Effect of degradable fibrin glue transmitting vascular endothelial growth factor on the neoangiogenesis of myocardial infarction tissues
Adila Azhati, Ma Xiang, Liu Fen, Chen Bang-dang, Ma Yi-tong

Abstract
BACKGROUND: Vascular endothelial growth factor (VEGF) may promote the neoangiogenesis of myocardial infarction (MI) tissues. However, it is inapplicable to transmit VEGF through the systemic intravenous infusion, and repeated direct myocardial injection induces the damage of normal myocardial structure.
OBJECTIVE: To approach the possibility of VEGF transplantation via degradable fibrin glue on promoting the neoangiogenesis in the MI and ischemic regions, and to observe the variation of heart function of rat models.
DESIGN, TIME AND SETTING: A randomized control animal experiment was carried out in the Coronary Heart Disease VIP Laboratory of the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University from January 2007 to April 2008.
MATERIALS: The recombination protein VEGF121 was constructed by using resin chromatography method to obtain VEGF fibrin glue. Twenty-eight SD rats of 9 weeks old were adopted in this study. Thirteen of them were processed into the ligation of left anterior descending coronary artery, taken as MI group, whereas other 15 animals received the opening of pericardium only, taken as non-MI group.
METHODS: Immediately following the induction of MI, the VEGF gel and blank gel in the MI group were transplanted into the infarct regions, while those of the non-MI group binded to the anterior wall of left ventricle, and another three rats were untreated, serving as the controls.
MAIN OUTCOME MEASURES: The heart function was detected by echocardialgraphy after 4 weeks posttransplantation, then the rats were sacrificed, and the harvested hearts were determined for the immunohistochemistry and blood vessel measurement analysis.
RESULTS: The capillary density of the rats transplanted with VEGF gel in the MI and non-MI groups was significantly higher than that in the blank gel group (P < 0.001); And the capillary density of ischemic region was significant higher than that of septum region (P < 0.01). VEGF gel transplantation could improve the heart function of the rats, but no significant differences were found (P =0.248 2).
CONCLUSION: The degradable materials can transplant VEGF to the non-MI and MI regions in rats, and regenerate obviously the capillary density; It is feasible to transmit vaso regeneration factor to myocardium using fibrin glue.

Adila Azhati, Ma X, Liu F, Chen BD, Ma YT.Effect of degradable fibrin glue transmitting vascular endothelial growth factor on the neoangiogenesis of myocardial infarction tissues.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(27):5253-5256 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-27/27k-5253(ps).pdf]

摘要
背景：血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）可促进梗死心肌血管再生，但经系统性静脉灌注来传递VEGF是无效的，反复直接心肌注射会损伤正常心肌结构。
目的：验证通过可降解材料纤维蛋白胶将VEGF移植到心肌梗死及缺血区域促进血管再生的可行性，并观察大鼠心功能的变化。
设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2007-01/2008-04在新疆医科大学第一附属医院冠心病VIP实验室完成。
材料：树脂色谱法纯化获得重组蛋白VEGF121，与纤维蛋白胶结合得到VEGF纤维蛋白胶。9周龄雄性SD大鼠28只，其中13只节扎冠状动脉左前降支制备心肌梗死模型为心肌梗死组，其余15只仅打开心包，不节扎左前降支者为为非心肌梗死组。
方法：心肌梗死组梗死即刻将空白或VEGF纤维蛋白胶移植到梗死区域，附着在梗死和缺血区；非心肌梗死组将空白或VEGF纤维蛋白胶附在相应的左室前壁，另有3只不处理做为对照。
主要观察指标：移植4周后经心脏超声行心功能检测，然后麻醉处死大鼠，取出心脏行免疫组化及血管测量分析。
结果：移植VEGF胶后，非心肌梗死和心肌梗死组大鼠的毛细血管密度显著高于空白胶组（P < 0.001）；心肌梗死组梗死附近缺血区毛细血管密度显著高于间隔区（P < 0.01）。移植VEGF胶后，大鼠心功能有改善的趋势，但差异无显著性意义(P =0.248 2)，
结论：通过可降解材料移植VEGF可使大鼠非心肌梗死区和心肌梗死心肌区的毛细血管明显增生；将纤维蛋白胶作为传递血管再生因子到心肌的介质是可行的。
关键词：纤维蛋白胶；内皮细胞生长因子；心肌梗死；移植；生物材料

阿迪拉?阿扎提，马翔，刘芬，陈邦党，马依彤.可降解材料纤维蛋白胶介导血管内皮细胞生长因子对心肌梗死组织血管再生的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，122(27):5253-5256
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-27/27k-5253(ps).pdf]

>>本文导读<<

课题背景：课题是新疆维吾尔自治区科技厅高新技术项目（200511110）。本实验是其子项目，主要目的是探讨通过可降解材料纤维蛋白胶将血管内皮细胞生长因子移植到心肌梗死及缺血区域促进血管再生的可行性，了解其促进左室心肌血管再生效应。

偏倚或不足：本文通过比较左室功能，观察到移植共价血管内皮细胞生长因子纤维蛋白胶后，心肌梗死模型大鼠心功能有好转的趋势，但统计学检验差异无显著性意义，可能是样本量较小的缘故，需要通过增加样本量来显示统计学意义。

同行评价：文章通过可降解材料将血管内皮细胞生长因子移植到心肌梗死区域，观察心肌梗死及缺血区域血管再生的效果及大鼠心功能的变化。立题新颖，思路清晰，实验设计合理，实验方法可靠，具有一定的应用意义。

0 引言

当心肌组织被损伤，正常的恢复反应是通过一系列复杂的过程，包括急性炎症反应、肉芽组织形成和最后的瘢痕形成[1-3]，结果因胶原质过多使肌纤维滑动致心室腔扩大和心室壁变薄，最终导致急性和充血性心力衰竭。将健康细胞移植到心肌损伤部位是当前最受关注的[4-5]。组织工程的三维支架材料可替代丢失和损伤的细胞外基质，对自我或对移植细胞提供支持避免或减少梗死区被移植的细胞被冲洗掉或死亡[6]，并通过微环境线索获得组织的再生和修复从而预防心力衰竭和改善心功能[7]。本文通过可降解材料纤维蛋白胶将血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）移植到心肌梗死及缺血区域，观察血管再生的可能性及大鼠心功能的变化。

1 材料与方法

设计：随机分组，动物实验。
单位：新疆医科大学第一附属医院。
材料：实验于2007-01/2008-04在新疆医科大学第一附属医院冠心病VIP实验室（万级）完成。选用体质量300~350 g的SPF级雄性SD大鼠28只，9周龄，由新疆医科大学实验动物中心（生产许可证 SCXK(新)2003-0001）提供。实验过程中动物处置符合动物伦理学标准。

实验方法:

VEGF纤维蛋白胶的制备—
构建重组蛋白VEGF121：
PCR扩增人的VEGF121基因，5'-末端引物为5'-GGG GGA TCC GCC TCC GAA ACC ATG AAC TT-3'，3'-末端引物为5'-CCC GAA TTC TCC TGG TGA GAG ATC TGG TT-3'
将VEGF121基因构建到pRSET 载体上。
进行目的蛋白的诱导、表达、纯化。

纤维蛋白胶的制作：
纤维蛋白原溶液由纤维蛋白原、ⅩⅢ因子、 CaCI2、凝血酶组成。
将重组蛋白VEGF121与纤维蛋白原溶液混匀后加入凝血酶。
将纤维蛋白聚合物放置在37 ℃潮湿环境中30 min。

纤维蛋白胶与重组蛋白VEGF121的结合：
取纤维蛋白原10 g/L、XIII因子 2 U/mL、CaCl2 2.5 mmol/L混合液 150 mg/L，将VEGF121 加入其中，然后加入凝血酶形成纤维蛋白聚合物，将其放置37 ℃潮湿环境中30 min。

大鼠心肌梗死模型的建立：将SD大鼠，放入麻醉诱导箱内，用4%-5%异氟烷麻醉，剔除胸腹毛，然后给予14 mm直径的导管行气管插管，继以70 r/min 2.5~3.0 mL的潮气量的呼吸机辅助呼吸给予空气中的氧，然后以1.5%~2%异氟烷持续麻醉。在无菌条件下行左侧肋间胸廓切开术。切开第4肋间，用小扩张器分开第4和第5肋间暴露心脏，切开心包，通过手术显微镜在左心耳和肺动脉流出道之间确定左前降支,用6-0聚丙烯线穿过心外膜在左前降支下1.0~2.0 mm处结扎阻断左前降支，当出现局部运动减少的白色区域为结扎成功。
大鼠分组处理流程：

主要观察指标：
心功能测定：移植后4周后应用心脏超声检查仪测定左室收缩期直径、左室舒张期直径和左室短轴缩短率。测量值取3个连续心动周期的平均值。
病理及免疫组化分析：移植后4周将大鼠麻醉后处死，取心脏。甲醛固定，然后蜡块包埋，制作心脏组织切片。每个心脏做60张切片，根据不同的需要行苏木精-伊红染色、抗CD31免疫组化染色及抗α-平滑肌肌动蛋白免疫组化染色（SMA），见图2。

取相：非心肌梗死组心脏取胶下和间隔区两个区域，分别采3张相片；心肌梗死组心脏在心肌梗死边缘缺血区和间隔区采相，同样各取3张相片。
心肌血管测量：计算机评估血管的形态。应用生物通用分析处理软件(美国Universal Imaging Corporation专业生物图像分析处理系列软件)对血管做定量的形态分析。通过3个参数来测量血管，即总的血管密度、总的血管数在心肌区域中的比例和总血管区的百分比。总的组织部分要去除白色空白区域来除外因不同原因所致的空白区域所造成的偏倚，然后从总组织区域中去除血管区域来确定心肌区域。评估VEGF血管。运用该软件直接将血管分成3组：毛细血管组（血管直径< 10 μm），微血管组 （10 μm≤血管直径≤20 μm），大血管组（血管直径> 20 μm），见图3。

设计、实施、评估者：均为作者，接受过正规培训。
统计学分析：使用Statistica 和Stata release 8-2软件包，结果表达为均数±标准差。不同组间检验使用变量的单因素方差分析和t检验（当组不独立时），以P < 0.05为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 血管测量结果 移植VEGF胶后，非心肌梗死和心肌梗死组大鼠的毛细血管密度显著高于空白胶组（P < 0.001）；移植VEGF胶后，心肌梗死附近缺血区毛细血管密度显著高于间隔区（P < 0.01），见图4。

2.2 心脏超声检测VEGF胶移植对心功能的影响 移植VEGF胶后，大鼠心功能有改善的趋势，但统计学差异无显著性意义(P=0.248 2)，可能与样本数量较少有关。

3 讨论

本文结果显示VEGF在心肌梗死和非心肌梗死心脏均有血管生成效应，而在心肌梗死心脏的心肌梗死边缘缺血区域有更显著的效果。其机制可能是：①在缺血组织内皮细胞产生的VEGF是上调的[8]，并且VEGF主要是通过副分泌和自分泌效应，当组织在缺氧状态下被激活，会促进自分泌并延长外源性VEGF的对内皮细胞的刺激反应[9]。②作为组织缺氧时内皮细胞的增生反应，内皮细胞可以通过利用血管生成因子产生更多的效应[9]。
本实验发现在新生血管中VEGF胶可明显促进毛细血管在梗死心脏缺血部位的增加。这与VEGF的生物学特性是一致的。比如，一个明显的内皮细胞的有丝分裂就是血管构成的最初的和主要的阶段，也是内皮细胞增生、迁移和生存的有效因素[10]。而尽管在VEGF胶组其他血管生成效应不显著，可能的原因是在时间选择上的4周不足以达到显著的有效性，而需要更长的时间来强化和巩固其效应。尽管有VEGF可促进小鼠动脉再生效应的报道[11]，但在本实验中记录到的大血管很少，VEGF胶组动脉效应也不显著，这可能是由于所采集的图像有限所导致的偏倚。有研究证实通过VEGF-A一过性过度表达后10 d，可以刺激心肌动脉再生，再加上毛细血管生长，VEGF在心肌梗死的缺血区对细动脉特别是对更小的动脉有明显的效应[11]。因此提出VEGF通过VEGF受体对平滑肌细胞的累积起直接的作用[12]。VEGF对动脉再生的可能性有待于进一步研究。
在本实验中，在大鼠心脏心肌未发现任何血管瘤和血管畸形，与其他相关报道一致[13]。因此，该实验条件对供养细胞所需而释放的VEGF没有有害的因素，可有效促进新生毛细血管水平。然而，本实验通过纤维蛋白胶根据细胞的需要控制了VEGF每个时间段释放的剂量。如Dor等[14]研究显示，VEGF过度表达的情况下，内生VEGF蛋白水平不能满足所有血管形成的需要，缺乏外源性的VEGF导致血管结构退化和不成熟。由于外周内皮细胞分解和死亡使得血管缺乏稳定性。因此本文结果显示，用外源性VEGF并将其以缓慢和低剂量释放供应，可诱导相对稳定的血管，4周后有血管再生效应。
本实验将空白胶与未处理组进行比较，结果显示总血管密度无显著性差异。因此得出结论即空白胶本身不能间接地促进血管再生，该纤维蛋白胶对组织本身无毒害作用[15]。在移植部位发现一些疏松的结缔组织，但经苏木精-伊红染色未发现组织纤维化，所以考虑这些组织可能是由于心包切开术、开胸术或缝合术所致。显微镜下观察发现移植纤维蛋白胶4周后无剩余的纤维蛋白胶，提示胶被完全降解并吸收。非心肌梗死大鼠心脏移植空白胶观察8周后仍未发现疏松的结缔组织。
有资料显示经系统性静脉灌注传递血管生成因子是无效的[16]。反复直接心肌注射会损伤和影响作为左室收缩和点活动基础的正常心肌结构，而通过可降解纤维蛋白胶附着物，可附着在心外膜，经观察是较安全和有害性少的。即通过小的胸廓切开术或通过胸腔镜术[17-18]，在临床上运用纤维蛋白胶传递血管生成因子用于治疗患者是可能的。由于心肌梗死后心肌组织破坏使得血管密度在梗死区域无法测得，因此在缺血外周组织区域促进血管形成较最终演变为瘢痕组织的梗死区域更有意义。
通过比较左室功能，尽管缺乏统计学意义，但观察到移植空白胶的梗死大鼠较VEGF胶者为低，在VEGF胶组有心功能好转的趋势，需要通过增加样本例数来显示统计学意义。

4 参考文献

1 Chachques JC, Trainini JC, Lago N,et al. Myocardial assistance by grafting a new bioartificial upgraded myocardium (MAGNUM clinical trial): one year follow-up. Cell Transplant 2007;16(9):927-934
2 Huang Q.Zhonghua Xiandai Yingxiang Xue Zazhi 2005;2(4):78
黄清.冠心病急性心肌梗死与左心室重构及心脏功能[J].中华现代影像学杂志,2005,2(4):78
3 Ertl G, Frantz S. Wound model of myocardial infarction. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2005;288(3):H981-983
4 Patel AN, Spadaccio C, Kuzman M,et al. Improved cell survival in infarcted myocardium using a novel combination transmyocardial laser and cell delivery system. Cell Transplant. 2007;16(9):899-905
5 Zhang Y,Li J.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu Yu Linchuang Kangfu 2007;11(11):2197-2200
张小勇,黎健,心肌梗死的干细胞治疗[J].中国组织工程研究与临床康复,2007,11(11):2197-2200
6 Zhang GT, Tan YZ,Wang HJ,et al. Effects of marrow-derived cardiac stem cell transplantation after myocardial infarction in rats Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi 2007;35(10):940-904
7 Davis ME, Hsieh PC, Grodzinsky AJ, et al. Custom design of the cardiac microenvironment with biomaterials. Circ Res 2005;97(1):8-15
8 Chen JG,Xu XH,Yao QS,et al.Fayi Xue Zazhi 2000;16（1）:6-7
陈建国,徐小虎,姚青松,等.VEGF免疫组化染色在冠心病猝死诊断中的应用[J]. 法医学杂志,2000,16（1）:6-7
9 Syed IS, Sanborn TA, Rosengart TK. Therapeutic angiogenesis: a biologic bypass. Cardiology 2004;101(1-3):131-143
10 Wang Y,Dong Y,Sun YB,et al.Jilin Yixue 2007;29（4）：436-438
11 王瑜，董宇，孙雅彬，等，Müller细胞分泌血管内皮生长因子影响因素的研究进展[J]. 吉林医学，2007，29（4）：436-438
12 Siddiqui AJ, Blomberg P, W?rdell E, et al. Combination of angiopoietin-1 and vascular endothelial growth factor gene therapy enhances arteriogenesis in the ischemic myocardium. Biochem Biophys Res Commun 2003;310(3):1002-1009
13 Ishida A, Murray J, Saito Y,et al. Expression of vascular endothelial growth factor receptors in smooth muscle cells. J Cell Physiol 2001;188(3):359-368
14 Xu JL.Zhonghua Shiyong Zhongxiyi Zazhi 2005；18（23）:1866-1867
徐建林.VEGF 表达及生成的调节因子研究现状[J].中华实用中西医杂志,2005,18（23）:1866-1867
15 Dor Y, Djonov V, Keshet E. Induction of vascular networks in adult organs: implications to proangiogenic therapy. Ann N Y Acad Sci 2003;995:208-216
16 Dvorak HF, Harvey VS, Estrella P,et al. Fibrin containing gels induce angiogenesis. Implications for tumor stroma generation and wound healing. Lab Invest 1987;57(6):673-86
17 Sato K, Wu T, Laham RJ, et al. Efficacy of intracoronary or intravenous VEGF165 in a pig model of chronic myocardial ischemia. J Am Coll Cardiol 2001;37(2):616-623
18 Wang JY,Fan HM,Liu ZM.Shanghai Yixue 2007;30(S1):63-64
汪进益,范慧敏,刘中民.建立适用于细胞移植研究的大鼠心肌梗死动物模型[J].上海医学 2007;30(S1):63-64