Efficacy of heterogenic deproteinized cancellous bone combined with bone morphogenetic protein and fibrin in repairing rabbit radial defects
Zhang Xu-yuan1, Liu Xing-yan2, Ge Bao-feng2, Chen Ke-ming2, Deng Gang1, Bai Meng-hai2

Abstract
BACKGROUND: Heterogenic deproteinized cancellous bones possess good biomechanical property and provide temporal mechanical supports for the weight-bearing tissues.
OBJECTIVE: To study the effect of the composite combining heterogenic deproteinized cancellous bone with bone morphogenetic protein (BMP) and fibrin to repair segmental bone defects.
DESIGN, TIME AND SETTING: The animal experiment of randomization design was performed at War Wounds and Bone Disease Key Laboratory of Chinese PLA at High Altitude from October 2006 to October 2007.
MATERIALS: Bone and periosteum defects were created in the bilateral radius of 45 New Zealand rabbits. Heterogenic deproteinized cancellous bones, obtained from fresh vertebrae of sheep, were prepared into cancellous bone particles which were 0.5 cm × 0.5 cm × 0.5 cm in size and processed into cleaning, defatting, part decalcification and deproteinization. BMP was extract from fresh cortical bone of calf. Fibrin was extract from the blood of allogeneic rabbits.
METHODS: Forty-five rabbits were randomly divided into three groups (n=15): composite group implanted with the complex of heterogenic deproteinized cancellous bone/BMP/fibrin, heterogenic deproteinized cancellous bone group implanted with heterogenic deproteinized cancellous bone, and control group implanted with nothing.
MAIN OUTCOME MEASURES: The healing of bone defects was detected through gross observation, radiology and histology at 2, 4, 8, 12, 16 weeks after operation. New bone quantitative analysis was conducted according to the ratio of new bone formation area to the total area of vision.
RESULTS: At 16 weeks after operation, the defects were perfectly healed in the composite group, which was better than heterogenic deproteinized cancellous bone and control group with regard to the levels of bone formation, quantity of bone regeneration and reconstruction of marrow cavity. The bone union emerged in the heterogenic deproteinized cancellous bone group. However, its marrow cavity was not recanalized. No osseous tissue healing was observed in the control group.
CONCLUSION: The composites of heterogenic deproteinized cancellous bone/BMP/fibrin can be effective to repair segmental bone defects.

Zhang XY, Liu XY, Ge BF, Chen KM, Deng G, Bai MH.Efficacy of heterogenic deproteinized cancellous bone combined with bone morphogenetic protein and fibrin in repairing rabbit radial defects.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(27):5214-5218 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-27/27k-5214(ps).pdf]

摘要
背景：异种松质骨脱蛋白生物力学性能较好，能够对承载的组织提供暂时的力学支撑。
目的：验证异种脱蛋白松质骨/纤维蛋白/骨形态发生蛋白复合材料修复大段骨缺损的效果。
设计、时间及地点：随机分组设计的动物对照实验，于2006-10/2007-10在解放军高原战创伤与骨病重点实验室完成。
材料：45只新西兰兔制备双侧桡骨中段15 mm的骨和骨膜缺损模型。异种脱蛋白松质骨来源于新鲜绵羊脊柱骨，制成直径约0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小松质骨颗粒, 经清洗、脱脂、部分脱钙、脱蛋白等处理。骨形态发生蛋白从小牛新鲜皮质骨中提取。纤维蛋白原由同种异体兔的血液中提取。
方法：45只兔按随机数字表法分为3组，复合材料组、异种脱蛋白松质骨组、空白组，每组15只。复合材料组双侧骨缺损区均植入异种脱蛋白松质骨/骨形态发生蛋白/纤维蛋白复合物，异种脱蛋白松质骨组双侧骨缺损区均植入异种脱蛋白松质骨，空白组不植入任何材料。
主要观察指标：植入后2，4，8，12，16周大体观察，放射学、组织学观察骨缺损愈合情况，按新骨形成面积与视野总面积比值进行新生骨定量分析。
结果：植入后16周，复合材料组骨缺损完全修复，成骨活跃程度、骨再生量和重建髓腔结构等方面均显著优于异种脱蛋白松质骨组和空白组；异种脱蛋白松质骨组, 形成骨性愈合，但无髓腔再通；空白组未愈合。
结论：异种脱蛋白松质/纤维蛋白/骨形态发生蛋白复合物能够有效的修复大段骨缺损。
关键词：异种脱蛋白松质骨；纤维蛋白；骨形态发生蛋白；组织工程；骨缺损；生物材料

张旭元，刘兴炎，葛宝丰，陈克明，邓刚，白孟海.异种脱蛋白松质骨复合纤维蛋白及骨形态发生蛋白修复兔桡骨缺损[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(27):5214-5218 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-27/27k-5214(ps).pdf]

0 引言

创伤、感染及骨肿瘤等原因造成的大范围骨缺损处理起来很棘手。利用组织工程学技术构建的组织工程骨用于骨缺损的修复是近年来研究的一个热点。目前骨移植是修复骨缺损的主要方法。包括人工骨和自然骨移植。目前的人工骨还达不到作为一种良好载体的要求[1]。自然骨中，自体骨、同种异体骨虽然力学性能和生物相容性好，但材料的来源少，且存在法律和伦理方面的种种问题[2]。异种骨来源广泛，价格低廉，作为植骨材料受到高度重视。异种松质骨经降低抗原处理后可以作为一种良好载体[3-6]。但单一异种脱蛋白松质骨成骨活性差。以往的研究表明，纤维蛋白/骨形态发生蛋白复合物显示了在骨缺损修复领域良好的成骨活性。为此，构建异种脱蛋白松质骨/纤维蛋白/骨形态发生蛋白复合物作为修复骨缺损的组织工程骨，用兔桡骨中下段骨缺损模型，评价复合材料修复骨缺损效果。

1 材料和方法

设计：随机分组设计、动物对照实验。
时间及地点：实验于2006-10/2007-10在兰州军区兰州总医院高原战创伤与骨病实验室完成。
材料：清洁级健康成年新西兰兔45只，体质量2.0~3.0 kg，雌雄不限，由兰州生物制品所动物中心提供(许可证号：12-004)。异种脱蛋白松质骨：来源于新鲜绵羊脊柱骨，制成直径约0.5 cm× 0.5 cm×0.5 cm大小松质骨颗粒，经清洗、脱脂、部分脱钙、脱蛋白等处理后转入-80 ℃深低温冰箱冷冻保存。骨形态发生蛋白：从小牛新鲜皮质骨中提取,置4 ℃冰箱保存。纤维蛋白原：自同种异体兔的血液中提取，置4 ℃冰箱保存。

实验过程：
异种脱蛋白松质骨的制备：取绵羊脊柱骨，剔除骨膜和软组织，去除其表面皮质骨，制成直径约0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小松质骨颗粒；用流动自来水反复冲洗骨粒4.0~5.0 h，致无血渍浸出为止；将其放入蒸馏水三角瓶中，摇床上振动4.0~5.0 h，其间每30 min换蒸馏水1次，再将其放入超声波清洗机中反复进行清洗，每次30 min，清洗3~5次；自然晾干后，将其放入甲醇与氯仿（1∶1）混合液中，不时搅拌，12 h更换混合液；倒弃混合液，蒸馏水冲洗骨粒3次，自然晾干。用0.017 mol/L HCl脱钙5 min，蒸馏水冲洗3次，自然晾干；转入30%过氧化氢中，不时搅拌，12 h更换过氧化氢液1次，处理24 h；蒸馏水冲洗3次，自然晾干；转入-80 ℃深低温冰箱冷冻保存。
骨形态发生蛋白及纤维蛋白的提取：骨形态发生蛋白按照Urist等[7]报道的方法从小牛新鲜皮质骨中提取,提取物置4 ℃冰箱保存。纤维蛋白按Durham等[8]报道的方法制备, 纤维蛋白系根据纤维蛋白粘合剂的原理制备,纤维蛋白原用冷沉淀法自同种异体兔的血液中提取。采集15只健康成年新西兰兔的抗凝全血并于 3 000 r/min,离心10 min,分离出血清,置-30 ℃冰箱冻存过夜,次日转入4 ℃冰箱缓慢融解,待彻底融解后,于4 ℃条件下离心,收集冷沉淀。冷沉淀用冷冻干燥机冻成干粉,再用重蒸水溶解,配成120 g/L纤维蛋白原溶液。
异种脱蛋白松质骨/骨形态发生蛋白复合物的制备：将深低温保存的异种脱蛋白松质骨取出，冷冻干燥机干燥，装入培养皿中，10 kGy 60Co辐照（兰州辐照中心），将100 mg提取的小牛骨形态发生蛋白溶于10 mL的4 mol/L盐酸胍溶液中,加入10 g异种松质骨颗粒,4 ℃,充分搅拌混匀液体与固体成分，置冷冻干燥机内抽真空、透析、冻干24 h,分装。
异种脱蛋白松质骨/骨形态发生蛋白/纤维蛋白复合物的制备：将处理好的异种脱蛋白松质骨/骨形态发生蛋白复合物置于圆柱状模具内,浸没于纤维蛋白原中,按纤维蛋白胶的制备比例混入凝血酶,复合支架制备成功。
兔桡骨缺损模型的制备及分组：实验兔用速眠新麻醉后，常规去毛、消毒、铺巾，取前臂纵行切口，长3.0~4.0 cm，行双侧桡骨中段截骨，造成15 mm的骨和骨膜缺损。新西兰兔45只按随机数字表法分为3组，复合材料组、异种脱蛋白松质骨组、空白组，每组15只。复
合材料组双侧骨缺损区均植入异种脱蛋白松质骨/骨形态发生蛋白/纤维蛋白复合物，异种脱蛋白松质骨组双侧骨缺损区均植入异种脱蛋白松质骨，空白组不植入任何材料。创口缝合，肢体不做固定。将其分笼饲养，自由活动。植入后肌注庆大霉素预防感染。分别于植入后2，4，8，12，16周取材，每次3只。
主要观察指标：①大体标本：各组动物于取材当日拍摄大体标本，观察其大体愈合情况。②X射线检查：各组动物于手术当日和取材日拍双侧尺、桡骨正侧位片，观察各组内及组间植入后不同时间的骨缺损愈合情况。③组织学观察：取材标本用10%甲醛溶液固定，常规脱钙、脱水、石蜡包埋、连续切片，行苏木精-伊红染色，光镜下观察骨缺损愈合情况。④新生骨定量分析：在各组每个时间点随机取4张组织学苏木精-伊红染色切片，在显微镜40倍视野下，将图像采集入计算机图像分析系统(CMIAS)中，每张切片观察5个视野，按新骨形成面积与视野总面积比值来进行组织学定量分析。骨愈合X射线片采用Lane-Sandhu[9]法评分标准。
设计、实施、评估者：设计为第一作者，实施为全部作者，评估为第二作者，评估者经过正规培训。
统计学方法：由第一作者采用SPSS 10.0进行数据处理，数据以x(_)±s表示，行配对资料t检验。

2 结果

2.1 实验动物数量分析 纳入兔45只，均进入结果分析，无脱落。
2.2 植入后16周大体标本观察兔桡骨缺损愈合情况 复合材料组 骨缺损已骨性愈合，见图1a；异种脱蛋白松质骨组：骨缺损有少量骨性连接，骨皮质不连续，尚有0.5 cm缺损，见图1b；空白组：骨缺损未愈合，见图1c。

2.3 X射线检查观察兔桡骨缺损愈合情况 复合材料组与异种脱蛋白松质骨组在不同时间点修复兔桡骨缺损影像学评分，见表1。

表1结果表明，异种脱蛋白松质骨/骨形态发生蛋白/纤维蛋白复合物的骨愈合能力明显优于异种脱蛋白松质骨，差异有显著性意义（P < 0.05）。
X射线检查兔桡骨缺损愈合的大体情况：见图2。

复合材料组：
植入后4周，骨缺损两端有少量密度较低的骨痂形成，缺损区呈大片云雾状影，密度低于骨干。
植入后8周，新骨桥连接骨缺损，密度均匀，形成连续性骨痂。
植入后12周，骨皮质已完整形成，髓腔未完全形成。
植入后16周，骨性连接形成，髓腔再通。

异种脱蛋白松质骨组：
植入后4周，缺损区大片云雾状影，密度低于骨干，两断端有骨痂形成。
植入后8周，缺损区密度增高，密度仍低于骨干。
植入后12周，新骨桥连接骨缺损，密度不均匀，骨皮质不连续。
植入后16周，骨性连接形成，髓腔未形成。

空白组：
植入后4周，骨缺损两端有少量骨痂形成。
植入后8，12，16周，骨缺损两端有少量骨痂形成，无骨性连接。

2.4 以苏木精-伊红染色显示兔桡骨缺损愈合情况 见图3。

复合材料组：
植入后2周，骨缺损两端可见骨痂形成，移植物周围反应性细胞。
植入后4周，宿主结缔组织、纤维组织长入植骨材料周边，可见肉芽组织，少量炎症细胞，无明显骨形成，有少量软骨形成，可见少量成骨细胞。
植入后8周，植骨材料有吸收表现，新生软骨连接成片，可见成骨细胞，有较多编织骨形成。
植入后12周：植骨材料周围已基本吸收完全，由软骨细胞及编织骨替代，可见板状骨形成，可见少量骨髓组织。
植入后16周：植骨材料已基本吸收完全，仅中间有少量残余，软骨细胞已被板状新生骨代替，可见骨髓组织形成，髓腔再通。

异种脱蛋白松质骨组：
植入后2周，骨缺损两端可见骨痂形成，移植物周围反应性细胞，与复合材料组相近。
植入后4周，植骨材料周围肉芽组织形成，可见少量炎症细胞，无明显新生软骨及骨形成，可见少量成骨细胞及成软骨细胞，与复合材料组相近。
植入后8周，植骨材料周围炎症细胞及肉芽组织已吸收，植骨材料周围可见少量新生软骨，植骨材料无明显吸收。
植入后12周，植骨材料周围可见软骨细胞，局部可见岛状软骨，少量新生编织骨,无板状骨及骨髓形成。
植入后16周，植骨材料已基本吸收，仅少量残余，可见大量新生编织骨和新生软骨，有板状骨形成，可见少量骨髓组织。

空白组：
植入后2周，骨缺损两端可见骨痂形成，移植物周围反应性细胞。
植入后4周，骨缺损两端，有少量骨痂形成，可见肉芽组织及炎性细胞。
植入后8周，骨缺损两端有少量骨痂形成。
植入后12，16周，骨缺损两端有少量新生编织骨及板状骨形成，无骨髓组织。

2.5 新生骨定量分析观察兔桡骨缺损愈合情况 复合材料组与异种脱蛋白松质骨组不同时间点兔新生骨所占面积百分比见表2。

表2结果表明，异种脱蛋白松质骨/骨形态发生蛋白/纤维蛋白复合物组的新生骨面积明显多于异种脱蛋白松质骨组，差异有显著性意义（P < 0.05）。

3 讨论

在评价骨修复效果的动物模型选择上，骨缺损范围的大小直接关系到实验的客观性和可靠性。理想的骨缺损模型是在可以控制的样本中不会发生自行愈合的[10-12]。本实验中空白组观察至16周时，大体标本显示骨缺损仍未愈合，说明符合骨缺损模型的要求。
良好的生物相容性一直以来都是理想的骨组织工程支架材料所必须的条件[13]。异种骨的生物相容性主要表现在抗原性上。经过脱脂、脱钙、脱水等综合化学处理后再冻结干燥和辐照，很大程度地减弱或消除了免疫原性[14]。本实验异种骨采用脱蛋白、脱脂、冻干、深低温冷冻、60Co辐照等处理,明显抑制了抗原性，植入后对照组和复合材料组伤口均未出现红肿、渗出，伤口愈合好，组织学切片也未见明显淋巴细胞浸润，表现出良好的组织相容性。异种脱蛋白松质骨组X射线显示：植入后12周，新骨桥连接骨缺损，植入后16周，骨性连接形成，髓腔未形成。而复合材料组X射线显示：植入后8周，新骨桥连接骨缺损，植入后12周，骨皮质已完整形成，植入后16周，骨性连接形成，髓腔再通。说明复合材料组不仅骨缺损愈合快，而且骨重建完成早。证实异种脱蛋白骨的确是纤维蛋白/骨形态发生蛋白复合物的良好载体。
X射线、组织学检测及新生骨定量分析显示，复合材料组骨缺损区在同一时间内，成骨活跃程度、骨再生量和再生髓腔结构等方面均显著优于异种脱蛋白骨组,使骨缺损得到了较彻底的修复。故复合材料组修复骨缺损的机制值得探讨。
骨形态发生蛋白是最有效的骨诱导性蛋白，在人[15]和动物[16]骨缺损修复模型中已经被广泛研究。在骨形成中，骨形态发生蛋白调节细胞的分化和功能[17]。当骨形态发生蛋白促进骨愈合时，它的短半衰期和不稳定性就要求比生理需要量更多的投药，或者多次投药[15-16]。这样可以引起不良反应和高的治疗成本。因此，很有必要发展一种负载有生物活性骨形态发生蛋白的局部缓释载体。一些实验表明[18]，纤维蛋白能成为骨形态发生蛋白良好的缓释载体。纤维蛋白一方面起纤维支架的作用，另一方面可以阻止骨形态发生蛋白因血流冲刷的流失并且可起缓释作用，使骨形态发生蛋白能持续释放。但纤维蛋白降解较早，骨形态发生蛋白释放较快，限制了骨形态发生蛋白发挥更大的诱导成骨效应。有实验表明[19]，在体内，长期的缓释载体比短期的缓释载体更能增强骨形态发生蛋白的成骨效率。实验将异种脱蛋白松质骨与纤维蛋白、骨形态发生蛋白复合在一起，异种脱蛋白松质骨一方面发挥了上述良好载体的骨传导作用。另一方面，纤维蛋白降解较早，异种脱蛋白松质骨降解较晚，故延长了骨形态发生蛋白释放时间，发挥其更大的诱导成骨效应。组织学检测显示，复合材料组的植骨材料在8周降解，12周时基本吸收完全，植骨材料的降解吸收，就伴随着骨形态发生蛋白的进一步释放。从这个角度可以认为，异种脱蛋白松质骨又发挥了较长期的缓释载体的作用。组织学检测还显示，同样的异种脱蛋白骨，复合材料组比异种脱蛋白骨组降解吸收快。这说明，骨形态发生蛋白的进一步释放，加快了异种脱蛋白松质骨发挥缓释载体的作用。至此，可以认为，异种脱蛋白松质骨/骨形态发生蛋白/纤维蛋白复合物在骨修复过程中，互相之间起到了协同作用，加速了骨缺损愈合和骨重建。故在本实验中，复合材料组比异种脱蛋白松质骨组骨生长较快，多点成骨，新生骨范围大，效果满意。

4 参考文献

1 Zhao M, Zheng QX, Wang JG,et al.Zhongguo Gu yu Guanjie Sunshang Zazhi 2006;21（1）：30-32
赵铭，郑启新，王金光,等.仿生矿化对PLGA支架材料孔隙率及生物力学性能的影响[J].中国骨与关节损伤杂志，2006，21(1):30-32
2 Pogosian IuM, Enokian AD.Experimental and clinical substantiation of allogenic cortical bone matrix use for treatment of patients with habitual mandibular dislocation.Stomatologiia(Mosk) 2005；84(5)：44-47
3 Lan X,Yang ZM,Luo JC,et al.Zhongguo Xiufu Chongjian Waike Zazhi 2004；18(3):209 -213
蓝旭,杨志明,罗静聪,等.不同保存方法对生物衍生骨支架材料细胞相容性的影响[J].中国修复重建外科杂志,2004,18(3):209-213
4 Kang FW,Tang XF,Wen YM,et al.Tongji Daxue Xuebao:Yixue Ban 2005；26(6):4-7
康非吾,唐休发,温玉明,等.人骨生物衍生材料制备的实验研究[J].同济大学学报:医学版,2005,26(6):4-7
5 Liang J,Yang ZM,Li XQ,et al.Zhongguo Xiufu Chongjian Waike Zazhi 2005；19(6):464 -467
梁军,杨志明,李秀群,等.WO-1生物衍生组织工程骨支架材料的制备及性能研究[J].中国修复重建外科杂志2005,19(6):464-467
6 Hashizume H, Tamaki T, Oura H,et al.Changes in the extracellular matrix on the surface of sintered bovine bone implanted in the femur of a rabbit:an immunohistochemical study.J Orthop Sci 1998;3(1):42-53
7 Urist MR, Chang JJ, Lietze A, et al. Methods of preparation and bioassay of bone morphogenetic protein and fragments. Methods Enzymol 1987；146:294-312
8 Durham LH, Willatt DJ, Yung MW, et al. A method for preparation of fibrin glue. J Laryngol Otol 1987；101(11):1182-1186
9 Lane JM, Sandhu HS. Current approaches to experimental bone grafting. Orthop Clin North Am 1987;18(2):213-225
10 Hyun SJ, Han DK, Choi SH, et al. Effect of recombinant human bone morphogenetic protein-2, -4, and -7 on bone formation in rat calvarial defects. J Periodontol 2005;76(10):1667-1674
11 Han DK, Kim CS, Jung UW, et al. Effect of a fibrin-fibronectin sealing system as a carrier for recombinant human bone morphogenetic protein-4 on bone formation in rat calvarial defects. J Periodontol 2005;76(12):2216–2222
12 Jung UW, Choi SY, Pang EK, et al.The effect of varying the particle size of beta tricalcium phosphate carrier of recombinant human bone morphogenetic protein-4 on bone formation in rat calvarial defects. J Periodontol 2006;77(5):765-772
13 Zeng XL,Pei GX,Jin D, Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2006；10(33):174-178
曾宪利,裴国献,金丹,等.血管化组织工程骨修复猕猴的胫骨缺损[J].中国组织工程与临床康复,2006,10(33):174-178
14 Bi SX,Dai KR,Tang TT.Zhongguo Jiaoxing Waike Zazhi 2005;13(1):51-54
毕树熊,戴勊戎,汤亭亭.冻干同种与异种骨移植免疫反应的比较研究[J].中国矫形外科杂志,2005,13(1):51-54
15 Jones AL, Bucholz RW, Bosse MJ, et al.Recombinant human BMP-2 and allograft compared with autogenous bone graft for reconstruction of diaphyseal tibial fractures with cortical defects.A randomized, controlled trial. J Bone Joint Surg Am 2006;88 (7):1431–1441
16 Zhao B, Katagiri T, Toyoda H, et al. Heparin potentiates the in vivo ectopic bone formation induced by bone morphogenetic protein-2.J Biol Chem 2006;281(32):23246–23253
17 Lieberman JR, Daluiski A, Einhorn TA. The role of growth factors in the repair of bone. Biology and clinical applications. J Bone Joint Surg Am 2002;84-A(6):1032–1044
18 Jung RE, Schmoekel HG, Zwahlen R,et al. Platelet-rich plasma and fibrin as delivery systems for recombinant human bone morphogenetic protein-2. Clin Oral Implants Res 2005;16(6):676-682
19 Jeon O, Song SJ, Yang HS, et al. Long-term delivery enhances in vivo osteogenic efficacy of bone morphogenetic protein-2 compared to short-term delivery.Biochem Biophys Res Commun 2008;369(2):774- 780