEASURES: The synthesis and accumulation of proteoglycans (35SO42- intake and sulfate glycosaminoglycan content) and the DNA content were biochemically assessed at days 7, 14 and 21 of the culture.
RESULTS: The DNA content was unchanged in two rhOP-1 groups, while that in the control group was reduced. Treatment with rhOP-1, compared with the control condition, significantly upregulated proteoglycan synthesis and accumulation in all cases tested. A longer exposure over 14 days to rhOP-1 resulted in a pronounced response and there were significant differences between day 14 and day 21 (P < 0.001).
CONCLUSION: The rhOP-1 is effective to promote the cell proliferation and proteoglycan synthesis of rabbit anulus fibrosus and nucleus pulposus in vitro.

Tian HQ, Li F, Ma ZY, Chen XB, Wang XW.Chitosan scaffold combined with recombinant human osteogenic protein-1 promotes proteoglycan synthesis of rabbit anulus fibrosus and nucleus pulposus cells.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(27):5209-5213 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-27/27k-5209(ps).pdf]

摘要
背景：成骨蛋白1有效刺激软骨细胞蛋白聚糖和胶原蛋白合成已被证实，椎间盘内注射成骨蛋白1可增加椎间盘高度也在动物模型中得到证实。
目的：体外评价重组人成骨蛋白1对培养于壳聚糖凝胶中的兔椎间盘细胞增殖和蛋白聚糖合成的作用。
设计、时间及地点：成组设计，实验于2007-08/2008-02在北京军区总医院骨科实验室完成。
材料：清洁级4月龄日本大耳兔5只。重组人成骨蛋白1为Sigma分装。医用级壳聚糖，脱乙酰度95.11%,黏度155 mPa?s, Mr 870 000,由北京纵横洋洲医药生物科技有限公司提供。
方法：无菌条件下取日本大耳兔椎间盘10个，分离其髓核和纤维环细胞并接种于自制壳聚糖凝胶支架，在培养液中加入重组人成骨蛋白1，并分为3组：对照组（无重组人成骨蛋白1）、100 μg/L重组人成骨蛋白1组、200 μg/L重组人成骨蛋白1组。
主要观察指标：培养7，14，21 d时对培养物DNA含量、蛋白聚糖合成量（35SO42-摄入量、硫酸盐黏多糖含量）进行检测。
结果：100，200 μg/L重组人成骨蛋白1组的DNA含量没有减少，对照组DNA含量逐渐下降。100，200 μg/L重组人成骨蛋白1组蛋白聚糖合成量明显高于对照组，200 μg/L重组人成骨蛋白1组升高更为显著。100，200 μg/L重组人成骨蛋白1组在3个时间点均呈现上升趋势，培养14 d和21 d的差异有显著性意义(P < 0.001)。
结论：重组人成骨蛋白1可有效促进体外培养的兔髓核和纤维环细胞增殖及蛋白聚糖合成。
关键词：髓核细胞；纤维环细胞；成骨蛋白1；壳聚糖；蛋白聚糖；生物材料

田海泉，李放，马舟涌，陈晓斌，王晓伟.壳聚糖支架复合重组人成骨蛋白1对体外培养兔髓核和纤维环细胞蛋白聚糖合成的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(27):5209-5213
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-27/27k-5209(ps).pdf]

>>本文导读<<

偏倚或不足：①实验所用细胞是健康的兔椎间盘细胞，是否退行性变或老化的椎间盘细胞也会对重组人成骨蛋白1产生类似反应尚需在椎间盘退行性变动物模型中进一步研究。②实验所培养的髓核和纤维环细胞取材于2月龄的实验动物，有局限性，尚不能说明是否不同年龄的动物的椎间盘细胞也会在重组人成骨蛋白1作用下发生相同或类似的改变。

临床应用性：组织工程学方法被认为是逆转或改善椎间盘退行性变的一种非常有前景的方法。本实验运用组织工程学方法，证实了体外培养于壳聚糖凝胶材料的兔纤维环和髓核细胞在重组人成骨蛋白1的刺激下可以合成更多的细胞外基质，从而有利于网络更多的椎间盘细胞，且凝胶材料更有利于植入体内。

重要的概念：可注射壳聚糖凝胶支架是组织工程材料的一种，在室温下是液态，可负载活性细胞和治疗药物，当注射到指定位置后，在体温、pH值、离子浓度或其他条件作用下，在注射位置发生相转变形成凝胶支架。

0 引言

临床上常见的椎间盘突出、椎管狭窄、脊椎退行性滑脱、节段性不稳定等大多属椎间盘的退行性病变。目前对椎间盘退行性变的根本病因尚未完全清楚[1]。但多数学者认为椎间盘退行性变是由机械和生物学共同作用结果。椎间盘正常的生化和力学结构环境发生不当改变时，其基质代谢稳态丧失，导致了椎间盘退行性变[2]。普遍认为髓核是椎间盘结构与功能的核心，髓核含有并能产生大量的蛋白聚糖，从而可以保持水分抵抗压力负荷。退行性变椎间盘一个明确的生化改变就是蛋白聚糖含量逐渐的减少，随后髓核脱水[3-4]。蛋白聚糖对椎间盘力学特性的保持非常重要。退行性变的椎间盘髓核明显较正常髓核中蛋白聚糖含量减少，水分丢失。临床对其处理的方案不外乎保守治疗和外科手术，但目前尚无令人信服的数据证明其远期疗效[5-6]。
近年来研究者越来越倾向于用生物工程学方法修复退行性变椎间盘，如组织工程，细胞移植及基因疗法等[7-8]。体外椎间盘髓核和纤维环组织细胞培养技术的建立，特别是软骨组织工程学研究的不断深入，为退行性变椎间盘的形态结构与生理功能的再生修复带来了契机，可望为阻止或逆转椎间盘退行性变、促进椎间盘组织再生提供一条新的有效方法。可注射壳聚糖凝胶支架材料是组织工程材料的一种，在室温下是液态，可负载活性细胞和治疗药物，当注射到指定位置后，在体温、pH值、离子浓度或其他条件作用下，在注射位置发生相转变形成凝胶支架。
生长因子是具有诱导和刺激细胞增殖、维持细胞活性等生物效应的蛋白类物质，其对促进细胞增殖、组织或器官的修复和再生都具有重要的促进作用，是组织工程的重要影响因素之一。体外体内研究表明生长因子能够恢复退行性变椎间盘的结构和生物力学特性[9]。成骨蛋白1属于转化生长因子β超家族的一员，在骨骼发生发育和成骨、成软骨分化过程中发挥着重要作用[10-11]。成骨蛋白1可以促进软骨细胞Ⅱ、Ⅵ型胶原，聚集蛋白聚糖等的合成，成骨蛋白1可以促进软骨细胞产生正常的，有功能的蛋白聚糖[12]。本实验运用组织工程学方法协同重组人成骨蛋白1培养兔椎间盘细胞，评价重组人成骨蛋白1促进椎间盘细胞增殖和细胞外基质合成的作用。

1 材料和方法

设计：成组设计。
时间及地点：实验于2007-08/2008-02在北京军区总医院骨科实验室完成。
材料：清洁级4月龄日本大耳兔5只，雌雄不限，体质量2.5~3.0 kg，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供（SCXK（京）2006-0006）。壳聚糖，脱乙酰度95.11%,黏度 155 mPa?s，Mr 870 000,医用级，北京纵横洋洲医药生物科技有限公司提供。

实验过程：
壳聚糖支架制备方法：5 g壳聚糖溶解于0.1 mol/L稀盐酸250 mL,混匀,使壳聚糖溶液溶度为2％，121 ℃消毒20 min; 10 g β-磷酸甘油,以125 mL去离子水溶解,使溶度为8％，过滤除菌。按照1∶1比混合配制复合溶液,调整混合液的pH值，37 ℃条件下的凝固，以凝胶在容器内倒置90°不流动、不变形为凝胶形成的标准。
组织制备和细胞在壳聚糖支架中的培养：取2月龄日本大耳兔椎间盘，分离髓核与纤维环，依次用0.025%胶原酶和0.004% DNAase Ⅱ消化过夜，过滤，加入新鲜含10％胎牛血清的DMEM培养液，置于37 ℃，体积分数为0.05的CO2，饱和湿度的培养箱中培养，72 h后以 1.0×109 L-1密度重新悬浮于上述溶液中，培养液中加入25 μg/L维生素C和50 μg/L庆大霉素。7 d后首次换液，细胞长满90％时常规方法消化传代。传代时在培养液中加入重组人成骨蛋白1，并分为3组，对照组（无重组人成骨蛋白1），100 μg/L重组人成骨蛋白1组，200 μg/L重组人成骨蛋白1组。以后分别在7，14，21 d时检测细胞中的DNA含量和蛋白聚糖合成量。
DNA含量检测：3 mol/L盐酸胍/0.05 mol/L Tris-HCl提取总DNA，10 g/L胃蛋白酶消化。PicoGreen细胞繁殖定量检测试剂盒按说明步骤检测总DNA含量，小牛胸腺DNA作为标准对照。即100 μL PicoGreen 与100 μL稀释了的样品混合后加入到96孔板中，酶标仪测读，滤波器激发波长480 nm，散发波长530 nm，闪烁次数10，间隔时间0.5 s。
35SO42-摄入量测定：培养液中加入Na235SO4,使其含量为1 850 MBq/L,继续培养1 d后，木瓜蛋白酶消化，磷酸盐缓冲液洗涤，加入1 mL甲醇固定30 min，移出甲醇，空气中干燥，细胞固定后，培养瓶在4 ℃条件下储存 48 h。将培养瓶冰浴，用冷的10％ TCA洗涤细胞3次，每次5 min，空气中晾干。每瓶中加入浓度为1 mol/L的NaOH 1 mL，室温下放置1 h，再在培养瓶中加入浓度为1 mol/L的HCl 1 mL，在60 ℃放置2 h。将培养瓶中的悬液移入闪烁瓶中，并用闪烁液冲洗培养瓶使细胞成分完全进入闪烁瓶中。闪烁瓶中加入闪烁液，使其总量在10 mL。将闪烁瓶放入液体闪烁计数仪中测定每分钟脉冲数(cpm)。
硫酸盐黏多糖含量测定：阿利辛蓝法测硫酸盐黏多糖含量，按试剂盒说明步骤操作，将培养物加入1 mL裂解液研磨至糜状，-60 ℃冻干，冻干产物用磷酸盐缓冲液溶解。50 μL标本溶液与8 mol/L盐酸胍50 μL混匀，静置15 min。依次加入50 μL溶液1振荡混匀，室温下15 min，750 μL溶液2，振荡混匀，4 ℃过夜。12 000 r/min离心15 min，弃上清。加500 μL二甲基亚砜洗液（40%二甲基亚砜+0.05 mol/L MgCl2）室温下振荡30 min, 12 000 r/min离心15 min，弃上清。加入100 μL溶解液（4.0 mol/L盐酸胍＋33%异丙醇）重新溶解到阿利辛蓝-蛋白聚糖沉淀复合物，吹打均匀。溶解后的液体转移到96孔板中，每孔细胞密度为1.0×106/孔。酶标仪600 nm波长处测定吸光度值。将硫酸软骨素贮液（0.5 g/L）梯度稀释至1，2，10，20，30，40 g/L，按上述处理标本溶液同样方法测定其吸光度值，绘制硫酸软骨素吸光度值标准曲线。根据标准曲线及标本的吸光度值测算处标本中蛋白聚糖的实际含量。
主要观察指标：DNA含量，35SO42-摄入量，硫酸盐黏多糖含量。
设计、实施、评估者：实验设计、实施均为第一作者，评估为第一、二、三作者，采用盲法评估。
统计学分析：由第一作者采用SAS 9.1统计软件进行数据处理，数据以x(_)±s表示，采用单因素方差分析（one-way ANOVA），P < 0.05表示差异有显著性意义。

2 结果

2.1 各组细胞中DNA含量检测结果 见表1。

表1结果表明，各组的DNA含量差异均有显著性意义(P < 0.05)。
对照组随培养时间增加而DNA含量减少(其中髓核细胞在7 d与14 d比较差别较显著，后者DNA含量明显下降P < 0.001，纤维环细胞培养在21 d时间点的DNA含量较7，14 d下降显著，P < 0.01)。
200μg/L重组人成骨蛋白1组对DNA含量增加明显（P < 0.05），其中髓核细胞培养在14 d时200 μg/L重组人成骨蛋白1组比对照组DNA含量显著升高(P < 0.05)。
21 d时100 μg/L重组人成骨蛋白1组和200 μg/L重组人成骨蛋白1组均较对照组DNA含量高，且200 μg/L重组人成骨蛋白1组增加更显著（P < 0.01）。
纤维环细胞培养则是在培养21 d时100 μg/L重组人成骨蛋白1组和200 μg/L重组人成骨蛋白1组均较对照组DNA含量高(P < 0.05)，其中200 μg/L重组人成骨蛋白1组增加更显著（P < 0.01）。
2.2 各组髓核细胞和纤维环细胞35SO42-摄入量比较 见表2。

表2结果表明，各组髓核细胞和纤维环细胞35SO42- 摄入量均随培养时间延长而增加(P < 0.01)。

200 μg/L重组人成骨蛋白1组髓核细胞培养14，21 d 35SO42- 摄入量明显高于对照组和100 μg/L重组人成骨蛋白1组，差异有显著性意义(P < <0.001)。
100 μg/L重组人成骨蛋白1组和200 μg/L重组人成骨蛋白1组纤维环细胞培养14，21 d 35SO42- 摄入量明显高于培养7 d，差异有显著性意义(P < 0.01)。
100 μg/L重组人成骨蛋白1组和200 μg/L重组人成骨蛋白1组纤维环细胞培养各时间点35SO42- 摄入量明显高于对照组，差异有显著性意义(P < 0.001)。
100 μg/L重组人成骨蛋白1组和200 μg/L重组人成骨蛋白1组纤维环细胞培养14，21 d比较，差异无显著性意义（P > 0.05）。

2.3 各组髓核细胞和纤维环细胞硫酸盐黏多糖含量比较 见图1。

图1结果表明，培养时间和重组人成骨蛋白1对材料中的两种细胞均有较大影响(P < 0.001)。
对照组髓核细胞和纤维环细胞硫酸盐黏多糖含量随培养时间增长有所增加(P < 0.05)。
100 μg/L重组人成骨蛋白1组和200 μg/L重组人成骨蛋白1组髓核细胞和纤维环细胞硫酸盐黏多糖含量随培养时间增加，尤其在培养14 d和21 d时明显增加(P < 0.001)，与对照组比较差异有显著性意义(P < 0.0001)。
200 μg/L重组人成骨蛋白1组髓核细胞和纤维环细胞硫酸盐黏多糖含量较100 μg/L重组人成骨蛋白1组高(P < 0.01)。

3 讨论

用于制备组织工程化椎间盘的支架材料主要有胶原海绵、胶原-透明质酸盐复合物及海藻酸盐凝胶、其他一些人工合成材料等。直接注射交联的多聚物也被用于网罗细胞，如壳聚糖凝胶。细胞分散于凝胶中能够很好的保持它们的三维形状，而且由于脊柱的特殊解剖结构，凝胶会更有利于实际操作。从这点上说，壳聚糖支架可能是一种较好的传送载体，而且还有类似于透明质
酸盐的结构，后者是髓核中主要的聚糖之一。壳聚糖是可以体内降解的多糖类天然生物材料，是惟一带正电荷的碱性多糖，其结构类似于糖胺聚糖。壳聚糖凝胶的阳离子特性使其容易捕获软骨或椎间盘细胞产生的高价阴离子蛋白聚糖，从而有利于细胞外基质功能的维持。
本实验从DNA含量检测数据分析，重组人成骨蛋白1促进了椎间盘细胞增殖，阻止了细胞减少，尤其在200 μg/L重组人成骨蛋白1组。细胞的减少也是椎间盘退行性变或老化的一个特征，由此推测重组人成骨蛋白1可能会改善退行性变椎间盘细胞减少的状况。对细胞外基质的促进作用则明显增强了蛋白聚糖含量。不论髓核细胞还是纤维环细胞，在重组人成骨蛋白1均能显著增加蛋白聚糖含量，较对照组有较大差异，随培养时间延长，蛋白聚糖合成也在增加。明确提示重组人成骨蛋白1会有助于细胞外基质的合成，可能有利于修复退行性变或损伤的椎间盘。本实验中200 μg/L重组人成骨蛋白1组作用尤其显著。实验所培养的髓核和纤维环细胞取材于2月龄的实验动物，有局限性，尚不能说明是否不同年龄的动物的椎间盘细胞也会在重组人成骨蛋白1作用下发生相同或类似的改变。成骨蛋白1由于其在诱导软骨基质合成和促进软骨修复方面的巨大潜力，将其应用于椎间盘修复可能是有效的。有研究指出，骨形态发生蛋白与支架材料复合后可以发挥更有效的作用[13]。而且成骨蛋白1可以调节其他生长因子的表达[14]。文献报道成骨蛋白1刺激产生蛋白聚糖的能力强于骨形态发生蛋白2, 4, 6[15]。
将生长因子注入退行性变椎间盘的研究显示了成骨蛋白1不仅可使退行性变椎间盘高度增加而且还可以增加正常椎间盘的高度[16-18]。有研究者认为成骨蛋白1改善了退行性变椎间盘组织的生物力学黏弹特性，从而使其恢复高度，并认为这种结果得益于成骨蛋白1的存在使椎间盘组织合成代谢加强导致的生化改变[19]。
本实验结果显示兔椎间盘细胞对重组人成骨蛋白1的反应是比较敏感的，重组人成骨蛋白1可以促进细胞增殖，显著促进蛋白聚糖的合成聚集，从而在修复退行性变椎间盘过程中发挥重要作用。
鉴于不同的实验研究中培养条件的多样化，所以很难比较重组人成骨蛋白1与其他生长因子谁更有潜力作为改善椎间盘退行性变状况的因子，可能将它们联合会产生更好的效果[2,20]。病理情况下，椎间盘中央部位呈更加酸性的环境[21]，进一步的研究还要在模拟病理情况下椎间盘细胞的环境中进行。

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