Influence of liquid nitrogen preservation time on the morphology and mechanical characteristics of acellular vessel matrix
Chi Yi-fan, Lin Ming-shan, Sun Long, Hou Wen-ming, Sun Zhong-dong, Niu Zhao-zhuo, Sun Yong, Sheng Wei

Abstract
BACKGROUND: As a natural scaffold biomaterial, acellular tissue matrix deserves further experiences for its clinical application, and the effect of preservation condition has attracted more and more attention.
OBJECTIVE: To observe the influence of liquid nitrogen preservation time on the morphology and mechanical characteristics of acellular vessel matrix.
DESIGN, TIME AND SETTING: A randomized control observation was completed in the Laboratory of Cardiovascular Surgery, Qingdao Municipal Hospital (Qingdao, Shandong, China) between August 2007 and May 2008.
MATERIALS: Ten New Zealand rabbits weighing 550-600 g were used to prepare acellular vessel matrix.
METHODS: Trypsin, hypertonic solutions and chemical detergent were applied for a multistep process to carry out the preparation of acellular vessel matrix from rabbit thoracic aorta. According to the liquid nitrogen preservation time, the vascular specimens were divided into four groups randomly, namely fresh group, 1 month group, 2 months group and 3 months group. Fresh group was not subjected to liquid nitrogen preservation.
MAIN OUTCOME MEASURES: Specimens were detected by hematoxylin-eosin stain and observed by scanning electron microscope for the mechanics test, including Lagrange strain, Lagrange stress, extension ratio and ultimate stress.
RESULTS: Hematoxylin-eosin stain results showed that, collagen fiber and elastic fiber in the acellular vessel matrix of fresh group retained the previous morphology and mesh structure, the cells were almost removed. Under scanning electron microscope, the collagen fiber of both groups was intact without fragmentation, showing a mesh or porous structure. The porosity was also identical between the two groups, (100-150)×(10-20) μm. There were no obvious differences between liquid nitrogen groups and fresh group in the morphology and mechanical characteristics (P > 0.05).
CONCLUSION: There are no obvious influence in the morphology, histology and mechanical characteristics of acellular vessel matrix by the different liquid nitrogen preservation time.

Chi YF, Lin MS, Sun L, Hou WM, Sun ZD, Niu ZZ, Sun Y, Sheng W.Influence of liquid nitrogen preservation time on the morphology and mechanical characteristics of acellular vessel matrix.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(27):5235-5238 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-27/27k-5235(ps).pdf]

摘要
背景：血管脱细胞组织基质作为天然生物支架材料的制备与临床应用具有一定的时差，保存条件对其影响逐渐收到人们重视。
目的：拟观察不同液氮保存时间对脱细胞血管基质支架材料组织形态及力学特性的影响。
设计、时间及地点：随机分组设计，对比观察，于2007-08/2008-05在青岛市市立医院心脏外科实验室完成。
材料：健康新西兰兔10只，体质量550~600 g，用于制备脱细胞血管基质。
方法：采用胰蛋白酶、低渗溶液、化学除垢剂法处理兔胸主动脉制备脱细胞血管基质。根据液氮保存时间的不同将制取的血管随机分为液氮1月组，液氮2月组和液氮3月组；另设新鲜组：未用液氮保存而作为对照。
主要观察指标：苏木精-伊红染色、扫描电镜观察各组脱细胞血管基质形态变化，并作力学测试，包括Lagrange应变、Lagrange应力、伸长比和极限应力。
结果：苏木精-伊红染色可见新鲜组血管脱细胞组织基质中胶原纤维和弹性纤维保持原来的形态和结构，呈网状排列，细胞已基本去除。液氮保存组光镜下见与新鲜组无明显差异。扫描电镜见新鲜组血管脱细胞组织基质的纤维结构完整，胶原纤维无断裂，为网状和多孔状，孔径为（100~150）×（10~20）μm。液氮保存组胶原纤维结构完整，呈网状排列，胶原纤维无断裂现象，孔径与新鲜组无明显差异。各组力学指标相比，差异无显著性意义（P > 0.05）。
结论：不同液氮保存时间对脱细胞血管基质的形态学、组织学以及力学特性方面没有明显影响。
关键词：脱细胞基质；主动脉；胰蛋白酶；除垢剂

池一凡，林明山，孙龙，侯文明，孙忠东，牛兆倬，孙勇，生伟.液氮保存时间对脱细胞血管基质支架材料组织形态及力学特性的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(27):5235-5238
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-27/27k-5235(ps).pdf]

>>本文导读<<

课题背景：课题受青岛市科技局基金项目(06-2-2-6-nsh)资助。血管脱细胞基质因其特有的优点作为生物支架材料的研究越来越受到重视。但支架的制备与临床的应用具有一定的时差，低温保存对制备支架有无影响？不同保存时间对脱细胞血管基质又有何影响等问题尚需进一步实验加以证实。

偏倚或不足：电镜的制作技术可能造成脱细胞血管基质组织形态上的差异，所以在制作上应严格按照要求进行，并且尽量包括管壁的全层，以减少组织形态上的偏倚。

临床应用性：结果显示采用液氮保存组织工程血管支架材料，其组织学和力学特性方面与新鲜组没有明显差别。使用液氮保存组织工程血管，可以有充足的时间培养种子细胞和细胞种植联合培养，不受取材时间的限制，收治患者可随时择期手术，可以不考虑组织相容的问题。

0 引言

目前，应用组织工程技术制备血管移植材料是血管移植手术研究的热点[1-2]。组织工程血管的制备主要包括血管支架材料的研制、体外细胞培养和种植。可以用作为组织工程血管的支架材料主要有体内可降解的人工合成材料和天然组织中制备获得的材料。前者如聚乙二醇酸、聚丙醇酸等，有较好的生物相容性、可塑性和可降解性，但其工艺复杂。后者如血管脱细胞组织基质(Acellular tissue matrix，ACTM)因含有特殊氨基酸序列等[3]，可促进细胞吸附或保留分化功能，因此作为天然生物支架材料逐渐受到人们重视。可作为种子细胞的有内皮细胞、内皮祖细胞、平滑肌细胞和自体骨髓细胞等[4-8]。本文采用酶、低渗溶液和化学除垢剂相结合的方法制备兔主动脉脱细胞血管基质，通过观察各组脱细胞血管基质组织形态变化，并作力学测试，进而确定不同液氮保存时间对脱细胞血管基质有无影响。

1 材料和方法

设计：随机分组设计，对比观察。
时间及地点：实验于2007-08/2008-05在青岛市市立医院心脏外科实验室完成。
材料：健康新西兰兔10只，2月龄，体质量550~600 g，由青岛市实验动物和动物实验中心提供（动物合格证号：SCXK(鲁)20010010）。
主要试剂及仪器：1.25 g/L 胰蛋白酶、1%TritonX-100、1%十二烷基硫酸钠、磷酸盐缓冲溶液、Hank’s液工作台、恒温振荡器、光学显微镜、扫描电镜、透射电镜、生物力学实验机(CK-SWD10)等均由Sigma公司提供。
实验过程：
动物血管采取：耳缘静脉空气注射将动物致死，无菌条件开胸取其胸主动脉，长80~ 100 mm，直径3.0~3.5 mm，置入培养皿中，加入Hank’s液中冲洗干净，用眼科剪、镊剥去外层结缔组织、轻柔剥除外膜。
细胞脱除：将获取的血管放入15 mL 离心管中，处理过程如下：加入含双抗的1.25 g/L 胰蛋白酶6~8 mL，作用4 h，然后用PBS冲洗 3次，无菌去离子水作用12 h，1%TritonX-100溶液作用24 h，PBS冲洗3次，无菌去离子水作用4 h，最后用1%SDS作用24 h，PBS冲洗3次，含双抗的Hank’s液冲洗4 h 后保存。以上步骤均在37 ℃ 恒温振荡器中持续振荡。
实验分组：根据液氮保存时间的不同将制取的血管随机分为液氮1月组，液氮2月组和液氮3月组；另设新鲜组：未用液氮保存而作为对照；每组10个标本。用体积分数为0.1的甲醛固定，苏木精-伊红染色，体积分数为0.02的戊二醛固定作扫描电镜观察其形态学、组织学方面的差异。
力学测试：实验在生物力学实验机(CK-SWD10)上进行，测量并计算各组血管的Lagrange应变、Lagrange应力(MPa)、伸长比和极限应力(N)。
主要观察指标：苏木精-伊红染色、扫描电镜观察各组脱细胞血管基质形态变化，并作力学测试。
设计、实施、评估者：实验设计为第一作者，干预实施为第二作者，评估为第三作者。经过正规培训，采用双盲法评估。
统计学分析：由第四作者采用SPSS 10.0软件包利用方差分析法完成统计处理，不同组间的两两比较用Scheffe法，实验数据以x(_)±s表示。

2 结果

2.1 大体观察 新鲜组血管剥除外膜后，管壁弹性良好，管腔无塌陷，内膜面光滑完整。脱细胞处理后，呈乳白色，管壁无破损，管腔无塌陷。液氮保存组均呈乳白色，管壁无破损，管腔无塌陷。
2.2 苏木精-伊红染色观察 新鲜组血管脱细胞组织基质苏木精-伊红染色光镜观察，可见脱细胞组织基质中胶原纤维和弹性纤维保持原来的形态和结构，呈网状排列，细胞已基本去除。液氮保存组光镜下见与新鲜组无明显差异，见图1。

2.3 扫描电镜观察 新鲜组血管脱细胞组织基质扫描电镜可见基质的纤维结构完整，胶原纤维无断裂，为网状和多孔状，孔径（100~150）×（10~20）μm。液氮保存组胶原纤维结构完整，呈网状排列，胶原纤维无断裂现象，孔径与新鲜组无明显差异，见图2。

2.4 各组力学测试指标的变化 见表1。

2.5 可能影响结果的因素分析 实验中兔的大小和血管取材的部位可影响血管壁的厚度，进而影响力学测试结果，因此实验中兔体质量在550~600 g 之间，均取自胸主动脉，制备脱细胞血管基质后采用随机分组，盲法评估，这就减少了力学测试的偏倚。有文献报道浓度为0.1%的SDS制备脱细胞血管基质时就具有明显的细胞毒性[9]，本文中使用1%的SDS制备脱细胞血管基质可能对其造成影响，由于本实验的侧重点是不同液氮保存时间对脱细胞血管基质的形态学、组织学以及力学特性方面没有明显影响，为了减少对测试指标影响，实验中先用胰酶对血管壁中的某些基质进行溶解及对细胞的完整性加以破坏，然后用低渗溶液进一步导致细胞溶胀、破裂[10]，将SDS放在最后，是因为SDS为离子型去垢剂，脱细胞效果强，短时间内大量细胞破裂后释放的蛋白酶较多，从而引起较多的蛋白纤维损伤，影响血管的结构和力学特性，故让柔和的非离子型去垢剂Triton X-100先去除部分细胞及内在的蛋白酶，使细胞内的蛋白酶不至于短时间内大量释放，并用低渗溶液进一步破坏细胞，从而减少对血管基质结构和力学的影响[11]。

3 讨论

目前，血管脱细胞组织基质已应用于膀胱、骨、软骨[12-15]的重建。1990年，Wilson等[16]应用除垢剂-酶联合提取法将狗颈总动脉进行处理，制备出血管脱细胞组织基质，经多步骤的脱细胞处理，组织中的可溶性蛋白及细胞成分被除去，保留下来的是具有完整外观形态和组织学及超微结构的不可溶成分，主要包括胶原、弹性蛋白、氨基葡聚糖、结构蛋白等。脱细胞的方法主要有酶消化法和去污剂法。本实验采用2种方法的结合处理兔胸主动脉。先用胰酶对血管壁中的某些基质进行溶解和对细胞的完整性加以破坏，然后用低渗溶液进一步导致细胞溶胀、破裂，TritonX-100通过其上的亲水基团而溶解细胞膜，清除部分蛋白酶，最后用SDS进一步脱除细胞。
实验结果证明，细胞被彻底清除，胶原纤维、弹性纤维排列正常，结构完整。组织工程血管是理想的临床应用移植材料，其特点如下：①合适的三维多孔且内部贯通的网络结构以适应细胞的生长、养分的输送和代谢产物的排放[17]。②良好的生物相容性和表面活性。③良好的细胞亲和性，合适的表面化学以适合细胞附着，增殖和分化[18-19]。④不引起机体的免疫排斥反应。⑤具有良好的可塑性和机械强度。⑥材料来源广泛，易于快速加工[20]、灭菌、消毒等优点，备受广大外科临床工作者的青睐。
本实验通过使用液氮保存组织工程血管，有充足的时间培养种子细胞和细胞种植联合培养，不受取材时间的限制，收治患者可随时择期手术，可以不考虑组织相容的问题。实验结果表明采用液氮保存组织工程血管支架材料，其组织学和力学特性方面与新鲜组没有明显差别。

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