Effects of Chinese medicine Gukang on the expression of insulin-like growth factor 1 in osteoblasts
Zhao Ke-wei1, Pan Kun-ru2, Yin Ling-fan3, Zhuang Hong1

Abstract
BACKGROUND: Chinese medicine Gukang has a clear effect of clinical treatment of osteoporosis.
OBJECTIVE: To investigate the effects of Chinese medicine Gukang on the expression of insulin-like growth factor 1 (IGF-1) in osteoblasts at the hypothesis of Chinese medicine Gukang possesses the regulating effect on osteoblasts identical with the estrogen.
DESIGN, TIME AND SETTING: A randomized control experiment of cytokine detection in vitro was performed at Cellular Culture Laboratory, Affiliated Orthopedic Hospital of Guangzhou Chinese Traditional Medicine University between September 2005 and April 2007. 　
MATERIALS: Ten SD neonatal rats were used for the separation and culture of osteoblasts, and ten New Zealand rabbits were used to prepare the drug serum and then were divided into 5 groups randomly: normal control group, high-, middle-, low-concentration groups and estradiol group. Each group contained two rabbits of either gender.
METHODS: Based on the surface area, the rabbits in the high-, middle-, and low-concentration groups were intragastrically administrated with 9.6, 4.8 and 2.4 g/kg serum containing Gukang. Estradiol group was intragastrically administrated with 15% estradiol solution, while the normal control group was given normal saline for 1 week. Two hours after the last administration, blood samples were taken from the heart of each rabbit. Then serum was collected. Osteoblasts at passage 3 were digested with 0.25% pancreatin, and the suspension at the final concentration of 1×107 L-1 was inoculated into 24-well culture plates. Cellular attachment was observed 24 hours later, and meanwhile 10% serum containing corresponding drugs were added to the medium. The supernatant collection was performed 4 days later.
MAIN OUTCOME MEASURES: Enzyme-linked immunosorbent assay techniques were used to detect the expression of IGF-1 in supernatant.
RESULTS: Expression of IGF-1 in osteoblasts in the serum containing the high and middle concentrations of Gukang and estradiol was increased compared with that in the normal control group (P < 0.05). The serum containing low concentration of Gukang was inferior to the high concentration of Gukang and the estradiol (P < 0.05). IGF-1 expression was of insignificant differences between the high concentration group and the estradiol group, and between the low concentration group and the normal control group (P > 0.05).
CONCLUSION: The serum containing certain concentration of Chinese medicine Gukang can increase the secretion of IGF-1 in osteoblasts, and the effect is the same as that of estradiol.

Zhao KW, Pan KR, Yin LF, Zhuang H. Effects of Chinese medicine Gukang on the expression of insulin-like growth factor 1 in osteoblasts.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(28):5414-5417(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-28/28k-5414(ps).pdf]

摘要
背景：中药骨康在临床上有明确的治疗骨质疏松的疗效。
目的：假设中药骨康与雌激素同样具有调节成骨细胞的作用，观察其对成骨细胞胰岛素生长因子1表达的影响。
设计、时间及地点：随机对照观察实验，体外细胞因子检测，于2005-09/2007-04在广州中医药大学附属骨伤科医院细胞培养实验室完成。
材料：新生24 h内的SD乳鼠，用于成骨细胞的分离培养。新西兰大白兔10只，用于制备药物血清。随机分为5 组：空白对照组，中药骨康9.6 g/kg、4.8 g/kg、2.4 g/kg含药血清组及雌二醇含药血清组,每组2只，雌雄各半。
方法：各组大白兔按体表面积的方法给予中药骨康方的提取药物、雌激素和生理盐水灌胃，连续给药1 周。最后一次用药后2 h行心脏采血，分离血清。取第3 代成骨细胞,经0.25%胰酶消化,将细胞悬液以终浓度1×107 L-1 接种到24孔培养板中，24 h细胞贴壁后换为含10%各组血清的培养液，培养4 d后收集培养上清液。
主要观察指标：用酶联免疫吸附法检测培养上清液中胰岛素样生长因子1的含量。
结果：中药骨康9.6 g/kg、4.8 g/kg组和雌二醇组胰岛素样生长因子1水平高于空白对照组（P < 0.05）, 中药骨康9.6 g/kg组和雌二醇组胰岛素样生长因子1水平高于中药骨康2.4 g/kg组（P < 0.05），中药骨康9.6 g/kg组和雌二醇组之间比较差异无显著性（P > 0.05）, 中药骨康2.4 g/kg组与空白对照组比较差异无显著性（P > 0.05）。
结论：骨康用药量达到一定程度时，在促进成骨细胞生成胰岛素生长因子1方面的能力与雌二醇一致。
关键词：中药骨康；成骨细胞；胰岛素生长因子1

赵可伟，潘昆如，尹凌凡，庄洪. 中药骨康对成骨细胞分泌胰岛素样生长因子1的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(28):5414-5417 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-28/28k-5414(ps).pdf]

>>本文导读<<

作者介绍：本文第四作者庄洪教授，博士生导师，广州中医药大学中医骨伤科学学科带头人之一，先后主持参与国家新药研究基金项目、国家教育部骨干教师资助计划项目、国家中医药管理局重点课题、省科委攻关项目及国际合作项目、省教育厅自然科学基金项目、省中医药管理局科研课题及市科委攻关项目等10多项科研课题的研究工作。指导了本实验设计和文章审校。

临床应用性：一定浓度的中药骨康在促进成骨细胞产生胰岛素样生长因子1方面与雌激素作用一致,推测该药具有类雌激素作用，能调节胰岛素样生长因子1等细胞因子的分泌状态，通过复杂的细胞因子网络的相互作用达到治疗骨质疏松的效果。

偏倚或不足：涉及和影响调节骨生长的细胞因子很多，课题仅检测了单个细胞因子的含量，比较单一。实验亦仅停留在蛋白质含量层面，未能深入到基因层面进行分析，未能深入探讨药物是通过何种信息传导途径影响成骨细胞生长和发育。

0 引言

正常骨组织的代谢,包括由成骨细胞调节的骨形成和破骨细胞调节的骨吸收及其之间的平衡。其中，骨形成对人体骨组织的正常生长和维持其正常功能非常重要。长期以来，传统中药被应用于治疗以骨形成减少、骨吸收增加，骨量减少为特征的骨质疏松症，疗效显著。以往研究表明,中药骨康对绝经后骨质疏松症具有明显的治疗作用[1-2]，动物实验也表明中药骨康能提高去势大鼠的骨密度[3]。本实验采用酶联免疫的方法,观察中药骨康含药血清对体外培养成骨细胞胰岛素样生长因子1表达的影响，以期从细胞分子水平探讨其治疗骨质疏松症的机制。

1 材料和方法

设计：随机对照实验，体外细胞因子检测。
时间及地点：实验于2005-09/2007-03在广州中医药大学附属骨伤科医院细胞培养实验室完成。
材料：新生24 h内的SD乳鼠，用于成骨细胞的分离培养。新西兰大白兔10只，雌雄各半，体质量2.5~3.0 kg (由广州中医药大学动物实验中心提供，批号0014840)，用于制备药物血清。将10只新西兰大白兔随机分为5 组，空白对照组、中药骨康9.6 g/kg、4.8 g/kg、2.4 g/kg含药血清组及雌二醇含药血清组，每组2只，雌雄各半。

方法：
中药骨康方组成及方解：补骨脂，制淫羊藿，肉苁蓉，熟地，白芍，黄芪，菟丝子，丹参，当归，大枣。该方以补骨脂补肾助阳壮骨为君药，辅以肉苁蓉、淫羊藿、菟丝子、熟地、白芍补肾滋阴益精为臣药，配以黄芪补中益气，丹参、当归活血通络，共为佐药，再以大枣调中和胃为使药。
中药骨康药物的制备：该方的提取药物含生药量1.43 g/mL,常规水煎制,浓缩,生药含量为1.43 g/mL。根据临床用药剂量及新药研究中动物用药剂量要求，生药按高剂量9.6 g /kg、中剂量4.8 g /kg、低剂量2.4 g/kg体质量配制，相当于临床剂量的20倍、10倍、5倍，药物以蒸馏水定容至所需浓度。
雌激素制成液：为15%的雌二醇溶液。
各组血清的制备[4-7]:按体表面积的方法给予中药骨康方的提取药物、雌激素和生理盐水灌胃，灌胃给药容积为17.5 mL/kg体质量，每天2次，间隔5 h，连续灌胃 7 d。各组大白兔于最后1次用药后2 h行心脏采血。离心3 000 r/min，20 min，取上清，56 ℃水浴灭活30 min，经0.45 μm滤膜抽滤除菌，分装，-20 ℃保存备用。
成骨细胞的分离与培养[8]:取24 h 内新生SD乳鼠，拉颈处死置入盛有75%乙醇的容器中，消毒5~10 min，取出放入平皿中。于无菌条件下取出颅骨，放入4 ℃预冷的PBS(pH 7.2) 中，去除附着的骨膜及周围的结缔组织，用PBS 洗2 次后，将洗净的颅骨剪成1 mm×1 mm小片，移入0.25 %胰蛋白酶中37 ℃下预消化15~20 min，再将骨片移入另一含1 g/L Ⅱ型胶原酶的溶液中37 ℃消化60 min，使细胞从基质中解离出来。置上述胶原酶消化液于离心管中，1 000 r/min 离心3 min，弃上清液，用DMEM培养液将沉淀洗一两次后制成细胞悬液,重复以上步骤，将2次消化获得的细胞混匀，以终浓度1× 107 L-1接种于培养瓶内。在37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养，24 h后换液，除去未贴壁的细胞，以后每两三天换液1次。传代培养：培养5~7 d，细胞长成致密单层，铺满培养瓶底，即可进行传代。以0.25%胰蛋白酶使贴壁细胞消化松解，轻摇培养瓶，细胞即脱壁，以终浓度1×107 L-1 接种于培养瓶内，进行传代培养，取第3代细胞供实验用。
含药血清的添加:取第3 代成骨细胞，经0.25%胰酶消化，将细胞悬液以终浓度1×107 L-1 接种到24孔培养板中，24 h细胞贴壁后换为含10%各组血清的培养液，每组8孔。培养48 h后半换液1次，连续培养4 d后，收集培养上清液，-20 ℃保存备用。
骨细胞胰岛素样生长因子1水平的检测：采用酶联免疫试剂盒，按试剂说明进行检测(试剂盒的灵敏1.9~ 1 000 mg /L、批内变异系数2.3%，批间变异系数7.8%)，酶标仪测定各孔吸光度值读数，以标准品浓度和吸光度值作标准曲线，各孔数值根据标准曲线得出。
主要观察指标：含药血清对成骨细胞分泌胰岛素样生长因子1水平的影响。
设计、实施、评估者：实验设计和实施为第一作者、资料收集为第二作者、评估为第四作者，评估采用非盲法。
统计学分析:实验结果由第三作者以SPSS 13.0数据统计软件包处理，结果采用x(_)±s表示,采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法。P < 0.05表示差异有显著性意义。

2 结果

2.1 实验动物数量分析 参加实验动物均成功制备含药血清。
2.2 中药骨康对成骨细胞分泌胰岛素样生长因子1水平的影响 中药骨康9.6 g/kg、4.8 g/kg组和雌二醇组胰岛素样生长因子1水平高于空白对照组（P < 0.05），中药骨康9.6 g/kg组和雌二醇组胰岛素样生长因子1水平高于中药骨康2.4 g/kg组（P < 0.05），中药骨康9.6 g/kg组和雌二醇组之间比较差异无显著性（P > 0.05），中药骨康 2.4 g/kg组与空白对照组比较差异无显著性（P > 0.05）。见表1。

3 讨论

胰岛素样生长因子1是骨基质中含量最丰富的生长因子，由成骨细胞生成，并通过自分泌和旁分泌的方式促进成骨细胞增殖分化和胶原合成。胰岛素样生长因子1刺激成骨细胞先祖出现[9-11]，促进成骨细胞前体增殖，使有功能的成骨细胞数目增加; 胰岛素样生长因子1在成骨细胞生长过程中可作为存活因子而抑制细胞的凋亡，提高成骨细胞的存活能力[12]。胰岛素样生长因子1对骨吸收也有调节作用，破骨细胞有胰岛素样生长因子1受体的表达。在体外，胰岛素样生长因子1通过成骨细胞的作用间接促进破骨细胞生成，并增强其活性[13]。生理量的胰岛素样生长因子1可以下调骨保护素的表达。另一方面，胰岛素样生长因子1也是成骨细胞-破骨细胞的耦联因子，调节成骨细胞骨保护素和RANKL的表达。在骨重建中，可以促进骨形成和骨吸收两个过程，其中促进骨吸收是通过骨保护素/RANKL系统介导[14]。所以，胰岛素样生长因子1可在直接和间接两方面促进破骨细胞实现骨吸收：前者通过刺激破骨细胞和破骨细胞前身的活化而实现；后者通过分泌过多RANKL抑制骨保护素，使RANKL与破骨细胞上RANK受体的活性增加而达成。
除了对骨细胞的直接作用外，胰岛素样生长因子1也是骨重建过程中重要的细胞因子。生长激素能刺激成骨细胞骨形成和破骨细胞骨吸收，其作用于破骨细胞前体细胞的成熟或通过对基质细胞的影响间接激活成熟破骨细胞促进骨吸收,而胰岛素样生长因子1参与生长激素对成骨细胞、破骨细胞功能调节和促进骨重建[15]；甲状旁腺激素可促使骨表面衬细胞分泌胶原酶消化骨前质,暴露破骨细胞可以吸收的矿化基质从而启动骨吸收，甲状旁腺激素对骨吸收这一的作用也需要胰岛素样生长因子1介导:破骨细胞表面无甲状旁腺激素受体,体外实验发现甲状旁腺激素、PTHrP通过cAMP机制,促进成骨细胞样细胞系增加胰岛素样生长因子1,胰岛素样生长因子结合蛋白3，4，5转录、多肽分泌和骨型胶原合成,同时加速骨钙素合成，加速骨重建，其中胰岛素样生长因子1是有效的促进剂[16]。由于胰岛素样生长因子1在骨重建细胞因子网络中所处的的关键地位，本次实验特选取该因子作为中药骨康对骨重建细胞因子网络影响的观察指标。
从本实验结果可知：高、中剂量组和雌二醇组在促进成骨细胞生成胰岛素样生长因子1方面的能力一致；低剂量组与空白对照组比较无统计学差异（P > 0.05），说明低剂量对于成骨细胞分泌胰岛素样生长因子1帮助不大。也就是说，高浓度的中药骨康能够促使成骨细胞分泌胰岛素样生长因子1，起到治疗骨质疏松症的作用，这可能是中药骨康治疗骨质疏松的机制之一。
目前，在临床治疗绝经后骨质疏松时常用雌激素替代疗法。近年来研究发现,成骨细胞及破骨细胞上均有雌激素受体[17-18];雌激素可通过其受体直接调节它们的活性。雌激素可使成骨细胞合成骨胶原增加，碱性磷酸酶活性增强；同时，外源性雌激素可促进大鼠成骨细胞产生胰岛素样生长因子1及转化生长因子B, 并通过这些生长因子的产生,促进骨形成[19-20]。但雌激素治疗可导致患乳腺癌、子宫癌、结石及深部静脉血栓的风险增高，因此是否采用雌激素治疗原发性骨质疏松症一直有不同的看法。本实验发现，中药在促进成骨细胞产生胰岛素样生长因子1方面与雌激素作用一致（P > 0.05）,推测该药具有类雌激素作用，能调节胰岛素样生长因子1等细胞因子的分泌状态，通过复杂的细胞因子网络的相互作用达到治疗骨质疏松的效果；另一方面，中药性质温和、毒副作用少、几乎没有不良反应，相比西药而言更适合长期用药。

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