Regulation of membrane-type matrix metalloproteinase-1 expression in human osteoblast-like MG-63 cells by parathyroid hormone
Li Ji-bin1,2, Xie Hui1,Yuan Ling-qing1, Luo Xiang-hang1

Abstract

BACKGROUND: Parathyroid hormone is an important regulatory factor in the bone metabolism, and membrane-type matrix metalloproteinase-1 plays an important role in the regulation of bone resorption.
OBJECTIVE: To observe the effects of parathyroid hormone on the expression of membrane-type matrix metalloproteinase-1 in human osteoblast-like MG-63 cells.
DESIGN, TIME AND SETTING: Contrast observation was conducted at the laboratory of Institute of Endocrinology & Metabolism, the Second Xiangya Hospital of Central South University between March 2001 and July 2002.
MATERIALS: Human osteoblast-like MG-63 cell line; parathyroid hormone (1-34).
METHODS: MG-63 cells were treated with 1, 10, 100 nmol/L parathyroid hormone (1-34) for 24 hours, respectively, or were treated with 10 nmol/L parathyroid hormone (1-34) for 2, 6, 24, 48 hours, respectively. Each intervention group had three parallel samples and each intervention was repeated for three times.
MAIN OUTCOME MEASURES: Northern Blotting were used to determine the expression level of membrane-type matrix metalloproteinase-1 mRNA; Western Blotting were performed to detect the protein expression of membrane-type matrix metalloproteinase-1.
RESULTS: Our study showed that 1, 10, 100 nmol/L parathyroid hormone (1-34) inhibited membrane-type matrix metalloproteinase-1 mRNA and protein expression in a dose-dependent manner in MG-63 cells (P < 0.05). Within 2-48 hours of intervention, 10 nmol/L parathyroid hormone (1-34) inhibited membrane-type matrix metalloproteinase-1 mRNA and protein expression in a time-dependent manner in MG-63 cells (P < 0.05).
CONCLUSION: Parathyroid hormone can inhibit the expression of membrane-type matrix metalloproteinase-1 in osteoblast-like MG-63 cells, it may be one of the ways with which parathyroid hormone induces bone resorption.

Li JB, Xie H,Yuan LQ, Luo XH. Regulation of membrane-type matrix metalloproteinase-1 expression in human osteoblast-like MG-63 cells by parathyroid hormone.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(28):5406-5409(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-28/28k-5406(ps).pdf]

摘要

背景：甲状旁腺激素是骨代谢的重要调节因子，膜型基质金属蛋白酶1在骨吸收的调控中起重要作用。
目的：观察甲状旁腺激素对人成骨样MG-63细胞膜型基质金属蛋白酶1表达的影响。
设计、时间及地点：观察对比实验，于2001-03/2002-07在中南大学湘雅二医院代谢内分泌研究所实验室完成。
材料：人成骨样MG-63细胞株，甲状旁腺激素(1~34)。
方法：分别应用1，10，100 nmol/L的甲状旁腺激素(1~34)干预MG-63细胞24 h；或分别用10 nmol/L甲状旁腺激素(1~34)干预MG-63细胞2，6，24，48 h。每干预组设3个平行样本，重复3次。
主要观察指标：采用Northern杂交法检测膜型基质金属蛋白酶1 mRNA表达水平；Western杂交法检测膜型基质金属蛋白酶1蛋白表达水平。
结果：①1，10，100 nmol/L的甲状旁腺激素（1~34）对MG-63细胞膜型基质金属蛋白酶1 mRNA及蛋白的表达有抑制作用，呈剂量依赖性（P < 0.05）。②10 nmol/L的甲状旁腺激素（1~34）在干预2~48 h内对膜型基质金属蛋白酶1 mRNA及蛋白的表达有抑制作用，呈时间依赖性（P < 0.05）。
结论：甲状旁腺激素具有抑制成骨样细胞膜型基质金属蛋白酶1表达的作用，此可能为甲状旁腺激素诱导骨吸收的作用途径之一。
关建词：甲状旁腺激素类；金属蛋白酶类；成骨细胞

李继斌，谢辉，袁凌清，罗湘杭. 甲状旁腺激素对人成骨样细胞膜型基质金属蛋白酶1表达的调控[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(28):5406-5409 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-28/28k-5406(ps).pdf]

>>本文导读<<

课题背景：膜型基质金属蛋白酶1是最近发现的1种可由成骨细胞表达的基质金属蛋白酶，其主要功能是降解I型胶原等骨基质，亦可降解活性肿瘤坏死因子α成无活性的小片断，在骨吸收的调控中起重要作用。课题观察了甲状旁腺激素对人成骨样MG-63细胞表达膜型基质金属蛋白酶1的影响，旨在分析甲状旁腺激素调节骨代谢的作用途径。

实验室介绍：实验在中南大学湘雅二医院代谢内分泌研究所实验室完成。该所为“211工程”重点建设学科，多次获得国家自然科学基金委、科技部、教育部、卫生部、科技厅、卫生厅的课题资助，曾连续3次获得卫生部临床学科重点项目，获国家“九五”攻关课题3项，国家“十五”攻关课题3项，国家自然科学基金课题7项，获得国家科技进步奖2项，省部级科技进步奖9项，其良好的条件保证了本实验的顺利完成。

偏倚或不足：进一步行动物实验将弥补本次未观察甲状旁腺激素对成骨细胞表达膜型基质金属蛋白酶1影响的不足。

0 引言

甲状旁腺激素可间接通过成骨细胞增强破骨细胞活性与数量，促进骨吸收，但其具体作用途径尚未阐明[1]。
膜型基质金属蛋白酶1是最近发现的一种可由成骨细胞表达的基质金属蛋白酶，其主要功能是降解Ⅰ型胶原等骨基质，亦可降解活性肿瘤坏死因子α成无活性的小片断，可在骨吸收的调控中起重要作用[2-3]。基质金属蛋白酶是由多种锌离子依赖性酶组成的能降解细胞外基质蛋白的酶系家族[2]，最近发现的膜型基质金属蛋白酶1是1种特殊的基质金属蛋白酶，除具有其他类型基质金属蛋白酶原型结构外，还有羧基端穿膜区，其重要功能为降解Ⅰ型胶原、纤维粘连蛋白、层粘连蛋白等骨基质，亦可降解肿瘤坏死因子α[3]，作为明胶酶A酶原的细胞膜表面受体激活明胶酶A。最近研究发现，与其他基质金属蛋白酶相比，膜型基质金属蛋白酶1在骨重建过程中所起的作用是最关键的。Holmbeck等[1]用基因敲除做成的膜型基质金属蛋白酶1基因缺陷小鼠出现严重的骨质疏松。与膜型基质金属蛋白酶1基因缺陷小鼠相比，其他的基质金属蛋白酶（如基质金属蛋白酶2，3，7，9，12）基因缺陷小鼠骨代谢功能不受影响[1]。
本实验观察甲状旁腺激素(1~34)对人成骨样MG-63细胞表达膜型基质金属蛋白酶1的影响，旨在分析甲状旁腺激素调节骨代谢的作用途径。

1 材料和方法

设计：观察对比实验。
时间及地点：于2001-03/2002-07在中南大学湘雅二医院代谢内分泌研究所实验室（国家重点学科实验室）完成。
材料：

方法：
细胞培养：人成骨样MG-63细胞用无酚红的MEM培养液培养，其中含体积分数为0.1的胎牛血清，青霉素50 U/mL，庆大霉素50 mg/L。3 d换液1次，达汇片后细胞按5×105 /瓶接种至25 cm2培养瓶。
细胞干预实验：MG-63细胞培养于25 cm2培养瓶含体积分数为0.1的胎牛血清的上述培养液中6 d，含 2.5 g/L牛血清白蛋白的无血清MEM培养2 d，用0，1，10，100 nmol/L的甲状旁腺激素(1~34)干预24 h；或分别用10 nmol/L甲状旁腺激素(1~34)干预2，6，24，48 h。抽提细胞总RNA进行Northern杂交；抽提细胞总蛋白用Bradford法测其含量、进行Western杂交。每干预组设3个平行样本，重复3次。
Northern杂交：用Trizol按操作说明抽提细胞总RNA[4]。加入适量Trizol裂解细胞，氯仿抽提、异丙醇沉淀RNA，然后体积分数为0.75的乙醇洗涤，干燥后溶总RNA于去RNA酶水中，用紫外/可见分光光度计测总RNA A260/A280，均> 1.8。取40 μg总RNA经10 g/L的甲醛变性凝胶电泳后，真空转膜至尼龙膜，经80 ℃烤干。膜型基质金属蛋白酶1 cDNA探针及甘油醛-3-磷酸脱氢酶cDNA探针按作者以前的方法制备[4]，用[α-32P]dCTP随机引物法标记探针。尼龙膜42 ℃预杂交过夜，杂交，洗膜后置-70 ℃冰箱中放射自显影。膜经洗脱后再用甘油醛-3-磷酸脱氢酶cDNA探针杂交，作为内参照。放射自显影胶片以BioRad-Jeldoc2000图像分析系统行吸光度扫描，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶校正作相对量分析，数值以膜型基质金属蛋白酶1与甘油醛-3-磷酸脱氢酶吸光度比值表示。
免疫印迹：参照分子克隆实验指南进行操作[5]。抽提细胞干预实验各组细胞总蛋白，用Bradford法测其含量取40 μg细胞总蛋白电泳，转移至硝酸纤维素膜上。封闭后用1 mg/L单克隆鼠抗人膜型基质金属蛋白酶1抗体磷酸盐缓冲液温育1 h。1∶1 000兔抗鼠辣根过氧化物酶的磷酸盐缓冲液温育1 h。化学发光增强试剂自显影 1 min，洗片显带。所有杂交信号在BioRad-Jeldoc2000图像分析系统进行吸光度扫描，数值以各甲状旁腺激素(1~34)干预组与对照组的比值表示。
主要观察指标：甲状旁腺激素(1~34)对人成骨样MG-63细胞膜型基质金属蛋白酶1 mRNA、蛋白表达的影响。
设计、实施、评估者：实验设计、实施、评估均为本文作者，均经过正规培训。
统计学分析：由第一作者应用SPSS 11.0统计软件进行数据处理，数据以x(_)±s表示，组间比较用方差分析，P < 0.05表示差异有显著性意义。

2 结果

2.1 Northern杂交分析甲状旁腺激素(1~34)对MG-63细胞膜型基质金属蛋白酶1 mRNA表达的影响 Northern杂交结果见图1，1 nmol/L甲状旁腺激素(1~34)轻度减低MG-63细胞膜型基质金属蛋白酶1 mRNA表达； 10 nmol/L甲状旁腺激素(1~34)进一步减低mRNA表达；100 nmol/L甲状旁腺激素(1~34)明显减低mRNA表达。这显示甲状旁腺激素(1~34)抑制MG-63细胞膜型基质金属蛋白酶1 mRNA表达，并呈剂量依赖性。对照组膜型基质金属蛋白酶1 mRNA表达丰度（膜型基质金属蛋白酶1/甘油醛-3-磷酸脱氢酶）为0.62±0.08，1，10，100 nmol/L甲状旁腺激素(1~34)组膜型基质金属蛋白酶1 mRNA表达丰度分别为0.43±0.06，0.19±0.07，0.07±0.03，甲状旁腺激素(1~34)各均干预组均显著低于对照组(P < 0.05)。

与对照组相比，10 nmol/L甲状旁腺激素(1~34)干预2 h后膜型基质金属蛋白酶1 mRNA表达开始降低，干预6，24，48 h后膜型基质金属蛋白酶1 mRNA表达进一步降低。这显示甲状旁腺激素(1~34)抑制MG-63细胞膜型基质金属蛋白酶1 mRNA表达呈时间依赖性，见图2。

2.2 Western杂交分析甲状旁腺激素(1~34)对MG-63细胞膜型基质金属蛋白酶1蛋白表达的影响 Western杂交结果见图3，MG-63细胞各组均在Mr 63 000处有阳性条带出现，代表膜型基质金属蛋白酶1蛋白；1，10，100 nmol/L甲状旁腺激素(1~34)干预组蛋白条带较对照组明显逐渐减低。1 nmol/L甲状旁腺激素(1~34)干预组膜型基质金属蛋白酶1蛋白条带强度为对照组的(53±8)% (P < 0.05)； 10 nmol/L甲状旁腺激素(1~34)干预组蛋白条带进一步减弱，为对照组的(14±5)%(P < 0.01)；而100　nmol/L甲状旁腺激素(1~34)干预组蛋白条带显著减弱，为对照组的(6±2)% (P < 0.01)。表明甲状旁腺激素(1~34)对MG-63细胞膜型基质金属蛋白酶1蛋白表达抑制效应呈剂量依赖性，与对照组相比，P均 < 0.05。

10 nmol/L甲状旁腺激素(1~34)干预2 h后膜型基质金属蛋白酶1蛋白表达开始降低，为对照组的(82±4)%(P < 0.05)；干预6，24，48 h后膜型基质金属蛋白酶1蛋白表达进一步降低，分别为对照组的(44±6)%，(16±5)%，(47±13)%，差异均具有显著性意义(P < 0.01)。提示甲状旁腺激素(1~34)抑制MG-63细胞膜型基质金属蛋白酶1蛋白表达呈时间依赖性，见图4。

2.3 可能影响结果的因素分析 Northern杂交与Western杂交过程中背景的干扰是可能影响结果的因素。

3 讨论

成骨肉瘤MG-63细胞可表达膜型基质金属蛋白酶1[4]。由于甲状旁腺激素是骨代谢的重要调节因子，本实验观察了甲状旁腺激素(1~34)对MG-63细胞表达膜型基质金属蛋白酶1的影响。实验结果显示，甲状旁腺激素(1~34)对MG-63细胞膜型基质金属蛋白酶1 mRNA、蛋白质表达的抑制效应呈剂量及时间依赖性。
膜型基质金属蛋白酶1的另一重要功能为降解肿瘤坏死因子α[8]。肿瘤坏死因子α有刺激破骨细胞形成与分化、激活破骨细胞的作用。膜型基质金属蛋白酶1可能通过降解肿瘤坏死因子α在骨吸收过程中起重要的抑制作用。膜型基质金属蛋白酶1是细胞进行迁移与分化的中介因子[2，8-15]。作者前期实验发现抗骨质疏松药物雌/孕激素可诱导成骨细胞膜型基质金属蛋白酶1基因表达，表明膜型基质金属蛋白酶1是雌/孕激素作用于骨的中介因子[4]。雌/孕激素可能通过膜型基质金属蛋白酶1促进骨形成、抑制骨吸收，发挥抗骨质疏松作用。雌/孕激素可能通过膜型基质金属蛋白酶1诱导成骨细胞成骨功能，促进成骨细胞移行，增强成骨细胞成活及为新的骨基质矿化做准备等途径，促进骨形成；并且通过降解肿瘤坏死因子α抑制骨吸收。肿瘤坏死因子α是一种调节骨代谢的细胞因子，骨组织的肿瘤坏死因子α主要由成骨细胞、基质细胞和单核细胞产生，以相对分子质量为26 000的前体蛋白形式表达于细胞膜或进一步裂解为相对分子质量为17 000的成熟蛋白分泌于细胞外，刺激破骨细胞形成与分化，促进骨吸收[6]。D’Ortho等[3]研究发现膜型基质金属蛋白酶1首先将相对分子质量为26 000的肿瘤坏死因子α前体蛋白裂解为相对分子质量为17 000的肿瘤坏死因子α成熟蛋白，然后迅速将其分解为相对分子质量为13 000的无活性小分子物质。因此，膜型基质金属蛋白酶1可通过降解肿瘤坏死因子α在骨吸收过程中起抑制作用。
甲状旁腺激素(1~34)抑制人成骨肉瘤MG-63细胞表达膜型基质金属蛋白酶1的效应表明，膜型基质金属蛋白酶1可能是甲状旁腺激素调节骨代谢的中介因子之一。甲状旁腺激素可激活人成骨样MG-63细胞PKA信号途径[7]。Lajeunesse等[16]认为甲状旁腺激素通过cAMP抑制骨钙素基因表达，甲状旁腺激素可通过PKA信号途径抑制成骨肉瘤MG-63细胞膜型基质金属蛋白酶1表达。甲状旁腺激素调节骨代谢，推测其作用途径可能与甲状旁腺激素抑制成骨样细胞膜型基质金属蛋白酶1表达，使被降解的肿瘤坏死因子α减少，致肿瘤坏死因子α诱导形成破骨细胞与活化破骨细胞增加，从而促进骨吸收有关。
综上所述，本实验表明，甲状旁腺激素具有抑制成骨样细胞膜型基质金属蛋白酶1表达的作用，甲状旁腺激素可能通过抑制成骨细胞膜型基质金属蛋白酶1表达促进骨吸收，此可能为甲状旁腺激素诱导骨吸收的作用途径之一。

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