Influence of anti-transforming growth factor-beta 2 antibody on the proliferation of filtering bleb fibroblasts and expression of p21 and cyclinD1 after glaucoma surgery

Liao Hai-lan 1, Yan Yi-nong 2, Wei Jian-chu 1

Abstract

BACKGROUND: Researches indicate that transforming growth factor-β2 plays an important role in the cicatrisation of filtering bleb after glaucoma filtering surgery.
OBJECTIVE: To observe the influence of anti-transforming growth factor-β2 (TGF-β2) on the proliferation of filtering bleb fibroblasts cultured in vitro and its expression of p21 and cyclinD1.
DESIGN, TIME AND SETTING: The open experiment was carried out in June 2007 at Department of Plastic Surgery, the Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang, Guangdong Province, China.
MATERIALS: Scar tissues removed from failed filtering blebs after glaucoma trabeculectomy. All patients were male and their age ranged from 23 to 35 years; eight patients did not receive anti-scar drug treatment before and during the operation.
METHODS: Primary cell culture was done using the scar tissue to get fibroblasts. Fibroblasts were incubated with 0 (control), 0.01, 0.1, 1, 10 mg/L of anti-TGF-β2 antibody for 24 hours; inhibitory concentration 50 of anti-TGF-β2 antibody was used to treat the fibroblasts for 0 (control), 24, 48, 72 hours, respectively.
MAIN OUTCOME MEASURES: The influence of anti-TGF-β2 antibody on the proliferation of fibroblasts and its expression of p21 and cyclinD1 observed with MTT and immunohistochemistry.
RESULTS: With the increase of the anti-TGF-β2 antibody concentration and the prolongation of the action time, the inhibitory effect of antibody on the fibroblasts became more and more obvious; the cyclinD1 positive expression decreased gradually while the weak positive expression increased; on the other hand, the strong positive expression of p21 raised noticeably and the expression in cell nucleus also increased (P < 0.01). The expression of p21 showed a marked negative correlation with the expression of cylinD1 under different concentrations of anti-TGF-β2 antibody and at different time points (r=-0.91, r=-0.85, P < 0.05), p21 and cylinD1 both were correlated noticeably with the proliferation inhibition of cells (r=0.76, P < 0.05).
CONCLUSION: The anti-TGF-β2 antibody can inhibit the proliferation of fibroblasts by increasing the synthesis of p21 protein and regulating the expression of cyclinD1.

Liao HL, Yan YN, Wei JC. Influence of anti-transforming growth factor-beta 2 antibody on the proliferation of filtering bleb fibroblasts and its expression of p21 and cyclinD1 after glaucoma surgery.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(28):5401-5405(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-28/28k-5401(ps).pdf]

摘要

背景：研究表明，转化生长因子β2在青光眼滤过性手术后滤过泡瘢痕形成过程中起着重要的作用。
目的：实验拟观察抗转化生长因子β2抗体对体外培养的滤过泡成纤维细胞增殖及p21、cyclinD1表达的影响。
设计、时间及地点：开放性实验，于2007-06在广东医学院附属医院整形科完成。
材料：取自青光眼小梁切除术后失败滤过泡进行手术修复时切除下来的瘢痕组织。患者均为男性，年龄23~35岁。8例患者术前、术中均未接受抗瘢痕药物治疗。
方法：将瘢痕组织进行原代细胞培养，获得成纤维细胞。将浓度为0（对照），0.01，0.1，1，10 mg/L抗转化生长因子β2抗体作用于成纤维细胞24 h，半数抑制浓度（IC50）抗转化生长因子β2抗体分别处理0（对照），24，48，72 h。
主要观察指标：四甲基偶氮唑盐法及免疫组织化学法观察抗转化生长因子β2抗体对成纤维细胞的增殖及p21、cyclinD1表达的作用。
结果：①随着抗转化生长因子β2抗体作用浓度的增加及作用时间的延长，抗体对成纤维细胞具有明显抑制作用。②随着抗转化生长因子β2抗体作用浓度、时间增加cyclinD1阳性表达减少，弱阳性表达增加；而p21强阳性表达明显增多，且在细胞核的表达也增多(P < 0.01)；在不同的作用浓度及时间，p21与cyclinD1表达呈显著负相关（r=-0.91，r=-0.85，P < 0.05），两者与细胞的增殖抑制显著相关（r=0.76，P < 0.05）。
结论：抗转化生长因子β2抗体可能通过诱导p21蛋白合成，下调cyclinD1的表达从而抑制成纤维细胞的增殖。
关键词：成纤维细胞；抗转化生长因子β2抗体；p21；cyclinD1

廖海兰，阎亦农，魏建初. 抗转化生长因子β2抗体对青光眼术后滤过泡成纤维细胞增殖及p21、cyclinD1表达的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(28):5401-5405 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-28/28k-5401(ps).pdf]

>>本文导读<<

课题背景：课题由广东省湛江市科技攻关项目资助（2006C01019）。滤过泡瘢痕的形成是青光眼滤过手术失败的主要原因。有研究表明转化生长因子β2在青光眼滤过性手术后滤过泡瘢痕形成过程中起着重要的作用，而抗转化生长因子β2抗体具有中和转化生长因子β2的作用。本实验采用四甲基偶氮唑盐法、免疫组织化学法观察抗转化生长因子β2抗体对成纤维细胞增殖及p21、cyclinD1表达的影响。

相关链接：解除手术后滤过泡瘢痕形成成为青光眼治疗中的一个重要课题。虽然应用于临床一些抗瘢痕的药物，例如丝裂霉素C和5-氟脲嘧啶可以阻止手术瘢痕的过度增殖和改善手术后滤过泡的功能及提高手术成功率起到一定作用，但它们具有的副作用及术后并发症限制其在临床的应用。因此，寻求一种毒副作用小、疗效高的抗瘢痕药物，一直是青光眼领域研究的热点。

偏倚或不足：实验仅采取四甲基偶氮唑盐比色法分析抗转化生长因子β2抗体对成纤维细胞增殖的影响，缺乏更深层次的分析；未设立阳性对照组且实验重复性未得到论证。

0 引言

研究表明，多种生长因子都能调控成纤维细胞的生物学行为，其中转化生长因子β2（Transforming growth factor-β2，TGF-β2）在瘢痕形成过程中具有重要的作用，被认为是伤口细胞外基质积聚、收缩和异常修复的关键性调控因素[1]。人单克隆抗TGF-β2抗体是一种新型的重组的人抗TGF-β2单克隆抗体，它可以中和体内的TGF-β2，阻滞其发挥生物学效应，而且不影响人眼的正常免疫过程。本实验采用四甲基偶氮唑盐法、免疫组织化学法观察抗TGF-β2抗体对成纤维细胞增殖及p21、cyclinD1表达的影响，旨在为抗体在临床应用提供实验依据。

1 材料和方法

设计：开放性实验。
时间及地点：实验于2007-06在广东医学院附属医院整形科研究所完成。
材料：取自青光眼小梁切除术后失败滤过泡进行手术修复时切除下来的瘢痕组织。患者均为男性，年龄23~35岁。8例患者术前、术中均未接受抗瘢痕药物治疗。对用于实验的所取组织患者均知情同意。

实验过程：
细胞培养：取手术切除的瘢痕组织块，参考Kottler等[2]的方法进行原代及传代培养，经显微镜及细胞生物学鉴定，证实为成纤维细胞，取4~9代的细胞进行实验。
MTT法检测细胞抑制率：参照文后文献[3]的方法加以改进。将细胞以1×108 L-1 的密度接种于96孔培养板中，更换培养基并加入抗TGF-β2抗体，使终浓度分别为0，0.01，0.1，1，10 mg/L，然后培养24 h，每孔加入MTT (5 g/L)20 μL，继续培养4 h，用M550型ELISA Reader酶标仪检测各组细胞的吸光度(A570/A630)值(测定波长为 570 nm，参考波长为630 nm)，重复3次。以0 mg/L 抗TGF-β2抗体为对照组计算抗TGF-β2抗体对成纤维细胞的抑制率(IR)，按改良Karber公式计算半数抑制浓度(IC50)。在相同条件下，IC50浓度用抗TGF-β2抗体分别处理0，24，48，72 h，以0 h 抗TGF-β2抗体为对照组，计算抑制率。
免疫组织化学法测定：参照文献[4]的方法加以改进。取生长良好的成纤维细胞，更换培养基后加入抗TGF-β2抗体，使药物终浓度分别为0，0.01，0.1，1 mg/L 及用IC50分别处理成纤维细胞0，24，48，72 h，培养24 h 后弃去培养液，用PBS冲洗3次，中性甲醛固定30 min，晾干。参照S-P试剂盒说明进行免疫组织化学检测，第一抗体p21WAFI/CIPI、cyclinD1分别为1∶100、1∶50稀释。以PBS代替一抗为阴性对照，已知的阳性染色作为阳性对照。
结果判定：在光学显微镜下，每组选用上下左右中5个区域，计数500个细胞，分4个级别判定细胞阳性。阳性细胞观察部位为胞浆或/和胞核，着色淡黄为弱阳性(+)、着色棕黄为阳性(++)、着色棕褐色为强阳性(+++)、浅蓝色为阴性(-)，同时进行显微摄影。
主要观察指标：四甲基偶氮唑盐法及免疫组织化学法观察抗转化生长因子β2抗体对成纤维细胞的增殖及p21、cyclinD1表达的作用。
设计、实施、评估者：实验设计及资料收集为第一作者，干预实施为第一、二、三作者，由第一、三作者评估。
统计学分析：由第三作者采用SPSS 11.0软件完成统计处理，实验数据以x(_)±s表示，采用方差分析及spearman相关分析。

2 结果

2.1 MTT法检测不同浓度抗TGF-β2抗体对成纤维细胞增殖的影响 见表1。

表1可知，抗TGF-β2抗体可剂量依赖性增加成纤维细胞的抑制率，不同浓度组的抑制率与对照组相比，差异具有显著性意义（P < 0.01）。
2.2 MTT 法检测IC50抗TGF-β2抗体作用不同时间对成纤维细胞增殖的影响 见表2。

以IC50浓度0.14 mg/L 抗TGF-β2抗体分别处理成纤维细胞0，24，48，72 h，结果表明，抗TGF-β2抗体可时间依赖性增加成纤维细胞的抑制率。不同干预时间的抑制率与对照组相比，差异有显著性意义（P < 0.01）。
2.3 不同浓度抗TGF-β2抗体对成纤维细胞cyclinD1和p21表达的影响 见表3。

2.4 IC50抗TGF-β2抗体作用不同时间对成纤维细胞cyclinD1和p21表达的影响 见表4。

CyclinD1在成纤维细胞表达呈阳性，定位于细胞核，呈棕色细颗粒分布，胞浆阴性，但细胞显色深浅不一，见图1。

随着抗TGF-β2抗体作用浓度、时间增加其阳性表达减少，而弱阳性表达增加，见图2，3。

p21表达阳性，主要定位于胞浆，胞核也有部分表达，呈棕色细颗粒分布，见图4。

随着作用浓度、时间的增加其棕褐色强阳性表达明显增多，且在细胞核的表达也增多，见图5，6。

在不同的作用浓度及时间，p21与cyclinD1表达呈显著负相关（r=-0.91，r=-0.85，P < 0.05），两者与细胞的增殖抑制显著相关（r=0.76，P < 0.05）。

3 讨论

TGF-β是一种多功能的生长因子超家族，其中TGF-β2在瘢痕形成过程中具有重要的作用，被认为是伤口细胞外基质积聚、收缩、和异常修复的关键性调控因素[1，5]。研究显示，TGF-β是诱导结膜囊成纤维细胞合成其自身的主要诱导因子，其中TGF-β2占主导地位[6]。人眼结膜囊成纤维细胞可以通过旁分泌和（或）自分泌TGF-β2，影响结膜滤过泡的愈合过程；房水中TGF-β2的含量也影响手术后青光眼膜滤过泡的愈合过程[7-8]。
近年来研究表明，TGF-β多克隆抗体具有抗皮肤瘢痕增殖的作用，但不适用于人眼的研究[9]。而抗TGF-β2抗体是一种新型的重组人抗TGF-β2单克隆抗体，不同于其他的TGF-β抗体在于它具有人的基因序列、高的亲和力及特异性的作用于TGF-β2亚型等特点，而且不影响人眼的正常免疫过程。在动物试验过程中，抗TGF-β2抗体没有出现像抗代谢药物MMC那样严重的并发症，对周围组织也没有明显的破坏作用，组织耐受性好[10-13]。本实验在体外培养条件下观察抗TGF-β2抗体对成纤维细胞增殖的抑制作用及对cyclinD1、p21WAFI/CIPI蛋白表达的影响，阐述抗TGF-β2抗体对成纤维细胞增殖的影响及其可能机制。
细胞周期异常会导致细胞正常的分裂、增殖、分化与衰老这一系列过程紊乱。调控细胞周期的核心是细胞周期蛋白与细胞周期蛋白激酶(CDK)。CDK的活性除了受cyclin的正向调控外，还受细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂(CKI)的负向调节，p21是CKI的一种[14]。目前认为cyclinD1对细胞周期的控制起重要作用，参与控制细胞由G1期进入S期，其表达有助于细胞转化，并为维持转化细胞的细胞周期进展所必需[15]，但过度表达可以缩短G1期，从而导致细胞增殖失控[16-17]。p21的基因表达产物p21WAFI/CIPI蛋白是具有广泛激酶抑制活性的细胞周期抑制蛋白，与cyclin-CDK、增殖细胞核抗原组成细胞四元复合体，阻碍细胞从G1期进入S期，引起细胞周期停止[18]。
有作者[19-20]认为用免疫组织化学检测cyclinD1的蛋白表达可以反映其基因扩增和mRNA过表达的水平。本文用免疫组织化学检测不同浓度抗TGF-β2抗体分别处理成纤维细胞24 h 及IC50浓度抗体分别作用成纤维细胞0，24，48，72 h 后p21WAFI/CIPI、cyclinD1的蛋白表达，结果表明随着浓度的增加、作用时间的延长，p21WAFI/CIPI蛋白表达增加而cyclinD1的表达减少。本文还采用MTT比色法测定不同浓度抗TGF-β2抗体及IC50作用不同时间后的成纤维细胞增殖抑制率，结果显示，抗TGF-β2抗体以剂量、时间依赖性地抑制成纤维细胞的生长增殖(P < 0.01)，且p21WAFI/CIPI蛋白表达增加而cyclinD1的表达减少与细胞增殖抑制具有相关性（P < 0.05），提示抗TGF-β2抗体可能通过诱导p21WAFI/CIPI蛋白合成，下调cyclinD1的表达从而使肿瘤抑制蛋白正常地行使G1期停滞功能，抑制成纤维细胞的增殖。本实验还发现cyclinD1和p21WAFI/CIPI的表达呈负相关，其可能的原因是p21WAFI/CIPI蛋白依赖p53介导途径，降低cyclinD1的合成，但其确切原因和机制仍需进一步研究。

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