Constructing tissue engineered cartilage with silk fibroin compound bone marrow mesenchymal stem cells
Miao Zong-ning, Pan Yu-hong, Zhu Jian-zhong, Qian Han-guang, Zhao Ji-dong

Abstract
BACKGROUND: Silk fibroin has been proved to be a good scaffold of three-dimensional culture of the cells.
OBJECTIVE: To explore the feasibility of repairing the articular cartilage defects using silk fibroin with bone marrow mesenchymal stem cells.
DESIGN, TIME AND SETTING: This study was a randomized control animal experiment and completed in Jiangsu Blood Fluke and Parasitosis Prevention and Cure Institute from August 2006 to November 2007.
MATERIALS: Full-thickness defects in the femoral condyles were established in 27 New Zealand adult rabbits, which weighing 1.5-2.0 kg and irrespective of the genders. Silk fibroin was provided by Professor Li Ming-zhong from Materials College of Soochow University.
METHODS: Rabbit bone marrow mesenchymal stem cells were isolated, cultured and induced to differentiate into chondrocytes, which were then cultured with silk fibroin membrane to create the defects in the femoral condyles of rabbit knee joints. Twenty-seven rabbits were divided into three groups at randomly, and every group contain nine rabbits. The compound group was implanted with cell/silk fibroin compound; Silk fibroin group was only implanted with silk fibroin; Blank group was left untreated.
MAIN OUTCOME MEASURES: The growth condition of chondrocytes was observed by scanning electron microscope. The animals were sacrificed in 4, 8 and 12 weeks after operation, respectively to observe the reparation condition.
RESULTS: The induced bone marrow mesenchymal stem cells grew well on silk fibroin membrane. In the compound group, chondrocyte-like cells emerged in rabbit knee joints and extracellular matrix was extremely rich in 8 weeks; The color of repaired tissues was closed to surrounding cartilage. There was no evidence of the residue of silk fibroin and the infiltration of lymphocytes or leukocytes in 12 weeks specimens, and no obvious deterioration as well. In the silk fibroin group, defects were repaired with cartilago fibrosa and the defects were no repaired in the blank group.
CONCLUSION: The method of repairing the full-thickness hyaline cartilage defects using silk fibroin with bone marrow mesenchymal stem cells is feasible, and the silk fibroin can be used as scaffold materials in articular cartilage tissue engineering due to good biocompatibility.

Miao ZN, Pan YH, Zhu JZ, Qian HG, Zhao JD.Constructing tissue engineered cartilage with silk fibroin compound bone marrow mesenchymal stem cells.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(27):5243-5247
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-27/27k-5243(ps).pdf]

摘要
背景：一些研究已证明丝素蛋白是细胞立体培养的良好支架。
目的：拟观察丝素蛋白作为支架材料复合骨髓间充质干细胞修复关节软骨缺损的可行性。
设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2006-08/2007-11在江苏省血吸寄生虫病防治研究所完成。
材料：新西兰大白兔27只，雌雄不拘，体质量1.5~2.0 kg，制备关节全层软骨缺损模型；丝素蛋白材料由苏州大学材料学院李明忠教授提供。
方法：分离培养并定向诱导兔骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞，与丝素蛋白膜材料复合培养，建立兔膝关节股骨髁间软骨缺损。27只大白兔随机抽签法分为3组，每组9只。复合组植入细胞/丝素蛋白材料复合物；丝素蛋白组植入单纯丝素蛋白材料，空白组不行任何植入。
主要观察指标：扫描电镜观察细胞在材料上的生长情况；4，8，12周时取材观察软骨缺损修复情况。
结果：骨髓间充质干细胞诱导后在材料上生长良好。骨髓间充质干细胞与丝素蛋白复合8周后，在兔膝关节内即形成软骨样细胞，且细胞外基质非常丰富，12周后与周围软骨色泽相近，表面光整，支架材料基本吸收，未见明显退变和淋巴细胞或白细胞浸润，所有标本均未见丝素蛋白残留。丝素蛋白组呈纤维软骨样修复，空白组基本没有修复。
结论：用丝素蛋白复合骨髓间充质干细胞可形成透明软骨修复动物膝关节全层软骨缺损，显示了丝素蛋白材料作为关节软骨组织工程支架材料的良好生物相容性。
关键词：丝素蛋白；骨髓间充质干细胞；软骨；组织工程

苗宗宁，潘宇红，祝建中，钱寒光，赵基栋.丝素蛋白支架材料复合骨髓间充质干细胞构建组织工程化软骨[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(27):5243-5247 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-27/27k-5243(ps).pdf]

>>本文导读<<

重要的概念：软骨组织工程是在体外培养、扩增软骨种子细胞，并且以较高浓度将其种植于具有良好生物相容性和降解性的合适支架材料上构建组织工程软骨，然后，植入组织缺损部位，完成组织的修复和重建。软骨组织工程产品进入临床应用，还存在一些障碍需要克服，其中大规模的优良种子细胞及性能良好的支架材料的选取是当前面临的两个关键性制约因素。

同行评价：实验表明经诱导的间充质干细胞与丝素蛋白复合在体内环境下，可形成透明软骨修复动物膝关节全层软骨缺损，为临床上简便，快捷的修复软骨缺损提供了基础。

偏倚或不足：由于兔子的体质差异，分离培养的细胞存在差异。而长期饲养也对兔子的生长产生不同的影响，对于结果的评判产生干扰。

0 引言

关节软骨无血液供应和神经支配，损伤后几乎不能自发修复，目前的常用治疗方法都存在不同程度的问题。随着生命科学和工程学的发展，组织工程应运而生，构建生物特性与正常关节软骨相似的组织工程软骨是目前组织工程研究的热点之一。
“蚕丝”是指由家(桑)蚕纺制的蛋白长丝，是人类最早利用的天然蛋白纤维。蚕丝由丝素和丝胶2种蛋白质组成。其中丝素蛋白是蚕丝的主要成分，约占75%左右，由18种氨基酸组成，其中甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)和丝氨酸(Ser)是组成丝素的主要氨基酸。
为了探讨丝素蛋白的组织相容性，许多学者将丝素蛋白或改性后的丝素蛋白移植动物体内，观察其引起的全身对外来物质的反应性(Foreign bodyreaction，FBR)，包括炎症反应、纤维化的形成、网状组织的生成等。蚕丝水解蛋白非结晶区有许多碱性氨基酸，与胶原蛋白一样，对体外培养的动物细胞有良好的吸附作用，对维持细胞功能也有重要作用。从不同角度进行的检测结果表明：丝素蛋白无毒性、无刺激作用、无过敏性，具有良好的生物相容性和表面活性，是细胞立体培养的天然支架。
骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）具有易于分离以及广泛的可塑性等特点，在自体或异体细胞治疗中成为理想的工具。国外应用BMSCs治疗成骨不全和脂肪软骨营养障碍的临床试验结果验证了移植BMSCs的作用[1-3]。
转化生长因子β（Transformation growth factor beta，TGF-β）是一族多肽类生长因子，胚胎形成期可诱导原始的间充质干细胞分化形成软骨组织[4]。由于TGF-β3和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)可促进软骨细胞的代谢和增殖，因此本文采用TGF-β3对人骨髓间充质干细胞进行诱导培养，观察BMSCs在体外分化为软骨细胞的能力，并探讨丝素蛋白材料复合BMSCs修复兔膝关节软骨缺损的可行性。

1 材料和方法

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：实验于2006-08/2007-11在江苏省血吸寄生虫病防治研究所完成。
材料：新西兰大白兔27只，雌雄不拘，体质量1.5~ 2.0 kg，由江苏省血吸寄生虫病防治研究所提供（动物合格证号：SCXK2002-0006）。丝素蛋白材料由苏州大学材料学院李明忠教授提供。

实验过程：
兔BMSCs分离培养：无菌条件下于新西兰兔股骨大转子处抽取骨髓，肝素抗凝，D-Hank’s液稀释(V∶V= 1∶1)，缓慢加在一半体积的Ficoll分离液上，600 g 离心15 min，收集界面层细胞，D-Hank’s液洗1遍，调整细胞浓度为1×108 L-1，接种于25 cm2 的培养瓶，培养基为DMEM+1%Penicillin-Streptomycin+5μg/L bFGF+ 10%FBS，置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2、饱和湿度静置培养。细胞密度达到70%融合后用2.5 g/L 胰蛋白酶消化，1瓶分3瓶的比例传代培养。
兔BMSCs诱导分化：取培养2代细胞，用2.5 g/L 胰蛋白酶消化后调节细胞浓度为1×108 L-1，接种于培养板，培养基为DMEM/F12＋10%胎牛血清+10 μg/L TGF-β3+0.1 μmol/L 地塞米松+0.17 mmol/L 抗坏血酸，常规培养14 d，每2天半量换液1次。
诱导细胞免疫组织化学染色分析：培养细胞在诱导分化7 d 后采用常规方法免疫细胞化学染色。贴壁细胞去培养基，用PBS洗3次，经40 g/L 多聚甲醛固定30 min，PBS洗涤3次，0.3%TritonX-100处理20 min，PBS漂洗 3次，10%羊血清室温封闭20 min，吸出血清，加入鼠抗兔Ⅱ型胶原单克隆抗体，37 ℃ 孵育2 h 后PBS洗3次，加入羊抗鼠二抗(1∶500)孵30 min，显色后在显微镜下观察。甲苯胺蓝染色在细胞固定后直接加10%染色工作液室温染5 min，PBS漂洗后镜下观察。
细胞与材料复合培养：兔BMSCs的诱导分化条件与人BMSCs的相同，收集诱导后的兔BMSCs调整浓度为 1×1011 L-1，先加100 μL 培养基于24孔板的孔底，放入材料，向材料表面加100 μL 细胞悬液，在37 ℃、体积分数为0.05的CO2、饱和湿度环境中静置培养2 h，取出后翻转，向另一面加100 μL 细胞悬液，静置培养2 h，加入培养基没过材料，置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2、饱和湿度静置培养。培养液每3天换新液。
扫描电镜观察：材料复合细胞培养后于1，4，8 d 各取1块标本，2%戊二醛固定，锇酸染色，梯度脱水，喷金，扫描电镜上观察摄像。
模型制备：取新西兰大白兔，戊巴比妥钠耳缘静脉注射麻醉后仰卧固定四肢。取双侧膝关节内侧弧形切口，髌骨翻向外侧，暴露股骨内髁负重区，用直径5 mm 圆形钻头钻孔深3 mm，当钻透软骨下骨时略有阻力感，即停止钻入，可见新鲜血液溢出，制成关节全层软骨缺损模型。
干预分组：27只大白兔随机抽签法分为3组，每组9只。复合组植入细胞/丝素蛋白材料复合物；丝素蛋白组植入单纯丝素蛋白材料，空白组不行任何植入。术后不限制活动，标准饲料单笼饲养。于术后第4，8，12周各处死3只动物，取双膝关节行大体、组织学观察。
主要观察指标：扫描电镜观察细胞在材料上的生长情况；4，8，12周时取材观察软骨缺损修复情况。
设计、实施、评估者：实验设计为第一作者，干预实施为第二作者，评估为第三、四、五作者。经过正规培训，采用盲法评估。

2 结果

2.1 实验动物数量分析 纳入新西兰大白兔27只，均进入结果分析，无脱落。
2.2 兔BMSCs分离培养 骨髓经密度为1.073 g/mL 的Percoll离心分层后，单核及有核细胞较易吸出，原代培养4 h 后可见有贴壁细胞，静置培养48 h 后换液，可去除死细胞及其他悬浮生长的细胞，倒置显微镜观察可见贴壁细胞呈克隆样生长，细胞形态多为不规则鳞片状，胞体大，核居中，一般1周左右可长满瓶底，见图1。

传代后生长迅速，3~5 d 可长满瓶底，见图2。

2.3 BMSCs的诱导分化及染色结果 诱导前细胞呈典型的成纤维样间充质细胞形态，诱导7 d 以后，胞体逐步回缩，立体感增强，免疫组织化学染色结果显示，Ⅱ型胶原抗体不同程度阳性，甲苯胺蓝染色结果亦为阳性。
2.4 BMSCs与丝素蛋白材料复合培养扫描电镜观察 单纯材料扫描电镜观察可见其表面不规则，孔隙较多，细胞复合培养后，材料表面及孔隙内均有细胞附着。

1 d 时:
材料表面有少数细胞贴附，细胞表面有微绒毛突起，多数有数根微丝与材料相连；

4 d 时:
材料上细胞伸展增殖，细胞表面及周围见颗粒状、丝状基质物质；

8 d 时:
材料上细胞形态、数量变化不大，分泌的颗粒状、网状基质物质增多，材料间隙被基质填满。

2.5 大体形态观察 术后3 d，所有实验兔均稍跛行，膝关节轻度肿胀，伤口愈合好，无感染、渗液，活动减少，以后则肿胀逐渐消退，活动逐渐增加，10 d 左右活动自如，在大的饲养箱内随意活动。

复合组：
关节液呈淡黄色透明澄清液，滑膜组织略增加，无明显充血，4周缺损已由半透明组织填充。8周修复组织外观与正常软骨相似，边界模糊，表面光滑。12周与周围软骨色泽相近，表面光整。

丝素蛋白组：
4，8周缺损区修复组织表面欠光整，部分仍呈空洞。12周为虫蚀样改变，色泽浅黄。

空白组：
4，8周为纤维样组织覆盖，仍有较大的空洞。12周缺损处被纤维组织占据，且大部分修复不全，明显凹陷缺损，与周围正常组织分界清晰。

2.6 组织学结果 复合组4周时修复细胞数目较少，表层修复细胞呈梭形，深层修复细胞呈圆形或椭圆形，可见软骨陷窝。8周时修复组织周围软骨大部分结合，修复细胞数目较多，以圆形透明软骨样细胞为主，有软骨陷窝，表层有梭形成纤维样细胞。12周时修复组织为透明软骨样，厚度接近正常，与周围软骨结合好，表层有梭形成纤维样细胞、软骨陷窝，深层软骨钙化，与底层骨结合紧密，见图3。

丝素蛋白组4，8周时修复细胞数目较少，细胞层次排列差。12周时修复组织厚度接近正常，呈纤维软骨样，见图4。

空白组4，8周时缺损组织由薄层纤维组织覆盖。12周缺损区纤维组织进一步增厚，与周围软骨未结合，见图5。

3 讨论

骨髓间充质干细胞具有典型的干细胞特点，有多向分化潜能和强大的增殖能力，自体间充质干细胞取材方便，可利用间充质干细胞贴壁生长的特性将其分离纯化，而造血细胞在换液时逐步被清除[5]，便于自体移植，近年来在组织工程领域倍受重视并得到广泛研究[6-8]。Caplan等[9]认为自体间充质干细胞优于自体关节软骨细胞。间充质干细胞再现了胚胎的骨软骨形成过程，形成的软骨下骨板结构与宿主正常软骨下骨结构一致，而自体关节软骨细胞与宿主软骨间产生了应力不匹配，导致表层软骨纤维化，以致移植失败。Wakitani等[10]首先报道用间充质干细胞移植修复兔软骨缺损获得成功，表明间充质干细胞作为组织工程软骨的种子细胞效果良好，故本实验采用间充质干细胞作为关节软骨缺损研究的种子细胞。
组织工程软骨修复的设计多是将间充质干细胞经体外诱导后接种于聚乳酸和聚羟基乙酸共聚物等聚合物支架上，虽然取得了不同程度的修复效果[11]，但普遍存在细胞相容性及细胞黏附性不足，其酸性降解产物对细胞有一定的毒性[12]。胶原、透明质酸等天然生物材料为水溶性，与细胞的生物相容性良好，塑形容易，细胞和生长因子能与材料均匀混合，但机械性能较差，容易收缩变形[13]。因此，选择有利于种子细胞黏附、增殖和分化的生物支架材料是一个首要解决的问题[14-15]。
Dal等[16]体内实验证明，将三维的丝素蛋白置于小鼠皮下180 d 后观察，仍有少部分丝素蛋白存在于组织中。但被新生组织，包括上有引起轻微皮、血管等所填充。同时伴有少量的巨噬细胞和极个别的多核巨细胞。但没有T细胞的免疫反应发生，也没有纤维化的生成。通过免疫组织化学证实血管内皮细胞标志vWF的存在。这一体内实验结果与Panilaitis等[17]结果相吻合，即丝素蛋白的免疫惰性，从而证明丝素蛋白具FBR和长期的生物相容性这一特性。
Meinel等[18]将大鼠的BMSCs接种到丝素蛋白和经RGD修饰的丝素蛋白膜上，移植到大鼠的腰肌中，并以胶原作对照。6周后观察组织的局部反应，结果表明，丝素蛋白和经RGD修饰的丝素蛋白引起的FBR比胶原引起的轻微，在移植物的周围有成纤维细胞、胶原生成，有较少的巨噬细胞存在。从而证实了以纯化的丝素蛋白和经RGD修饰的丝素蛋白为支架以BMSCs作为种子细胞在组织工程中应用的可行性。有学者指出丝素蛋白与其他生物材料一样移植到体内引起的组织反应，与许多因素相关，例如移植的位置、移植物的大小、几何形状、移植材料的类型、纯度及宿主本身的条件等[19-20]，作为一个综合作用的结果。
本实验结果显示，BMSCs与丝素蛋白复合8周后，在兔膝关节内即形成软骨样细胞，且细胞外基质非常丰富，表明丝素蛋白确实有利于BMSCs在体内的增殖和分化，12周后与周围软骨色泽相近，表面光整，支架材料基本吸收，且动物状态良好，无死亡，提示丝素蛋白降解速度与软骨新生速度平衡，不会提前崩解。实验表明经诱导的BMSCs与丝素蛋白复合在体内的环境下，可形成透明软骨修复动物膝关节全层软骨缺损，为临床上简便，快捷的修复软骨缺损提供了基础。

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