Expression of vascular smooth muscle cell PGC-1，NRF-1 and mtTFA
Wu Wen-sheng1, Liu Gui-nan1, Huo Hai-yang1, Chen Min2，Zheng Xian2，Mao Dan2

Abstract
BACKGROUND: Mitochondria may participate in the complex process that vascular smooth muscle cells transform from contractile state to synthetic state.
OBJECTIVE: To observe the effect of PGC-1/NRF-1/mtTFA pathway associated with mitochondrial function on the proliferation of vascular smooth muscle cells.
DESIGN, TIME AND SETTING: Contrast observation was conducted in January 2007 at Central Laboratory, the First Affiliated Hospital of China Medical University.
MATERIALS: Oxidized low-density lipoprotein (Xiehe Institute of Chinese Academy of Sciences, China); sodium azide (Shenyang Branch of Sinopharm Chemcial Reagent Co., Ltd., China); smooth muscle cells of human umbiblical artery (Wuhan Uscn Sciences Co., Ltd., China).
METHODS: There were 4 groups in the experiment, the control group was given normal medium; oxidized low-density lipoprotein group was treated by routine medium supplemented with 10 mg/L oxidized low-density lipoprotein for 24 hours; in antisense PGC-1 group, based on the oxidized low-density lipoprotein intervention, cells were seeded on a 6-well plate at the density of 1×108 L-1, and then added prepared 70 μL antisense PGC-1 oligonucleotide liposome complex, and added fetal bovine serum and medium 6 hours later; in sodium azide group, cells were treated by medium supplemented with 10 mg/L oxidized low-density lipoprotein and 32 mmol/L sodium azide for 24 hours.
MAIN OUTCOME MEASURES: The expression of PGC-1, NRF-1 and mtTFA protein of cultured cells after intervention in each group were detected by western blotting. Changes of mitochondrial function were observed after intervention in each group. Cell viability was detected by methyl thiazolyl tetrazolium colorimetric assay.
RESULTS: Compared with control group, the expression of PGC-1, NRF-1 and mtTFA protein, enzyme activity of mitochondrial cytochrome c oxidase and cell proliferation activity increased in the oxidized low-density lipoprotein group (P < 0.05). Compared with oxidized low-density lipoprotein group, the expression of PGC-1, NRF-1 and mtTFA protein, enzyme activity of mitochondrial cytochrome c oxidase and cell proliferation activity decreased in the antisense PGC-1 group (P < 0.05). In the sodium azide group, the expression of PGC-1, NRF-1 and mtTFA protein, enzyme activity of mitochondrial cytochrome c oxidase decreased (P < 0.05), cell proliferation was inhibited (P < 0.05).
CONCLUSION: PGC-1/NRF/mtTFA signal transduction pathway influences the growth status of cells through changing the mitochondrial function in the proliferation of human vascular smooth muscle cells.

Wu WS, Liu GN, Huo HY, Chen M，Zheng X，Mao D. Expression of vascular smooth muscle cell PGC-1，NRF-1 and mtTFA.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(28):5418-5421(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-28/28k-5418(ps).pdf]

摘要
背景：血管平滑肌细胞由收缩型向合成型的转变过程中线粒体可能参与了这个复杂的过程。
目的：拟观察线粒体功能相关的PGC-1/NRF-1/mtTFA通路在人血管平滑肌细胞增殖中的作用。
设计、时间及地点：分组设计，对比观察，于2007-01在中国医科大学附属一院中心实验室完成。
材料：氧化型低密度脂蛋白由中科院协和研究所提供；叠氮钠由国药集团化学试剂有限公司沈阳分公司提供；人脐动脉平滑肌细胞由中美科技有限公司提供。
方法：实验分为4组，对照组予以正常培养基；氧化型低密度脂蛋白组常规培养基中加入氧化型低密度脂蛋白使其终浓度达到10 mg/L 作用24 h；PGC-1反义组在氧化型低密度脂蛋白组干预措施的基础上，将细胞以1×108 L-1 的密度接种于6孔板上，并将配置好的反义PGC-1寡核苷酸脂质体复合物70 μL 加入各孔，6 h 后补充小牛血清和培养基；叠氮钠组在氧化型低密度脂蛋白组干预措施的基础上，培养基中加入叠氮钠使其终浓度达到32 mmol/L 作用24 h。
主要观察指标：蛋白免疫印迹检测各组干预后培养细胞中PGC-1、NRF-1和mtTFA蛋白表达。观察各组干预完成后线粒体功能改变。四甲基偶氮唑盐比色法检测各组细胞活性。
结果：与对照组相比，氧化型低密度脂蛋白组PGC-1、NRF、mtTFA蛋白表达、线粒体细胞色素C氧化酶酶活性及细胞增殖活性均增加（P < 0.05）。与氧化型低密度脂蛋白组相比，PGC-1反义组PGC-1、NRF-1和mtTFA的蛋白表达减少、线粒体细胞色素C氧化酶酶活性及细胞增殖活性均下降（P < 0.05）；叠氮钠组PGC-1、NRF、mtTFA蛋白表达及细胞色素C氧化酶酶活性降低（P < 0.05）；细胞增殖受到抑制（P < 0.05）。
结论：PGC-1/NRF/mtTFA信号传导途径在人血管平滑肌细胞增生过程中通过改变线粒体功能影响细胞的生长状态。
关键词：血管平滑肌细胞；过氧化物酶体增生激活受体γ协同刺激因子；核呼吸因子；线粒体转录因子

吴文胜，刘闺男，霍海洋，陈民，郑娴，毛丹. 人血管平滑肌细胞PGC-1/NRF-1/mtTFA的表达[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(28):5418-5421 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-28/28k-5418(ps).pdf]

>>本文导读<<

临床应用性：实验通过氧化型低密度脂蛋白诱导平滑肌细胞增殖，检测了在这一过程中，PGC-1、NRF和mtTFA的改变，发现氧化型低密度脂蛋白可以上调PGC-1的表达，而NRF和mtTFA的表达同样会上调。用反义核苷酸抑制PGC-1后，NRF-1、mtTFA被明显抑制，平滑肌细胞细胞色素C氧化酶的活性也被抑制，最终导致线粒体功能改变，细胞增殖减少，从而证明了PGC-1/NRF/mtTFA这一线粒体传导通路在平滑肌细胞中的存在和作用。

相关链接：过氧化物酶体增生激活受体γ协同刺激因子（PGC）是近年来发现的一种转录协同刺激因子。目前研究证实PGC-1能增加与氧化磷酸化有关基因的表达，而且能够刺激线粒体的生成，在PGC-1的作用下，线粒体DNA增加了2倍以上。

偏倚或不足：PGC-1反义寡脱氧核苷酸体外转染细胞效率可能影响PGC-1的测量值，而叠氮钠对细胞色素C氧化酶抑制的特异性还有待考证。这些不确定性可能影响了结果的精确性。

0 引言

氧化型低密度脂蛋白能够引起血管内皮细胞功能障碍和内皮细胞损伤，造成胶原暴露，还可与平滑肌细胞表面清道夫受体结合，导致平滑肌细胞内吞氧化型低密度脂蛋白，平滑肌细胞吞噬大量氧化型低密度脂蛋白后形成泡沫细胞，而且氧化型低密度脂蛋白能强烈地促进血管平滑肌细胞由中膜向内膜下迁移并不断增殖，这就导致在动脉粥样硬化形成过程中血管壁增厚、管腔变窄。在体外培养的细胞中，应用外加低浓度氧化型低密度脂蛋白也可以诱导平滑肌细胞的增殖[1]。
在致病因素的作用下，血管平滑肌细胞产生了表型的转化并增殖，电镜证实平滑肌细胞线粒体参与了表型转化。在表型改变的过程中平滑肌细胞的细胞器发生改变，如：核糖体、粗面内质网、高尔基体以及线粒体的大量增加，线粒体在平滑肌细胞表型转变中起了重要的作用，目前没有证据表明，线粒体功能改变在平滑肌细胞的增殖和迁移中起主导的作用，但它可以说是在这个过程中重要的环节之一。在动脉粥样硬化形成过程中，平滑肌细胞由收缩型向合成型的转变机制是个复杂的过程，可能涉及到与增殖、迁移、凋亡以及吞噬等多种生物学行为相关的基因，但在完成这些功能活动时，线粒体作为能量的提供工厂，是必不可少的。对过氧化物、氧自由基的清除也是其功能的一部分。另外，线粒体也是细胞凋亡相关的重要细胞器。线粒体的这些功能可能与平滑肌细胞功能转变的需求有关。叠氮钠是线粒体细胞色素C氧化酶特异性抑制剂[2]，细胞色素C氧化酶是线粒体的标志酶，是能量代谢过程中的关键酶。
血管动脉粥样硬化形成时，血管平滑肌细胞表型转化和增殖是如何发生的？在前期的研究中，笔者通过建立高脂动脉粥样硬化的动物模型，检测了在粥样硬化形成过程中平滑肌细胞表型的改变，以及平滑肌细胞与线粒体功能相关的基因PGC-1、NRF-1和mtTFA，发现在平滑肌细胞表型转变过程中，可能存在PGC-1/NRF/mtTFA信号传导途径，为进一步探讨其可能的作用机制，本实验应用氧化型低密度脂蛋白成功地诱导了平滑肌细胞的增殖，并在细胞培养的体外实验中应用干预方法进行检验。

1 材料和方法

设计：分组设计，对比观察。
时间及地点：实验于2007-01在中国医科大学附属第一医院中心实验室完成。

实验过程：
细胞培养：人脐动脉平滑肌细胞用DMEM培养基(内含体积分数为0.1胎牛血清、4 mmol/L 谷氨酰胺）培养。置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2细胞培养箱中培养，用2.5 g/L 胰蛋白酶消化传代，2%锥虫蓝染色判断细胞活性，活细胞占细胞总数的96%以上，用于实验。
实验分组：实验分为4组，对照组予以正常培养基；氧化型低密度脂蛋白组常规培养基中加入氧化型低密度脂蛋白使其终浓度达到10 mg/L 作用24 h；PGC-1反义组在氧化型低密度脂蛋白组干预措施的基础上，将细胞以1×108 L-1 的密度接种于6孔板上，培养至覆盖培养底物80%左右。去除培养基，用新鲜无血清培养基漂洗细胞，各孔加入PGC-1反义寡核苷酸脂质体复合物70 μL (含PGC-1反义寡核苷酸1 μg、Lipofectamine 2000 4 μL、DMEM约66 μL)，置培养箱中培养。6 h 后补充小牛血清和培养基，使血清终浓度为10%，继续培养待用；叠氮钠组在氧化型低密度脂蛋白组干预措施的基础上，培养基中加入叠氮钠使其终浓度达到32 mmol/L 作用24 h。
检测指标：
各组PGC-1、NRF-1及mtTFA蛋白表达的水平：应用Western-Blot方法，检测各组干预完成后培养细胞中PGC-1、NRF-1和mtTFA蛋白表达的水平，β-肌动蛋白内参对照。计算条带与β-肌动蛋白吸光度(A)的比值。
线粒体功能：检测各组干预完成后线粒体功能改变，线粒体提取及功能测定按试剂盒说明操作。以线粒体细胞色素C氧化酶活性改变为线粒体功能标志。
四甲基偶氮唑盐比色法检测细胞活性：应用四甲基偶氮唑盐法检测各组干预完成后培养细胞的活性。酶联免疫检测仪下选择波长490 nm 测定各孔的吸光度（A）值。细胞增殖率(%)=(实验组A值－对照组A值)/对照组A值×100%。
主要观察指标：各组PGC-1、NRF-1及mtTFA蛋白表达的水平，线粒体细胞色素C氧化酶活性及细胞增殖率。
设计、实施、评估者：实验设计为第一作者，干预实施为第四作者，评估为第二、三作者。经过正规培训，采用盲法评估。
统计学分析：由第五、六作者采用SPSS 11.5软件完成统计处理，P < 0.05为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 各组PGC-1/NRF-1/mtTFA蛋白水平改变 见表1。

由表1可知，细胞培养中加入氧化型低密度脂蛋白后PGC-1、NRF、mtTFA蛋白表达增加（P < 0.05）。与氧化型低密度脂蛋白组相比，PGC-1反义组和叠氮钠组PGC-1、NRF-1和mtTFA的蛋白表达均减少（P < 0.05）。蛋白免疫印迹电泳图检测结果，见图1。
2.2 各组线粒体细胞色素C氧化酶活性改变 见表2。
在平滑肌细胞培养中加入氧化型低密度脂蛋白后线粒体细胞色素C氧化酶活性增加（P < 0.05）；而与氧化型低密度脂蛋白组相比，PGC-1反义组和叠氮钠组的细胞色素C氧化酶酶活性均下降（P < 0.05），以后者尤为显著。

2.3 各组细胞增殖活性的改变 见表3。

PGC-1反义组和叠氮钠组细胞增殖率与氧化型低密度脂蛋白组相比显著下降（P < 0.05）。

3 讨论

本文应用叠氮钠抑制细胞色素C氧化酶，使得线粒体的氧化磷酸化过程以及与细胞凋亡相关过程受阻，从而使氧化型低密度脂蛋白诱导平滑肌细胞的增殖受到抑制。而单纯用氧化型低密度脂蛋白诱导的平滑肌细胞线粒体细胞色素C活性是增加的，表明线粒体功能与平滑肌细胞增殖有关，线粒体功能障碍导致线粒体功能减少，不能满足细胞增殖分裂的需要，故而抑制了细胞的增殖。
线粒体的增殖和功能的调控是由核DNA和线粒体DNA共同控制的，核对线粒体DNA的调控是通过mtTFA来实现的，mtTFA是线粒体DNA转录和复制的必需调控因子，是作用于mtDNA启动基因的转录因子，mtTFA易位到线粒体，在线粒体RNA聚合酶作用下，通过调节mtDNA轻链和重链的转录而控制mtDNA的转录和复制[4]，mtTFA可能既对mtDNA转录起调节作用，又是mtDNA稳定所需要的简单蛋白质，mtTFA含量与mtDNA含量相关[5]，有报道显示利用反义寡核苷技术增加培养细胞的mtTFA表达，可以造成细胞内mtDNA编码的酶增加，包括细胞色素C氧化酶Ⅰ，Ⅲ亚基，反之则减少细胞色素C氧化酶亚基的表达。这些研究结果说明mtTFA是线粒体功能改变的关键。
mtTFA编码基因最关键启动子的激活高度依赖于NRF-1和NRF-2，而又以NRF-1的结合起决定作用，NRF-1既可直接调节核基因组编码的呼吸链亚基的表达，又可通过调节mtTFA而调节线粒体基因组的转录、翻译等，从而间接调节线粒体基因组编码的呼吸链亚基的表达[6]，还可以维持mtDNA的稳定[7]。NRF及mtTFA是目前已经证实的与线粒体功能相关的转录因子。
与激活NRF关系密切的因子是过氧化物酶体增生激活受体γ协同刺激因子[8]，它是近年来发现的一种转录协同刺激因子。过表达PGC-1能增加NRF的mRNA的水平，PGC-1上有NRF及肌细胞物异性增强子2C结合的位点[9]。目前研究证实PGC-1能增加与氧化磷酸化有关基因的表达，而且能够刺激线粒体的生成，在PGC-1的作用下，线粒体DNA增加了2倍以上[9]。PGC-1刺激线粒体生成主要通过2个途径：①PGC-1调节线粒体转录、复制的调节因子[10]。②PGC-1还能通过协同刺激NRF-1而增加异位表达NRF-1的转录活性[11]。
本实验通过氧化型低密度脂蛋白诱导平滑肌细胞增殖，检测了在这一过程中，PGC-1、NRF和mtTFA改变，发现3者具有显著相关性，氧化型低密度脂蛋白可以上调PGC-1的表达，而NRF和mtTFA的表达同样会上调。用反义核苷酸抑制PGC-1后，NRF-1、mtTFA被明显抑制，平滑肌细胞细胞色素C氧化酶的活性也被抑制，最终导致线粒体功能改变，细胞增殖减少，从而证明了PGC-1/NRF/mtTFA这一线粒体传导通路在平滑肌细胞中的存在和作用。本实验中mtTFA被抑制的程度小于NRF-1被抑制的程度，考虑可能有其他通路调控mtTFA。国外有研究通过反义技术干预mtTFA，同样抑制了培养中平滑肌细胞的增殖，这个研究结果也说明了线粒体在平滑肌细胞增殖中的作用。氧化型低密度脂蛋白可以上调PGC-1的表达，而NRF和mtTFA的表达同样会上调。

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