Co-culture of bone marrow mesenchymal stem cells on acellular cartilage scaffold biomaterials and in vivo biodegradation of acellular cartilage biomaterials
He Jun-ren1, Yang Zi-quan1, Li Gang2, Wei Xiao-chun1

Abstract
BACKGROUND: The method of embedding in animals is considered to be the most effective pathway to detect the biocompatibility.
OBJECTIVE: To investigate the biodegradation properties of acellular cartilage scaffold biomaterials in the co-culture with bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) and the in vivo embedding.
TIME AND SETTING: An observation was carried out in the laboratory of Orthopedics, the Second Hospital of Shanxi Medical University (Taiyuan, Shanxi, China) from June to August in 2007.
MATERIALS: SD rats weighing 60-80 g; 6-month pigs were offered by Shanxi Institute of Animal Husbandry.
METHODS: The BMSCs were isolated from SD rats and then cultured. Pig knee articular cartilage was harvested to prepare acellular cartilage scaffold material, which was co-cultured with BMSCs. While cells cultured without acellular collagen matrix (ACM) were taken as normal controls. The resultant scaffold material was implanted into the dorsal skin of rats. Gross observation and histology were determined at 14 and 28 days.
MAIN OUTCOME MEASURES: The ACM was routinely stained in paraffin sections, the co-culture of BMSCs on ACM was observed at 24 and 72 hours with inverted microscope. By means of inflammatory cells response, fibrous capsule formation and degradation standard, the biodegradation of the ACM was estimated after the ACM was hypodermically embedded in animals.
RESULTS: Under inverted microscope, BMSCs co-cultured on the ACM were fusiform-shaped and polygonal at 24 hours, and the morphology was identical with the normal controlled cells at 72 hours, which presented polygon and cop. Hematoxylin-eosin stain revealed that, BMSCs in the ACM were oval and nucleoli appeared in a few cells. The ACM were decomposed into particulates. Histological observation displayed few lymphocytes and polymorphonuclear leucocytes around the ACM, and the ACM were encapsulated by compact fibrous capsule wall and were decomposed into small parts.
CONCLUSION: BMSCs on the ACM develop in the course of nature and the ACM embedded hypodermically degrades into particles after four weeks.

He JR, Yang ZQ, Li G, Wei XC.Co-culture of bone marrow mesenchymal stem cells on acellular cartilage scaffold biomaterials and in vivo biodegradation of acellular cartilage biomaterials.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(27):5230-5234 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-27/27k-5230(ps).pdf]

摘要
背景：动物体内埋植实验被认为是最常用有效的检测生物相容性的方法。
目的：拟观察脱细胞软骨生物支架材料与细胞共培养及体内埋植实验时的生物降解性。
时间及地点：观察性实验，于2007-06/08在山西医科大学第二医院骨科实验室完成。
材料：SD大鼠，体质量60~80 g；6月龄猪由山西畜牧研究所提供。
方法：①分离培养大鼠骨髓间充质干细胞，取猪膝关节软骨制备脱细胞关节软骨支架材料，将两者进行复合培养。未经与无细胞胶原基质联合培养的细胞作为正常对照。②将备好的生物支架材料植入大鼠背部皮下，于14，28 d 取材，对其进行大体及组织染色。
主要观察指标：①对复合细胞的无细胞胶原基质进行石蜡切片常规染色，倒置显微镜下观察24，72 h 细胞与无细胞胶原基质共培养情况。②通过炎性细胞反应及纤维囊形成级别评定标准、材料降解结果评定合格标准分析植入材料在动物体内降解情况。
结果：①倒置显微镜下观察与无细胞胶原基质共培养24 h 细胞多呈长梭形和多角形；72 h 后与无细胞胶原基质联合培养和未与无细胞胶原基质联合培养的2种细胞形态相似，均呈多角形和圆锥形。苏木精-伊红染色可见细胞嵌入软骨支架材料中，呈圆形和椭圆形，部分细胞可见细胞核，材料呈颗粒状，染色均一。②组织学观察可见试样周围存在少量淋巴细胞和嗜中性粒细胞，致密纤维囊壁将复合细胞的材料包裹，材料被降解为细小颗粒，细胞均匀散在材料中呈椭圆形，可见分裂相。
结论：支架材料在与细胞共培养及体内埋植实验中均生长正常，经过4周材料顺利降解为细小颗粒。
关键词：脱细胞软骨材料；细胞材料共培养；体内植入

何君仁，杨自权，李刚，卫小春.脱细胞软骨生物支架材料与大鼠骨髓间充质干细胞共培养及体内埋植后的降解[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(27):5230-5234 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-27/27k-5230(ps).pdf]

>>本文导读<<

课题背景：课题为山西省国际技术合作项目：“基因修饰干细胞治疗软骨损伤”系列研究内容之一，项目号：2007081037。本实验以特制的脱细胞软骨基质材料作为载体将基因修饰的干细胞移植入关节软骨损伤模型动物体内，使其能在局部稳定地表达基因产物，促进关节软骨损伤的修复。

作者介绍：通讯作者卫小春为博士生导师，瑞典Linkoping大学医院及瑞士苏黎士大学医学院博士后，国内著名骨科专家，中国骨质疏松组组长，山西省政协副主席。相关研究在国内和国际骨科杂志上发表论文90余篇，被SCI引文库收录14篇，参加国际学术会议10余次。目前已承担的课题有国家自然科学基金（303714410），山西省国际合作项目（2007081037）等。

重点实验室介绍：山西医科大学第二医院骨科实验室是山西省重点实验室，目前已经完成和正在进行的科研项目包括国家“863”计划项目，国家自然科学基金项目3项以及10余项省部级科研攻关项目，实验室具有开展细胞培养，组织学检测，生物力学研究，分子生物学技术等多项实验的良好条件和能力，本实验在此完成。

0 引言

组织工程的发展对生物材料提出了更高的要求。材料除具备生物安全性，良好的生物相容性外，生物材料植入人体后，常常出现免疫反应[1]，其表面还会诱发一系列宿主反应，包括蛋白质的优先吸附、补体激活、细胞黏连等更为广义上的炎症和纤维化反应[2]。由于以往的支架材料并非来源于同种组织，其与作用因子和种子细胞的复合很难模仿自然修复过程，材料表面和细胞之间的作用更加复杂。近些年来，脱细胞组织基质由于来源于异种异体同部位组织，其在组织工程生物材料中的应用被日益关注。
泌尿外科已经广泛应用脱细胞基质进行尿道重建[3]，原理是通过脱除细胞的方法去除组织的移植免疫源性，较完整保留了细胞赖以生存的细胞外基质环境，进而作为生物材料被应用，最大限度的保留了种子细胞的原始生活环境，所以从仿生学角度考虑，作为生物支架材料本身具有极大的优势。真皮、血管和膀胱等脱细胞组织基质在动物实验和临床应用中都展示了广阔的应用前景。本实验从细胞复合组织共培养方面观察细胞和材料的复合生长情况，并通过体内植入实验观察材料降解时的炎症反应和纤维化反应。

1 材料和方法

设计：观察性实验。
时间及地点：实验于2007-06/08在山西医科大学第二医院骨科实验室完成。
材料：SD大鼠，雌雄不拘，体质量60~80 g，由山西畜牧研究所提供；6月龄猪（猪膝关节约10 kg），由山西省重点实验室提供。

实验过程：
材料直接接触实验[4]：
骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC)的分离培养：2月龄SD大鼠，常规消毒麻醉铺巾，无菌条件下截取双下肢长骨，去除干骺端，注射器取低糖DMEM培养液冲洗骨髓腔，获取骨髓液，2个15 mL 离心管1 000 r/min 离心10 min，去掉上层培养液，用含体积分数为0.2胎牛血清的低糖DMEM培养液，以1×108 L-1 的密度接种于培养皿。换液周期3 d，当细胞融合率达80%，2.5 g/L 胰蛋白酶消化，1∶2比例传代。
脱细胞关节软骨支架材料的制备：猪膝关节软骨切下后清洗干净，冷冻干燥后粉碎，取特定直径的软骨粉末，胰酶消化清洗，1%TritonX-100洗脱处理，蒸馏水清洗干净后离心，冷冻干燥机干燥，紫外线照射后并用环氧乙烷消毒后封装备用。
无细胞胶原基质(Acellular collagenmatrix，ACM)的制备：将猪膝关节软骨切下后清洗干净，冷冻干燥后粉碎，取特定直径的软骨粉末，胰酶消化清洗，1%TritonX-100洗脱处理，蒸馏水清洗干净后离心，冷冻干燥机干燥，紫外线
照射后并用环氧乙烷消毒后封装备用。
BMSC与支架材料复合培养：将制备好的无菌脱细胞软骨生物支架材料ACM切成小块(约5 mm×5 mm× 3 mm)后移入24孔板，将大鼠原代BMSC单细胞悬液浓度调整为3×107 L-1，用吸管将细胞悬液缓慢逐滴滴加于材料上，以细胞不从材料表面溢出为度，置37 ℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度条件下孵育（1.0~2.0 h），细胞黏附到材料上后，继续重复滴加细胞悬液保证接种细胞量，产生种子细胞的二次沉淀。用剩余含细胞的DMEM液浸润ACM块，置37 ℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度条件下孵育，倒置显微镜下观察24，72 h 细胞与ACM共培养情况，未经与ACM联合培养的细胞作为正常对照。并对复合细胞的ACM进行石蜡切片常规苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色观察。
材料体内降解性测试[5]：
材料动物包埋过程：①手术室消毒，紫外线照射20 min，通风。已消毒手术器械准备。②3月龄SD大鼠称体质量，按体质量7‰的剂量腹腔注射5%水合氯醛。背部术区周围2 cm 消毒，俯卧位固定于手术床上，常规消毒铺巾。③1%利多卡因局麻，背部正中纵行切口长约1.5 cm，顿性分离充分暴露。④将备好的生物支架材料植入背部皮下，见图1，上下方分别用手术缝线作为标记，组织块大小约5 mm×5 mm×3 mm。⑤皮下与皮肤组织分层缝合，消毒棉球覆盖，动物分笼饲养。

标本采集及相关观察：将埋植材料的动物分别于14，28 d取材，对其进行大体及组织染色观察（苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色、阿尔新蓝染色），并通过评定标准分析其在动物体内降解情况。
炎性细胞反应及纤维囊形成级别评定标准[5]：

降解结果评定合格标准[5]：

2 结果

2.1 倒置显微镜下观察24，72 h 细胞与ACM共培养情况

24 h 倒置显微镜观察：
与ACM共培养细胞多呈长梭形和多角形，见图2a。

72 h 倒置显微镜观察：
与ACM联合培养和未与ACM联合培养的2种细胞形态相似，均呈多角形和圆锥形，部分呈椭圆形，形态上无明显差异，见图2b，图2c。

2.2 石蜡切片常规染色观察 24 h 可见细胞嵌入ACM中，细胞呈圆形和椭圆形，部分细胞可见细胞核，ACM呈颗粒状，染色均一，见图3。

72 h 可见BMSC与ACM嵌合良好，细胞排列均一，出现极性排列趋势，细胞呈椭圆形，梭形或多角形，可见细胞分裂像，偶见软骨陷窝样结构，见图4。

2.3 术后不同时间点材料在动物体内的降解情况 14 d：术后所有动物无死亡，伤口愈合好，无感染。ACM被组织包绕，轻度降解吸收，可见吸收空洞，周围组织可见轻微炎症反应。ACM中细胞呈椭圆形，可见分裂相，见图5。

28 d：ACM从SD大鼠背部埋植处取出后见图6。

动物伤口愈合好，未见伤口红肿，黏连及突出，与周围正常组织未见差别，凭借缝线标记取材，ACM近70%已被吸收，周围组织将其分割为分散颗粒，可见吸收空洞，周围组织未见明显炎症反应，见图7。

2.4 可能影响结果的因素分析 实验过程中由于动物饮食和身体状况的差异，材料体内降解率有可能存在一定的差异。此外，埋植材料处用缝线作为标记，是否会引发一些附加的黏膜反应或是影响材料降解性的因素，并未展开研究。

3 讨论

3.1 材料直接接触实验 种子细胞和载体材料的相容性也是组织工程中的关键环节。日本Chen等[7]选择人MSCs与网状PLGA-胶原材料共培养10周，证实网状PLGA-胶原材料可以促进MSCs的聚集，并为MSCs向软骨细胞方向分化提供有利的微环境。也有学者通过细胞与材料共培养的方式进行材料制备浓度对细胞分化影响的研究[8]、观察人间充质干细胞在磷酸三钙硅酸盐支架的生长情况[9]、检测聚亚胺酯支架材料的细胞毒性[10]、评价人脂肪干细胞在脱细胞基质上的增殖和分化情况[11]等。本实验通过直接接触观察细胞的生长状态，24 h 见细胞生长为长梭形，多角形；72 h 细胞伸展良好，多为长梭形，细胞材料共培养生长正常，未见细胞脱落，溶解等异常现象。有研究认为材料的孔隙率和表面的粗糙程度与细胞的黏附有关，孔隙之间相互连通，新生组织通过材料孔壁爬行向孔内生长，这是多孔支架材料促进组织快速长入的重要因素，本材料孔隙率达68.5%，平均孔径为47 μm，10~50 μm 之间的孔径约占总孔径分布的83.23%，材料的多孔结构使细胞易于长入，而营养物质也易于运输。24 h 可见细胞液渗入材料，与材料嵌合良好，72 h 可见细胞密度增大，在材料中分布均匀，生长良好，提示脱细胞软骨支架材料适合种子细胞的黏附，生长和增殖。而材料表面粗糙程度在60~100 nm 之间时被认为最有利于细胞的生长、黏附和繁殖[6]。
影响细胞材料复合效果不仅需要材料有良好的细胞相容性，还有细胞在材料上的贴壁率和黏附后的继续分裂、增殖及发挥生理功能。于是采用有效合适的接种方法就显得尤为关键，通常使用的细胞与支架的接种技术有：浸渍法、沉淀法、吸附法、凝胶法和动态培养系统等[5]。本实验根据BMSCs的贴壁特性和ACM的多孔结构，选择最为常用的沉淀法，操作简便。为了减少细胞悬液漏出和细胞间由于浓度差导致的细胞分布不均匀，选择二次沉淀和细胞悬液培养的方法保证细胞接种密度。
3.2 材料体内降解实验 组织工程支架材料的理化性质（如形状、硬度、密度、表面光洁度和酸碱度等）、植入部位、体内移动等都可能影响到与周围组织的反应。而软骨修复领域中，组织工程软骨结构的完整性一直以来也是制约其临床应用的因素。降解速度过快，组织没有达到修复标准，支架的作用提前缺失；降解速度过慢，会阻碍身体自身组织的修复进程。动物体内埋植实验被认为是最为常用有效的检测生物相容性的方法学[12]，许多学者应用这种方法评价不同材料的生物相容性[13-16]。韩国的Jeon等[17]通过人耳软骨细胞与PLGA和壳聚糖分别复合制备工程软骨，将其埋植于裸鼠皮下并在不同时间进行观察，发现PLGA组4周可见成熟软骨，但是16周降解完全；而壳聚糖组8周可见成熟软骨，较PLGA组降解速度慢，更适合作为软骨支架。但是Li等[18]将HTB-94细胞分别复合壳聚糖-海藻酸钠支架与壳聚糖支架后进行体外培养，研究发现在第2~3周期间，壳聚糖-海藻酸钠支架组检测Ⅱ型胶原表达增加，而壳聚糖支架组反而减低。还有学者借助体内降解实验进行材料降解性测试[19]、将材料细胞复合物埋植于动物皮下观察材料的成骨诱导能力[20]。本实验将SD大鼠BMSC与ACM复合后进行组织学观察，14 d 可见试样周围存在少量淋巴细胞和嗜中性粒细胞，纤维囊壁致密，将复合细胞的材料包裹，细胞均匀散在材料中呈椭圆形，可见分裂相。28 d可见试样周围极少量淋巴细胞，纤维囊壁变薄，材料大多被降解为细小颗粒状。依据降解结果观察及评定标准，细胞材料复合物皮下植入实验结果符合要求。
通过对材料体内降解性和材料细胞共培养的有关实验观察，可以认为ACM具有良好的细胞相容性和体内降解性，为脱细胞软骨生物支架材料应用于软骨组织工程提供理论依据。

4 参考文献

1 Kim MS，Ahn HH，Shin YN，et al. An in vivo study of the host tissue response to subcutaneous implantation of PLGA- and/or porcine small intestinal submucosa-based scaffolds. Biomaterials 2007；28(34)：5137-5143
2 Yao KD, Yin YJ. Beijing: Chemical Industry Press 2003
姚康德，尹玉姬.组织工程相关生物材料[M].北京：化学工业出版社，2003
3 Santucci RA，Barber TD. Resorbable extracellular matrix grafts in urologic reconstruction. Int Braz J Urol 2005；31(3)：192-203
4 ISO 10993-5：1999 Biological evaluation of medical devices-Part5：Test for in vitro cytotoxicity
5 Pei GX. Beijing：Renmin Junyi Chubanshe 2006
裴国献.组织工程学试验技术[M].北京：人民军医出版社，2006
6 Wei G，Ma PX. Structure and properties of nano- hydroxyapatite/ polymer composite scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials 2004；25(19)：4749-4757
7 Chen G，Liu D，Tadokoro M，et al. Chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells cultured in a cobweb-like biodegradable scaffold. Biochem Biophys Res Commun 2004；322(1)：50-55
8 Hui TY，Cheung KM，Cheung WL，et al. In vitro chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells in collagen microspheres：Influence of cell seeding density and collagen concentration. Biomaterials 2008；29(22)：3201-3212
9 Bjerre L，Bunger CE，Kassem M，et al. Flow perfusion culture of human mesenchymal stem cells on silicate-substituted tricalcium phosphate scaffolds. Biomaterials 2008；29(17)：2616-2627
10 Guelcher SA，Srinivasan A，Dumas JE，et al. Synthesis，mechanical properties，biocompatibility，and biodegradation of polyurethane networks from lysine polyisocyanates. Biomaterials 2008；29(12)：1762-1775
11 Flynn LE，Prestwich GD，Semple JL，et al. Proliferation and differentiation of adipose-derived stem cells on naturally derived scaffolds. Biomaterials 2008；29(12)：1862-1871
12 Moretti Neto RT，Mello I，Moretti AB，et al. In vivo qualitative analysis of the biocompatibility of different cyanoacrylate-based adhesives. Braz Oral Res 2008；22(1)：43-47
13 Costa CAS，Marchesi M，Benatti Neto C，et al. Compatibilidade biológica de materiais odontológicos fotopolimerizáveis e quimicamente ativados，utilizados como forradores cavitários (Time Line e Hidro C). Rev Odontol UNESP 1995；24(1)：29-37
14 Costa CAS，Hebling J，Gonzaga HFS，et al. Avalia??o comparativa da toxicidade do adesivo dentinário All Bond 2 e do cimento de óxido de zinco e eugenol，quando implantados no tecido conjuntivo subcutaneo de ratos. Rev Fac Odontol Porto Alegre 1996；37(2)：3-6
15 Costa CAS，Hebling J，Teixeira MF. Estudo preliminar da compatibilidade biologica dos adesivos dentinarios All-Bond 2 e Scotchbond Multi Purpose：avaliacao histologica de implantes subcutaneo em ratos. Rev Odontol Univ Sao Paulo 1997；11(1)：11-18
16 Gomes APM，Ribeiro JF，Nogueira TO. Avalia??o da biocompatibilidade de dois adesivos dentinários pelo estudo das rea??es teciduais em conjuntivo de ratos. Rev Odontol UNESP 1996；25：135-144
17 Jeon YH，Choi JH，Sung JK，et al. Different effects of PLGA and chitosan scaffolds on human cartilage tissue engineering. J Craniofac Surg 2007；18(6)：1249-1258
18 Li Z，Zhang M. Chitosan-alginate as scaffolding material for cartilage tissue engineering. J Biomed Mater Res A 2005；75(2)：485-493
19 Wang Y，Rudym DD，Walsh A，et al. In vivo degradation of three-dimensional silk fibroin scaffolds. Biomaterials 2008；29(24-25)：3415-3428
20 Dawson JI，Wahl DA，Lanham SA，et al. Development of specific collagen scaffolds to support the osteogenic and chondrogenic differentiation of human bone marrow stromal cells. Biomaterials 2008；29(21)：3105-3116