Effects of small volume hypertonic-hyperoncotic solution on neuron histology and function of hippocampus after cardiopulmonary resuscitation in rats
Xu Miao, Li Cai, Yang Yong, Yuan Shi-ying, Yao Shang-long, Huang Wen-qi

Abstract
BACKGROUND: In recent years, some researches show that small volume hypertonic-hyperoncotic solution (HHS) can play a protective role on global brain ischemia resuscitation in rats.
OBJECTIVE: To investigate the effect of HHS on the neuron histology and function of hippocampus at 72 hours after asphyxial cardiac arrest and cardiopulmonary resuscitation in rats.
DESIGN, TIME AND SETTING: Randomized control experiments were performed in the Department of Anesthesia, Union Hospital, Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology and the Department of Anesthesia in the First Hospital of Sun Yat-sen University (Guangzhou, Guangdong, China) from May 2004 to May 2007.
MATERIALS: HHS was supplied by Fresenius Company (Germany), comprising 7.2% NaCl and 6% hetastarch. Thirty-six SD rats were employed to induce asphyxial cardiac arrest and cardiopulmonary resuscitation models.
METHODS: Rats were randomly divided into 3 groups (n=12): sham operation, normal saline group and HHS group. Immediately after spontaneous circulation restoration, each group was injected with the corresponding solutions.
MAIN OUTCOME MEASURES: At 72 hours following spontaneous circulation restoration, the rat hippocampal neurons were observed and assessed using transmission electron microscope and terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dutp-FITC nick end labeling (TUNEL), and Caspase-3 activity assay was done by AMC. Rat hippocampal function was detected with maze method.
RESULTS: All 36 SD rats were involved in the final analysis. Delayed neuron apoptosis in the hippocampus was detectable in the normal saline group and HHS group. TUNEL-positive cells in the hippocampus were reduced and Caspase-3 expression on CA1 region was obviously lower of the HHS group compared to the normal saline group (P < 0.05), which indicated a decrease of rat exploring activities after cardiopulmonary resuscitation.
CONCLUSION: Immediately after spontaneous circulation restoration, small volume HHS can prevent Caspase-3 activation in CA1 region and inhibit the apoptosis of delayed neuronal apoptosis in hippocampus, which will play a protective role on the rat hippocampus.

Xu M, Li C, Yang Y, Yuan SY, Yao SL, Huang WQ.Effects of small volume hypertonic-hyperoncotic solution on neuron histology and function of hippocampus after cardiopulmonary resuscitation in rats.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(27):5334-5338
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-27/27k-5334(ps).pdf]

摘要
背景：近年来的一些研究表明小容量高晶体-高胶体渗透压混合液可能对脑缺血复苏时产生脑保护作用。
目的：观察小容量“高晶体－高胶体混合液”对窒息致心跳骤停心肺复苏后72 h大鼠海马神经元组织学变化的影响。
设计、时间及地点：随机分组设计、对照细胞学实验，于2004-05/2007-05在华中科技大学同济医学院附属协和医院麻醉科实验室及中山大学附属第一医院麻醉科完成。
材料：SD大鼠36只，采用窒息法制作大鼠心肺复苏模型。由7.2%氯化钠+6％羟乙基淀粉组成的“高晶体－高胶体混合液”为德国费森尤斯公司产品。
方法：按随机数字表法36只大鼠分为3组，假手术组、生理盐水组及高晶体－高胶体渗透压混合液组，每组12只。自主循环恢复后即刻输注上述不同液体。
主要观察指标：复苏后72 h，采用透射电镜和TUNEL的方法比较3组大鼠海马神经元的改变，采用荧光四肽底物法检测海马神经元Caspase-3活性，采用迷宫法检查海马功能变化。
结果：SD大鼠36只均进入结果分析。复苏后72 h，生理盐水组、高晶体－高胶体渗透压混合液组海马区均发现有延迟性神经元死亡现象，且为凋亡表现。与生理盐水组相比，高晶体－高胶体渗透压混合液能够减少海马区TUNEL阳性细胞率，明显抑制海马CA1区Caspase-3的表达（P < 0.05），减少心肺复苏后大鼠的探索活动。
结论：自主循环恢复即刻给予小容量高晶体－高胶体混合液可抑制海马CA1区神经元Caspase-3 的表达，减少海马神经元凋亡，对大鼠海马功能起到一定的保护作用。
关键词：高晶体－高胶体混合液；高渗溶液；心肺复苏；凋亡；Caspase-3；生物材料

许淼，李偲，杨勇，袁世荧，姚尚龙，黄文起.小容量高晶体-高胶体混合液对心肺复苏后大鼠海马神经元组织学的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(27):5334-5338
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>>本文导读<<

课题背景：课题为湖北省科技攻关计划项目资助（2004AA301C12），课题名称：“小容量复苏”应用于心肺脑复苏的实验研究。课题利用大鼠心跳骤停复苏模型，采用免疫组织化学、分子生物学等实验方法，结合利用激光显微切割分离技术，动态观察“小容量复苏”对于心跳骤停复苏过程中大脑微循环、缺血再灌注及神经元凋亡的影响，以解决传统心肺复苏措施不能有效减少神经系统损伤等并发症的问题。

应用要点：实验采用窒息致大鼠心跳骤停心肺复苏方法复制大鼠全脑缺血再灌注模型，将高晶体-高胶体渗透压混合液小容量用于该模型心肺复苏的早期自主循环恢复即刻，结果发现高晶体-高胶体渗透压混合液能减轻复苏后海马神经元的凋亡现象，降低caspase-3的表达及在开阔迷宫中的探索活动，验证了该药一定程度发挥脑保护效应的作用途径。

偏倚或不足：①由于实验模型复制的难度大，实验例数偏少，可能造成实验结果的偏倚。②检测方法还有待深入，没有做分子生物学水平检测，来支持结论。

0 引言

1919年就有报道高渗NaCl溶液用以失血性休克患者的液体治疗，但由于它维持循环稳定的时间较短（约2 h左右），因此常和右旋糖酐或羟乙基淀粉合用以延长扩容作用的时间。由于其复苏临床用量较小，仅需要3.0~4.0 mL/kg，故称为“小容量复苏”。高晶体-高胶体渗透压混合液(Hypertonic-hyperoncotic solution, HHS)是“小容量复苏”中的一种成分，临床上常用的HHS是由7.2%~7.5%NaCl与6%~10%右旋糖酐或羟乙基淀粉组成[1]。已有的研究中，和其他传统的容量替代品相比， HHS多用于创伤及失血性休克的早期液体紧急治疗[2-3]，其中的晶体、胶体成分提高血浆中的渗透压，使得血管外液体得以迅速重新分布，恢复循环血容量，改善心脏循环功能，减轻组织水肿，抑制微循环炎症反应，降低颅内压并改善组织和器官的氧供，但用于心跳骤停心肺脑复苏的研究较少。
为了解决心肺复苏后脑复苏脱水治疗和维持循环稳定容量治疗之间的矛盾，作者先前已有研究发现[4]，使用HHS能增加心肺复苏早期的组织灌注、减轻脑微循环的再灌注损伤，抑制了脑水肿的程度，由此将会改善脑组织缺血所致的神经元缺氧，为复苏后期脑组织功能的保护提供了可能性[5]。但是，是否因此而对心肺复苏后期脑缺血易损区域海马起到延迟性的保护作用，值得探讨。近年Noppens等[6]发现，在大鼠全脑缺血复苏的早期（灌注后1.5 min）使用HHS，能明显降低复苏后10 d大鼠的死亡率。然而，他们并没有对神经系统的具体功能及相关机制进一步研究。因此，本实验旨在研究心肺复苏自主循环恢复后即刻立即输注HHS，对心肺复苏后期海马的影响及可能机制。

1 材料和方法

设计：随机分组设计，对照细胞学实验。
时间及地点：于2004-05/2007-05在华中科技大学同济医学院附属协和医院麻醉科实验室及中山大学附属第一医院麻醉科完成。
材料：选择健康雄性SD大鼠36只，体质量300~450 g，分笼饲养，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供(许可证号：SCXK(鄂)2004-0007）。实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。高晶体－高胶体混合液为德国费森尤斯公司产品，由7.2%NaCl+6％羟乙基淀粉组成。
实验过程：
心肺复苏模型的制备：术前禁食12 h不禁水，用10%的水合氯醛麻醉，300 mg/kg,腹腔注射大鼠，取仰卧位固定四肢。用灌胃针经口行气管插管，插管后接小动物呼吸机，吸呼比1∶2，呼吸频率为50次/min，潮气量10 mL/kg，控制呼吸。腹部小范围剪毛后以3%碘酒、75%乙醇溶液消毒，做腹股沟切口，分离右侧股动脉和左侧股静脉，以22号聚乙烯血管留置针置管。右侧股动脉留置针接监测仪连接管监测动脉血压，连接管内充满1 000 U/mL肝素钠溶液，左侧股静脉留置针接微量输液泵用于复苏给药。经肛门插入测温探头3 cm监测体温，温度控制在（38±0.5）℃。完成上述步骤，稳定20 min左右，等待窒息。开始窒息前给予维库溴胺2 mg 腹腔注射，以抑制窒息时动物强烈的躯体抵抗及自主呼吸。开始窒息时脱离呼吸机，夹闭呼吸通路橡皮管道，持续8 min建立心跳骤停模型，在此时间内平均动脉压低于10 mm Hg为心跳停止标志。
第9分钟即刻开始行心肺复苏：心外按压(200次/min),机械通气 (100% O2),呼吸频率80次/min，左股静脉注入肾上腺素20 μg/（kg?min），同时每30 min注入NaHCO3 0.3 mEq/kg。自主循环恢复的标准为平均动脉压大于60 mm Hg，停止心外按压。此刻通过微量输液泵4 mL/kg，维持8 min输完，确定充分的自主呼吸恢复而脱离呼吸机去掉导管、结扎血管、清洁缝合切口。
动物实验：健康雄性SD大鼠36只,按随机数字表法分为3组，假手术组、生理盐水组、高晶体－高胶体渗透压混合液组，每组12只。假手术组动物仅行气管插管及动静脉穿刺等手术操作不行窒息及心肺复苏，以排除手术操作对实验结果的影响；生理盐水组和高晶体-高胶体渗透压混合液组均行窒息及心肺复苏。心肺复苏动物模型的制备采用前述“大鼠心跳骤停心肺复苏模型制作”的方法，窒息持续8 min后开始心肺复苏。高晶体－高胶体渗透压混合液组在自主循环恢复即刻从左股静脉插管处输注HHS 4 mL/kg，维持8 min输完；生理盐水组则换为同等剂量的生理盐水予以对照。复苏成功，自主呼吸恢复正常后脱机。左右腹股沟伤口消毒缝合，入笼。
电镜标本检测：复苏成功72 h，开阔法测定后，再次水合氯醛麻醉，立即断头取脑。各组随机取6只大鼠左侧脑半球在冰块上快速剥离海马，放入4 ℃ 40 g/L多聚甲醛液(电镜专用)中冷藏固定4 h，0.1 mol/L磷酸盐缓冲液漂洗，2%锇酸后固定2 h，乙醇丙酮梯度脱水，812 包埋剂包埋；然后行超薄切片，常规铅铀染色，在透射电镜下观察（华中科技大学同济医学院病理学系，日立HE-800）。
TUNEL检测：在上述随机选取的6只大鼠右侧脑半球在视交叉及其后4 mm两处冠状切面切开鼠脑。取中间切块脑组织浸泡于10%甲醛溶液8 h后，于乙醇溶液梯度脱水、透明、浸蜡及包埋制成石蜡蜡块。在海马齿状回互包平面上连续冠状切片，片厚4 μm，准备行TUNEL染色。TUNEL检测流程:①石蜡切片脱蜡至水,磷酸盐缓冲液洗3次,每次3 min。②1% H2O2室温孵育20 min,抑制内源性过氧化物酶,磷酸盐缓冲液洗3次,每次3 min。 ③20 mg/ L蛋白酶K消化20 min,37 ℃,磷酸盐缓冲液洗3次,每次3 min。④浸入TUNEL混合液(100 μL中含20 U/mL TdT 1 μL和FITC-DUTP混合液1 μL)中 37 ℃,115 h ,磷酸盐缓冲液洗3次,每次3 min。⑤荧光镜下观察。⑥滴加抗HRP-FITC即用液,37 ℃,1 h ,磷酸盐缓冲液洗3次,每次3 min。⑦105% DAB+103%H2O2显色8~12 min ,流水冲洗终止反应;苏木精衬染1 min ,水洗,盐酸乙醇分化30 s ,水洗蓝化,常规树脂封固。应用数码图像分析系统（华中科技大学同济医学院病理学系，IDA-2000）在海马区随机采集10个视野(×200倍),以百分率(%)表示阳性细胞百分数,以平均吸光度(A)值表示着染色强度定量分析切片海马区TUNEL阳性细胞百分数,平均吸光度值。
Caspase-3活性检测：各组剩余6只在冰块上快速剥离海马，用于Caspase-3活性检测。应用荧光四肽底物（AMC）法检测Caspase-3活性，按Alexandra方法加以改进。取海马组织100 mg，加入100 μL细胞裂解液中(Tris Base 50 mmol/L, pH 7.14, NaCl 150 mmol/L, Triton X-100 0.5%，EDTA 1 mmol/L，protease inhbior cocktail 0.5%)进行匀浆，13 000 r/min 30 min，取上清液,提取蛋，采用紫外分光光度仪测量含量，放入-80 ℃冰箱保存备用。测定caspase-3作用的特异底物-乙酰化天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天门氨酰胺(AC-DEVD)连接的荧光素(Ac-DEVD-AMC)，释放的AMC。将蛋白30 μg用缓冲液( HEPES 50 mmol/L，pH 7.14 ,NaCl 150 mmol/L, EDTA 1 mmol/L，DTT 10 mmol/L)稀释至 2.5 mL,加入 4 μL Ac-DEVD-AMC 置室温,避光反应30 min，应用荧光分光光度（同济医学院公卫学院，HITACHI850）计以激发波长360 nm，发射波长460 nm测量AMC的荧光吸光度，再以caspase-3标准曲线换算成标本中活性caspase-3的含量，单位用μmol/(mg?h)表示。
行为学观察（反映海马功能）：开阔迷宫法是经典的鼠行为学检测方法之一，动物若探索活动增加，常表明海马功能受损。自主循环恢复后72 h用开阔法（open field test）测定沙土鼠行为学变化。将沙土鼠放入76 cm×72 cm×57 cm的木箱，箱底均分为25小格，计数动物10 min内爬行的格子数。实验在一安静的房间内进行，整个实验过程中保持室内灯光等周围环境条件的一致。为排除实验设计人员因素，所有行为学观察计数均由一独立实验员单独完成。
主要观察指标：于复苏后72 h采用迷宫法检查海马功能变化，采用透射电镜和TUNEL的方法比较3组大鼠海马神经元的改变，采用荧光四肽底物法检测海马神经元Caspase-3活性。
设计、实施、评估者：设计为第一作者，实施为全部作者，评估为第四、五、六作者，评估者经过正规培训。

2 结果

2.1 实验动物数量分析 纳入动物36只，均进入结果分析，无脱落。
2.2 电镜检测结果 通过透射电镜观察到,假手术组神经元基本正常，生理盐水组和高晶体－高胶体渗透压混合液组部分细胞均出现线粒体嵴断裂、核染色质边集化、胞浆空泡化、内质网扩张、血管内皮细胞肿胀与周围组织连接疏松等表现，见图1。

2.3 TUNEL结果 借助末端转移酶标记技术,可以特异地将凋亡细胞在组织原位显示出来。通过TUNEL方法,在假手术组动物海马区未发现有TUNEL阳性细胞；生理盐水组海马的CA1区和齿状回区TUNEL阳性细胞表达强烈；而高晶体-高胶体渗透压混合液组海马的CA1区和齿状回区表达明显减少，见图2。

经IDA-2000数码图像分析系统软件分析, 生理盐水组海马区TUNEL阳性细胞率为95%、平均光密度为 0.757±0.004, 高晶体-高胶体渗透压混合液组海马区TUNEL阳性细胞率为61 %、平均光密度为0.429±0.006,较生理盐水组降低(P < 0.05)。
2.4 Caspase-3活性测定结果 生理盐水组和高晶体-高胶体渗透压混合液组海马Caspase-3活性明显高于假手术组[分别为（21.67 ±0.56），（15.37 ±0.39），（10.32±0.03）μmol/(mg?h)，P < 0.05]，可见窒息致心跳骤停心肺复苏后72 h，海马的caspase-3 大量激活,酶活性显著升高。和生理盐水组相比，高晶体-高胶体渗透压混合液组海马Caspase-3活性均明显减少(P < 0.05)，说明HHS可明显抑制海马caspase-3的表达。
2.5 行为学结果 窒息致心跳骤停后可引起大鼠探索活动明显增加。生理盐水组和高晶体－高胶体渗透压混合液组爬行格子数均高于假手术组[分别为(520±67)，(317±41)，(263±73)个，P < 0.05]；与生理盐水组比较，高晶体-高胶体渗透压混合液组爬行格子数明显减少(P < 0.05)。

3 讨论

脑缺血再灌注的微循环异常与灌注后的延迟性神经元死亡关系密切。在无血流灌注阶段，神经元细胞膜因缺氧而去极化，Ca2+内流，谷氨酸释放，随同灌注恢复后氧自由基、一氧化氮、儿茶酚胺等导致神经元线粒体损伤，DNA断裂以及散在的细胞死亡，自主循环恢复后3 d或更久以后脑组织病理改变成熟[7]。使用HHS后抑制了延迟性神经元的死亡，可能与减轻了神经元在全脑缺血再灌注过程中缺氧，改善了由神经元缺氧引发的上述生化损伤有关。
在本实验中，心肺复苏后72 h假手术组和高晶体－高胶体渗透压混合液组的电镜及TUNEL结果证明，心跳骤停心肺复苏后72 h大鼠海马CA1区确实出现了神经元死亡现象，并且启动了凋亡机制；给予HHS能够明显减轻假手术组72 h后大鼠海马CA1区TUNEL阳性神经元细胞数，部分抑制了海马的延迟性神经元死亡。同时，海马受损后动物学习记忆和空间定位能力下降,表现为在开阔迷宫中探索活动增加。在本实验中，自主循环恢复即刻给予HHS可减少大鼠的探索活动，提示HHS能减轻海马神经元的损伤，对其相关功能起到一定的保护作用。
此外，本实验还发现假手术组复苏后72 h Caspase-3在缺血敏感区CA1区大量表达。caspase-3的激活是触发细胞凋亡的关键，是细胞凋亡的主要执行者。激活的caspase-3直接裂解胞内大量重要成分,使细胞表现出与凋亡相关的特征性改变。小容量HHS复苏可以减少
caspase-3表达，提示HHS可能是通过抑制caspase-3的激活,从而抑制细胞凋亡。Murao等[8]在对失血性休克小鼠的研究中发现，高渗溶液复苏能够减少小肠caspase-3的表达，减轻小肠细胞的凋亡，此结论与本实验相似。Soustiel等[9]也在大鼠脑外伤模型中发现小容量高渗溶液复苏比甘露醇更能减轻72 h后脑组织caspase-3活性、脑水肿及脑组织凋亡程度。
HHS对caspase-3的抑制机制尚不十分明确。脑缺血导致Na-KATP酶失活以及Na-H交换增加，细胞外的大量钠离子进入神经细胞，造成谷氨酸和Ca离子增加[10]。谷氨酸和Ca离子一起通过谷氨酸受体或Ca离子电压门控通道进入神经元触发了延迟性神经元死亡[11]。研究发现增加的谷氨酸和Ca离子对caspase-3的激活起到了调控作用。Manabe等[12]指出过度增加的谷氨酸将会激活caspase-3造成新生大鼠脊髓神经元的凋亡。因此，作者推测，HHS可能通过补偿细胞外因缺血再灌而减少的Na离子，纠正细胞内外Na离子失衡，减少了细胞外谷氨酸和细胞内Ca离子的聚集，从而降低了受其调控的caspase-3的蛋白表达，因此抑制了延迟性神经元的凋亡。Ho等[13]也证实高渗液减少了缺氧兔心肌细胞内Na离子的摄取和细胞内Ca离子聚集。
总之，心跳骤停心肺复苏后72 h，SD大鼠海马神经元确实启动了凋亡机制，发生了延迟性神经细胞死亡现象。心肺复苏自主循环恢复即刻运用小容量HHS能够通过抑制caspase-3表达，减轻复苏后期72 h海马神经元的凋亡，在海马的功能上起到一定的保护作用。

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