Vascularization of tissue engineered bone constructed by bio-derived bone co-cultured with induced bone marrow mesenchymal stem cells to repair segmental defects of rabbit radius-periosteum
Zhu Xiao-qi, Ma Xue-feng, He Yong-li, Guo Hao

Abstract
BACKGROUND: It is a key for the survival of a transplanted bone to vascularize.
OBJECTIVE: To study the vascularization of repairing segmental defects of rabbit radius-periosteum by tissue engineering bone constructed by the co-culture of bio-derived bone with induced bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs).
DESIGN, TIME AND SETTING: Randomization design animal controlled trials were performed at the laboratory of Life Science College of Nanhua University from January 2007 to January 2008.
MATERIALS: Twenty-five healthy adult New Zealand rabbits were used in this study to establish a 15-mm length of radius-periosteum defects on both sides of radial bone.
METHODS: Bio-derived bone scaffold was prepared with a serial of physical and chemical processes, including degreasing, deproteinization, partial decalcification and freeze drying. Bio-derived bone scaffold was then co-cultured with induced BMSCs to construct tissue engineering bones, which were implanted into the segmental bone defects of 20 rabbits in right radius, taken as the experimental group; Bio-derived bone scaffold was implanted into the left radius, serving as the controls. No implant was given into the other 5 rabbits as the blank group.
MAIN OUTCOME MEASURES: The healing on the broken ends of fractured bone was observed after tissue engineering bone and bio-derived bone were implanted for 2, 4, 8 and 12 weeks. Histological examination was performed to observe the angiopoiesis after operation, we also did the image analysis of blood vessels.
RESULTS: All the 25 rabbits come to result analysis. The broken ends of fractured bone healed at 8 weeks postoperation in the experimental group, and there were moldings at 12 weeks, the appearance was close to the normal. In the control group, the healing was not as good as that of the experimental group at every time. Histological examination showed that, a lot of blood vessels were observed in both experimental and control groups at 4 weeks postoperation. In the experimental group, the vascular net began to arrange regularly at 8 weeks, and the blood vessels were mature at 12 weeks, with the orientating of blood vessels more well-distributed and well-ordered than that of control group, the shape and structure approached normal blood vessel in cortex bone. Blood vessel image analysis showed that, the areas of blood vessel in both experimental and control groups were significantly less at 2 weeks after operation, but larger than the normal one at 4 and 8 weeks (P < 0.05). At 4 weeks posttransplant, the area of blood vessels in the experimental group was significantly lower than that in the control group (P < 0.05).
CONCLUSION: The tissue engineering bone constructed by bio-derived bone co-cultured with induced BMSCs has good vascularization in repairing segmental defects of rabbit radial bone.

Zhu XQ, Ma XF, He YL, Guo H.Vascularization of tissue engineered bone constructed by bio-derived bone co-cultured with induced bone marrow mesenchymal stem cells to repair segmental defects of rabbit radius-periosteum .Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(27):5226-5229
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-27/27k-5226(ps).pdf]

摘要
背景：移植骨能否血管化是移植成活的关键。
目的：验证生物衍生骨复合骨髓间充质干细胞构建组织化工程骨修复兔桡骨-骨膜缺损的血管化进程。
设计、时间及地点：随机分组设计的动物对照实验，2007-01/2008-01在南华大学生命科学院实验室完成。
材料：健康成年新西兰大白兔25只，双侧桡骨制备成中段1.5 cm的桡骨-骨膜缺损。
方法：经脱脂、脱蛋白、部分脱钙和冻干等一系列的物理、化学方法处理后制备生物衍生骨支架材料。与自体骨髓间充质干细胞复合制备组织工程骨支架材料。按随机数字表法，20只兔右侧桡骨为实验组植入组织工程骨，左侧为对照组植入单纯生物衍生骨，不做内外固定；另5只兔双侧造成骨缺损后不植入任何材料作为空白组。
主要观察指标：植入后2，4，8，12周观察组织工程骨、生物衍生骨与断端的愈合情况；组织学观察骨组织中血管形成情况，并进行血管面积图像分析。
结果：25只兔无脱落。大体观察显示实验组植入后8周两断端已融合为一体；植入后12周，已经塑型，外观接近正常。对照组各时间点愈合程度不如实验组。组织学观察显示，实验组和对照组植入后4周均有大量血管生成，植入后8周，实验组修复区的血管网较对照组开始排列规律；植入后12周，实验组血管已达成熟阶段，血管排列方向比对照组均匀、有序，形态结构接近正常皮质骨的血管形态。血管面积图像法测定的血管面积结果表明，植入后2周实验组和对照组血管面积低于正常骨组织，植入后4，8周实验组和对照组血管面积高于正常骨组织，差异均有显著性意义(P < 0.05)。植入后4周实验组血管面积低于对照组，差异有显著性意义 (P < 0.05)。
结论：生物衍生骨复合成骨诱导的骨髓间充质干细胞可加快骨修复后的血管化进程。
关键词：骨髓间充质干细胞；生物衍生骨；组织工程化骨；血管化

朱肖奇，马雪峰，贺用礼，郭浩.生物衍生骨复合成骨诱导骨髓间充质干细胞构建组织工程化骨修复兔桡骨-骨膜缺损的血管化进程[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(27):5226-5229
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-27/27k-5226(ps).pdf]

>>本文导读<<

偏倚或不足：①实验通过对标本切片、染色进行图像分析测量血管面积从而推断血管化程度。因此标本取材、切片部位等都可能对实验产生影响造成实验结果的偏倚。②实验中观察只能是相对连续的，采用的观察时间为2，4，8，12周时间点，时间间隔较长，造成对实验动物观察不够连续，对移植物血管化进程的观察也不够精确。

临床应用性：从新西兰大白兔骨髓分离出骨髓基质干细胞诱导为成骨细胞与自体生物衍生骨支架材料复合培养构建的组织工程化骨修复兔桡骨缺损能过快速血管化。提示生物衍生骨支架材料复合骨髓基质干细胞分离培养并诱导分化的成骨细胞培养构建的组织工程化骨可成为治疗骨缺损的理想材料。

相关链接：对组织工程组织的血管化研究模型有体外和体内两种。体外实验可以检测支架与内皮细胞的黏附、增殖及迁移、材料的细胞毒性、血管化效应和各种生长因子的调节作用。体内最简单实用的模型是用鸡胚茸毛尿囊膜模型，更高等的实验模型是在完整的动物体内。组织工程组织血管化的策略有对支架材料的表面结构进行修饰、在材料内复合缓释的生长因子、内皮细胞与其他种子细胞联合培养、体内血管网包裹、血管束植入、血管模板以及体外在人造组织内构造微血管等。

0 引言

移植骨能否成活的关键是由移植骨能否血管化决定的[1-5]，组织工程骨的再血管化过程是骨组织工程的关键环节。因而有必要进一步研究组织化工程骨在组织体内的血管过程和成骨能力的研究。以天然无机材料，高分子合成材料作为支架材料的组织工程骨与人体骨在结构、成分、微环境有很大差异，不是理想的材料。生物衍生支架材料与自体骨有相似的微环境是组织工程骨的最佳支架材料[6-10]，但对其血管化问题还少有研究。本实验应用自制的生物衍生骨复合自体骨髓间充质干细胞修复兔桡骨的大段骨缺损，观察其血管化情况为骨组织工程的临床应用提供理论依据。

1 材料和方法

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：实验于2007-01/2008-01在南华大学生命科学院实验室完成。
材料：选择清洁级新西兰大白兔25只，月龄2~3个月，雌雄不拘，体质量1.0~2.5 kg，由南华大学动物实验中心提供（ 动物实验室许可证:SCXK(湘)2004-2009）。

实验过程：
兔骨髓间充质干细胞的分离与培养[11-15]：主要步骤：20%乌拉坦5 mL/kg耳缘静脉麻醉，无菌条件下用20 mL的注射器(内含500 U/mL肝素钠0.5 mL)16号针头于兔的髂前上棘及股骨内处抽取骨髓4 mL，以1∶1叠加到Ficoll-paqua淋巴细胞分离液上，离心3 000 r/min× 30 min，取中间乳白色单核细胞层界面细胞，放在另一离心管中，加入培养基，再次离心1 000 r/min×10 min，弃上清取离心管底部骨髓间充质干细胞白色沉淀，重悬后接种于25 cm2培养瓶，37 ℃、体积分数为0.05的CO2、饱和湿度条件下培养。
体外定向诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化[4]：取第3代的骨髓间充质干细胞，制成细胞悬液。然后接种到培养板中，饱和湿度下继续培养，当细胞贴壁融合达80%~90%时，换成含1×10-8 mol/L地塞米松+ 10 mmol/L β-磷酸甘油钠+50 mg/L维生素C的10%培养基继续培养，向成骨细胞诱导分化。
碱性磷酸酶测定：收集3，6，9，12 d的诱导细胞，离心后弃上清并在细胞中加入Trizol裂解液，然后按碱性磷酸酶测定试剂盒说明进行碱性磷酸酶测定。
生物衍生骨的制备[8-9,16]：取一定量的新西兰大白兔骨，将髓腔冲洗干净，制成1.5 cm长度大小，然后30%的双氧水浸泡48 h。然后用氯仿-甲醇（3∶1）常温下浸泡4 h。改良脱钙液浸泡72 h。-80 ℃的冰箱保存24 h，去抗原处理。最后分装，环氧乙烷消毒，4 ℃冰箱保存。
组织工程骨的体外构建[7-8,17]：将材料用无血清的培养基浸泡24 h。然后再将诱导的成骨细胞制悬，以5×109 L-1的密度接种到培养基浸泡过的支架上，然后有血清的培养基培养1周左右，再移植到动物体内。
实验模型的制备：20%乌拉坦按5 mL/kg耳缘静脉麻醉，然后固定兔于仰卧位，四肢外展。剪去双侧前肢内侧的兔毛，碘酒、乙醇消毒，取前肢外侧弧行切口，钝性分离至桡骨，然后制备双侧1.5 cm长的骨膜-桡骨缺损。模型兔20只，左前肢缺损作为对照组，右前肢缺损作为实验组。又分为植入后2，4，8，12周4个时间点，每个时间点5只。另外5只兔作为空白组，双侧造成骨缺损后不植入任何材料。25只桡骨缺损模型均由同一组人员完成，骨缺损长度、截骨位置均相同。让其在笼中自由活动。每天青霉素40万单位肌肉注射，连续3 d。定时定量给予标准兔饲料，水不限定，自动供给。将制备好的生物衍生骨和组织工程骨分别植于对照组和实验组，手术线绑定植入骨，缝合切口。常规消毒和应用抗生素。
主要观察指标：①大体观察：肉眼直接观察组织工程骨、生物衍生骨与断端的愈合情况。②骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶活性检测：检测实验组和对照组不同时间点骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶活性。③组织学观察及血管面积图像分析：取各时间点的组织标本，每个组标本随机抽取两端和中间的横切片和纵切片2张，分别行Masson染色和苏木精-伊红染色用于血管面积分析。应用XTH-/VTV型纤维图像分析记录仪做血管数目和面积的图像分析。经图像捕获、图像录入、图像读出后，将整个视野划分为1 024个统计场面积单位(u)，然后计算出视野中血管所占的统计场面积。
设计、实施、评估者：设计为第一作者，实施为全部作者，评估为第一作者，评估者经过正规培训。
统计学分析：由第一作者采用SPSS 13.0进行数据处理，数据以x(_)±s表示，行方差分析和t检验。

2 结果

2.1 实验动物数量分析 纳入兔25只，均进入结果分析，无脱落。所有兔植入后3 d内，饮食减少，精神差，活动明显减少，但情况逐渐好转，7 d左右饮食和精神正常化。所有兔伤口一期愈合，无感染。有4只兔耳缘静脉麻醉处出现血肿，注射抗生素控制未出现感染。
2.2 成骨诱导培养下不同时间点的骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶活性比较 见表1。

表1结果表明，培养3，6，9，12 d实验组骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶活性均高于对照组，差异有显著性意义（P < 0.01）。

2.3 大体标本观察

实验组及对照组：
植入后2周，靠近断端处有纤维组织连接，但断端缝隙仍明显。
植入后4周，骨痂形成，对照组骨痂量明显少于实验组，且断端仍较明显。
植入后8周，实验组两断端已融合为一体，大量骨痂都与尺骨之间形成骨桥，塑型尚不完全；对照组骨痂主要集中在断端附近。
植入后12周，实验组塑型好于对照组，外观已接近正常骨，见图1a，b。

空白组：
植入后12周，断端骨萎缩，缺损明显，见图1c。

2.4 血管面积图像法测定血管面积 见表2。

表2结果表明，植入后2，4，8周的实验组和对照组血管面积与正常骨组织比较，差异有显著性意义(P < 0.05)。植入后4周实验组与对照组血管面积比较差异显著 (P < 0.05)。
2.5 血管面积图像分析

实验组和对照组：
植入后2周，血管形成较少，组织工程骨周围有大量炎性细胞浸润。
植入后4周，修复骨缺损材料中均有大量血管生成，血管主要是从周围软组织和骨髓腔长入，见图2a,b。
植入后8周，相对于对照组比较，实验组修复区的血管网开始排列规律，血管口径差别较小，排列较稀疏。
植入后12周，血管已达成熟阶段，血管排列方向均匀、有序，形态结构接近正常皮质骨的血管形态，见图2c,d。

3 讨论

骨移植后的3个基本过程是移植物血管化、骨再生和骨断端间融合，其中血管化是关键环节，贯穿整个移植修复过程，对骨再生与融合的方式及效果起决定性作用[3]。组织工程骨修复骨缺损的基础依然是血管化。组织工程骨的支架材料的三维多孔结构和良好的组织相容性与血管的迅速长入关系密切。本实验所用的生物衍生骨的支架材料经过脱脂、脱蛋白、部分脱钙和冻干等一系列的物理、化学方法处理，去除了细胞、部分蛋白及抗原性，保存了天然的网状孔隙结构，能够很好的黏附成骨细胞。本实验依据经典的体外构建组织工程骨的模式，植入体内修复骨缺损。实验结果显示：早期由于炎症排斥反应，导致一定程度上抑制了早期血管化。随后炎症排斥反应减弱，血管化反应加强，新生血管开始大量长入移植物。实验组又较对照组的血管化快且规律化早，表明材料中复合的成骨细胞成活，可能同时分泌血管内皮细胞因子等相关因子促进血管化进程。同时由于局部低氧环境可刺激内源性血管生长因子的表达从而促进血管化的形成。
结论：用诱导的骨髓间充质干细胞与生物衍生骨体外复合构建的组织化工程骨植入体内修复骨缺损能快速血管化。

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