Repairing big segmental long bone defects in goat tibia using modified heterogeneous deproteinizated bone combined with recombinant human bone morphogenetic protein
Jian Yue-kui, Tian Xiao-bin, Zhao Zhu-chuan, Li Bo, Zhang Mei-xin, Yang Zhen

Abstract
BACKGROUND: For its extensive sources and specific biological characteristics, deproteinized bone (DPB) gets more attention as the scaffold materials of bone tissue engineering.
OBJECTIVE: To evaluate the ability of heterogeneous DPB prepared by modified method compound recombinant human bone morphogenetic protein (rhBMP2) to repair big segmental long bone defect of the animals.
DESIGN, TIME AND SETTING: Randomized control animal experiment was completed in the Animal Center of the Third Military Medical University of Chinese PLA and the Central Laboratory of Southwest Hospital from May 2005 to December 2006.
MATERIALS: Pig femor were used in this study, as well as 24 goats of 10-12 months old and either gender; Half-ring sulcated external fixator (Professor Li Qi-hong of the Third Military Medical University of Chinese PLA, Patent No: CN01256565).
METHODS: According to the implanted materials, 24 goats were randomly divided into 3 groups (n=6), namely DPB group, autograft bone group and DPB+rhBMP2 group. 20% segmental defects of right tibia middle and inferior bone were induced in every goat and then implanted with different materials. Half-ring sulcated external fixator was used for the fixation. DPB was prepared according to the references.
MAIN OUTCOME MEASURES: Bone defect repairs were detected by X-ray photographs every 4 weeks during postoperative 4-24 weeks, and new bone executed dual-energy X-ray absorptiometry, histology and biomechanics at 24 postoperative weeks.
RESULTS: The prepared DPB exhibited three-dimensional porous structure. The porosity was (78.5±6.45)%, and the pore size was (472.5±7.02) μm. The bone repair in each group showed a time-dependent manner. The results of biomechanical test, such as torsional, bending and axial tensile tests, as well as the average new bone quantity in the autograft bone group was greater than that in the DPB+rhBMP2 group, and that in the DPB group was the least. There was no significant difference of the goat tibial bone density and bone mineral content, anti-compression pressure and limit pressure, anti-bending load and limit loading, anti-torsion torque and limit torque among the DPB group, autograft bone group and DPB+rhBMP2 group.
CONCLUSION: Composites of modified heterogeneous DPB/rhBMP2 and autogenous bone have equivalent osteogenesis abilities in repairing goat tibia big segmental bone defects. It can be applied as the scaffold materials in the tissue engineering.

Jian YK, Tian XB, Zhao ZC, Li B, Zhang MX, Yang Z. Repairing big segmental long bone defects in goat tibia using modified heterogeneous deproteinizated bone combined with recombinant human bone morphogenetic protein.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(27):5219-5222 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-27/27k-5219(ps).pdf]

摘要
背景：异种脱蛋白骨因其来源广泛和独特的生物学特性作为组织工程骨支架材料而受到较多关注。
目的：采用改良法制备异种脱蛋白骨复合重组人骨形态发生蛋白支架材料，评价其修复大动物大段长骨缺损的成骨能力。　
设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2005-05/2006-12在解放军第三军医大学实验动物中心及西南医院中心实验室完成。
材料：市售猪股骨；山羊24只,10~12个月龄，雌雄不限。半环槽外固定器由解放军第三军医大学李起鸿教授研制，专利号：CN01256565。
方法：山羊24只，随机分为单纯异种脱蛋白骨组、自体骨组及异种脱蛋白骨+重组人骨形态发生蛋白组，在每只山羊右侧胫骨中下段截除胫骨总长度20%形成节段性骨缺损，按分组情况植入不同材料，采用半环槽式外固定器固定。异种脱蛋白骨制备参照文献完成。
主要观察指标：术后4~24周每隔4周进行X射线及术后24周取新生骨进行双能X射线、组织学、生物力学检测骨缺损修复效果。
结果：①制得的异种脱蛋白骨为三维多孔结构，其孔隙率为（78.5±6.45）%，孔径大小为（472.5±7.02）μm。②各组骨缺损表现为时间依从性的骨修复。生物力学试验抗压缩、三点抗弯曲、抗扭转试验，以及同一时间点平均成骨量均为自体骨组 > 异种脱蛋白骨+重组人骨形态发生蛋白组 > 单纯异种脱蛋白骨组。③自体骨组、异种脱蛋白骨+重组人骨形态发生蛋白组与正常组比较，山羊胫骨骨密度及骨矿含量、抗压缩压强及极限压强、抗弯曲载荷及极限载荷、抗扭转扭矩及极限扭矩平均值差异均无显著性意义。
结论：改良法制备的异种脱蛋白骨复合重组人骨形态发生蛋白修复山羊胫骨大段缺损成骨能力与自体骨相当，可以作为组织工程支架材料。
关键词：异种脱蛋白骨；骨缺损；组织工程；支架材料

简月奎，田晓滨，赵筑川，李波，张美心，杨震.改良法制备异种脱蛋白骨复合重组人骨形态发生蛋白支架材料修复长骨大段骨缺损[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(27):5219-5222
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-27/27k-5219(ps).pdf]

>>本文导读<<

应用要点：实验以猪股骨为原料制备脱蛋白异种骨，在制备工艺上作了改进，主要是尽量保留胶原蛋白，去除非胶原蛋白、肽类、脂类及细胞等，在降低抗原性的同时保留力学强度。并以制备的脱蛋白异种骨作为组织工程支架材料与山羊自体骨髓间充质干细胞复合，加入成骨性骨诱导因子rhBMP2构建组织工程骨修复山羊胫骨中下段20%节段性缺损，结果表明其成骨能力与自体骨相当。

同行评价：本实验表明异种部分脱蛋白骨作为支架材料复合骨形态发生蛋白具有与自体骨相当的修复山羊胫骨大段骨缺损的作用，为异种骨作为支架材料修复大段骨缺损用于临床和科学研究提供了理论依据，对以后大段骨缺损的治疗具有指导意义。

偏倚或不足：文章仅对异种脱蛋白骨复合物修复长骨大段骨缺损进行24周观察。受于条件限制，没有做远期效果观察及大样本动物试验。如果能长期存活而不被吸收则离临床应用就不远了。

0 引言

近年国内外虽然有异种骨用于骨组织工程支架材料的许多研究 [1-3]，但没有完全解决异种骨的免疫原性及生物力学性能等问题，导致成骨能力差，只能修复小段骨缺损或小动物骨缺损。新改良法以猪股骨为原料，在制备工艺上作了改进，主要是尽量保留胶原蛋白，去除非胶原蛋白、肽类、脂类及细胞等, 在降低抗原性的同时保留力学强度，并作了理化性能、生物安全性、细胞相容性及小型动物成骨等实验，结果显示性能良好。本实验进一步以制备的异种骨作为组织工程骨支架材料修复大动物长骨大段缺损，并对成骨性能进行评价，为异种骨材料的临床应用提供实验依据。

1 材料和方法

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：实验于2005-05/2006-12在解放军第三军医大学实验动物中心及西南医院中心实验室完成。
材料：市售猪股骨；山羊24只由解放军第三军医大学动物实验中心提供,10~12个月龄，雌雄不限。

实验方法：
异种脱蛋白骨的制备：参照改良法[4-6]制备,将制备的猪脱蛋白骨放入-80 ℃超低温冰箱冷冻3个月后取出，在-700 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)真空下包装，60Co照射后置-4 ℃保存。异种脱蛋白骨于术前浸入含重组人骨形态发生蛋白浓度为75 μg/L溶液中2 h备用[7]。
实验动物分组：山羊24只，采用随机数字法分为3组，按植入材料分为单纯异种脱蛋白骨组、自体骨组和异种脱蛋白骨+重组人骨形态发生蛋白组，每组8只。
动物手术：动物于术前拍双侧胫骨X射线片,测量胫骨干长度, 所有动物骨缺损制备和外固定相同,操作由同一组人员完成。半环槽式外固定器固定，所有螺母旋紧。根据X射线片得到的胫骨长度，在每只山羊右侧胫骨中下段造成20%骨和骨膜段缺损[5,8-10]，根据分组情况植入不同的植入物，其中骨髓间充质干细胞均来自山羊自体骨髓。
影像学观察：所有动物术后4，8，12，16，20，24周均拍手术肢体正侧位X射线片。按 Lane-Sandhu X射线评分标准评分[11],对骨缺损自行修复进行量化分析。
组织学检查：术后24周，取骨缺损部标本,用40 g/L中性甲醛固定，乙二胺四乙酸脱钙,乙醇逐级脱水，二甲苯透明，苏木精-伊红染色。
双能X射线测量分析：将术后24周各组山羊双侧胫骨取下，剔净软组织，在双能X射线测量仪下测量。以所有山羊胫骨对照侧双能X射线值取平均值为评价标准，与实验侧同时相点测量值进行比较。
生物力学测定：将术后24周各组山羊双侧胫骨取下，剔净软组织，在RGT-5A型电子式万能材料试验机进行抗压缩、抗扭转和三点抗弯曲检测，记录载荷-变形曲线。以所有山羊胫骨对照侧测量值取平均值为评价标准，与实验侧测量值进行比较。
主要观察指标：①异种脱蛋白骨及异种脱蛋白骨复合骨髓间充质干细胞大体和电镱观察。②山羊术后大体观察。③各组材料影像学观察、双能X射线测量分析、生物力学测定、组织学观察。
设计、实施、评估者：设计为博士生导师李起鸿教授，实施为第一作者，评估为第三军医大学科研处。
统计学方法：第一作者采用SPSS 13.0统计软件处理，采用单因素方差分析进行组间和组内比较。

2 结果

2.1 实验动物数量分析 实验选用山羊24只，分为3组，动物无脱失，24只山羊全部进入结果分析。
2.2 异种脱蛋白骨及异种脱蛋白骨复合骨髓间充质干细胞大体和电镜观察

外观形态：
制得的异种脱蛋白骨为白色长条状，3 mm×3 mm×35 mm大小。可见多孔蜂状结构，质硬，无异味。小梁结构清晰，间质及细胞已脱去。

电镜观察：
可见三维多孔结构及网状孔隙，孔隙之间相互交通，其孔隙率为（78.5±6.45）%，孔径大小为（472.5±7.02）μm，见图1。

2.3 山羊术后大体观察 所有实验山羊术后伤口无溃烂、流脓，无死亡。2~6 h苏醒,并能站立进食。螺母松动后及时旋紧，无外固定松动失败,皮肤无坏死。2 d 内伤肢能落地,但不能负重,2周后可以部分负重,3周有轻微跛行,4周后能自由活动,无跛行。

2.4 影像学观察

术后4周：
单纯异种脱蛋白骨组、异种脱蛋白骨+重组人骨形态发生蛋白组骨缺损区出现异种脱蛋白骨边缘毛糙。

术后8周：
出现大小不等、形状不规则的透光性骨吸收区。

术后12，16，20周：
单纯异种脱蛋白骨组、自体骨组、异种脱蛋白骨+重组人骨形态发生蛋白组表现为时间依从性的骨修复，骨缺损区两断端之间高密度钙化影。

术后24周:
单纯异种脱蛋白骨组：骨缺损区移植材料完全消失，新骨与两断端相连，但密度较低。
自体骨组：新生骨与两断端完全连接，已塑形, 髓腔部分相通。
异种脱蛋白骨+重组人骨形态发生蛋白组：新生骨与两断端完全相连接，大部分塑形，可见髓腔影。

同一时间:
平均成骨量自体骨组>异种脱蛋白骨+重组人骨形态发生蛋白组>单纯异种脱蛋白骨组，见图2。

2.5 采用Lane-Sandhu 法X射线摄片评分标准对骨缺损修复评分[11] 见表1。

2.6 双能X射线测量分析

术后24周骨密度和骨矿含量：
单纯异种脱蛋白骨组骨密度（0.57±0.18） g/cm3, 骨矿含量 (0.27± 0.13) g/cm3。
自体骨组骨密度(1.00±0.17) g/cm3, 骨矿含量(0.42±0.10)g/cm3。
异种脱蛋白骨+重组人骨形态发生蛋白组骨密度(1.00±0.11) g/cm3, 骨矿含量(0.48±0.12) g/cm3。
自体骨组、异种脱蛋白骨+重组人骨形态发生蛋白组之间及与正常山羊胫骨骨密度(1.00±0.17)及骨矿含量（0.47±0.10）比较差异均无显著性意义（P > 0.05）。
单纯异种脱蛋白骨组与正常山羊胫骨比较差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.7 组织学检查

术后12周：
单纯异种脱蛋白骨组骨缺损区异种脱蛋白骨降解，新骨量少并呈云雾状阴影，胫骨缺损断端及移植物纹理模糊。
自体骨组骨缺损区大量骨痂形成膨大阴影，新生骨痂与两断端连接。
异种脱蛋白骨+重组人骨形态发生蛋白组骨缺损区被新生骨组织填充,移植材料完全消失。

术后24周：
单纯异种脱蛋白骨组新生骨与最初两断端部分相连，新生骨为少量编织骨，骨小梁排列紊乱，骨量较少（不足60%），骨髓腔内出现少量骨髓。
自体骨组、异种脱蛋白骨+重组人骨形态发生蛋白组新生骨与最初两断端连成一体，逐渐改建为板层骨，新生骨骨小梁排列整齐有序。

2.8 生物力学测定

抗压缩试验曲线：
术后24周，异种脱蛋白骨+重组人骨形态发生蛋白组呈线性关系，有波峰和平台期，达到极限强度后骨块断裂，续为一倾斜向下曲线。

三点抗弯试验曲线：
呈线性关系，无明显波峰，有平台期，达到极限强度后骨块断裂，续为陡直向下直线。

抗扭转试验曲线：
呈线关系，达到极限扭矩后骨块断裂，续为垂直向下的直线。

抗压缩、三点抗弯曲和抗扭转试验：
均为自体骨组 > 异种脱蛋白骨+重组人骨形态发生蛋白组 > 单纯异种脱蛋白骨组。3组抗压缩压强及极限压强、抗弯曲载荷及极限载荷、抗扭转扭矩及极限扭矩平均值比较差异无显著性意义(P > 0.05)。

3 讨论

改良法在制备过程中尽量保留胶原蛋白，加入骨诱性细胞因子重组人骨形态发生蛋白,使复合物既具有骨传导性，又具有骨诱导性，成骨能力及成骨质量优于单纯异种脱蛋白骨。由于临床上对大段、小段骨缺损并无明确的界定，Schmitz[12-14]提出了临界骨缺损的概念，认为骨缺损大于长骨直径的1.5倍是大段骨缺损，山羊胫骨中下段直径为（12±1.8）mm，实验所采用的骨缺损长度大于30 mm，为大段骨缺损。
本实验以异种脱蛋白骨作为组织工程支架材料修复山羊胫骨大段缺损，对其成骨能力进行了研究（免疫原性另文发表），并对新生骨的各项指标进行评价[15-17]，成骨能力的评价不仅包括新骨的数量，还有新骨的质量。脱蛋白骨作为组织工程支架材料的主要作用是作为骨髓间充质干细胞和重组人骨形态发生蛋白的载体、缓慢降解缓释重组人骨形态发生蛋白及骨传导作用。实验结果显示，所有实验山羊术后伤口无溃烂、流脓，无死亡。术后4~24周，在同一时间点，X射线、骨密度、生物力学和血管化水平，自体骨组 > 异种脱蛋白骨+重组人骨形态发生蛋白组 > 单纯异种脱蛋白骨组，异种脱蛋白骨+重组人骨形态发生蛋白组与自体骨组相比较无显著性差异（P > 0.05），说明异种脱蛋白骨复合重组人骨形态发生蛋白对20%山羊胫骨中下段缺损的完全修复，自体骨髓间充质干细胞及重组人骨形态发生蛋白可显著加速成骨过程。异种脱蛋白骨+重组人骨形态发生蛋白组新骨的数量和质量与自体骨组相当。单纯异种脱蛋白骨组虽有一定的成骨，但不足60%，且新骨的骨密度和骨矿含量低，生物力学和血管化与异种脱蛋白骨+重组人骨形态发生蛋白组比较有显著性差异。
本实验证明了改良法制备的异种脱蛋白骨可以作为组织工程支架材料修复大动物长骨大段缺损，成骨能力与自体骨相当，可作为骨组织工程支架材料试应用于临床。

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