张? 丽，沈成兴，冯? 毅，马根山 |
Effects of glycated albumin on the expression of monocyte chemoattractant protein-1 in human umbilical vein endothelial cells
Zhang Li, Shen Cheng-xing, Feng Yi, Ma Gen-shan
Abstract
BACKGROUND: Previous study reveals that, glycated albumin plays an important role on the apoptosis of endothelial cells and the expression of monocyte chemoattractant protein-1 through increasing the activity of mitogen activated protein kinase and protein tyrosine kinase, besides generating active oxygen products.
OBJECTIVE: To investigate the effects of glycated albumin on the expression of monocyte chemoattractant protein-1 in the cultured human umbilical vein endothelial cells (HUVECs).
DESIGN, TIME AND SETTING: A single sample observation was carried out in the Cardiovascular Laboratory of Southeast University (Nanjing, Jiangsu, China) from May to November in 2006.
MATERIALS: ECV304 HUVEC strain was provided from Shanghai Institute of Cell Biology, Chinese Academy of Sciences (China).
METHODS: Experimental procedures were assigned to two parts. On one hand, HUVECs were cultured with glycated albumin of the concentration of 400 mg/L for 0, 8, 16, 24, 48, or 72 hours. On the other hand, HUVECs were cultured with glycated albumin of the concentrations of 100, 200, 400, and 800 mg/L for 24 hours. In the control group, HUVECs were incubated with bovine serum albumin of the concentration of 400 mg/L and RPMI 1640 culture medium without addition of the serum.
MAIN OUTCOME MEASURES: The proliferation of HUVECs was estimated by MTT colorimetric assay. The content of monocyte chemoattractant protein-1 in the supernatant was measured by enzyme-linked immunosorbent assay.
RESULTS: Glycated albumin inhibited the proliferation rate of HUVECs in a time-dependent manner (P < 0.05). The proliferation of cells cultured for 8 hours were not remarkably inhibited. However, the proliferation inhibiting effect on the cells cultured for 48 hours was significantly higher than that cultured for 72 hours. Compared to RPMI 1640 group and bovine serum albumin group, the proliferation inhibiting effect on cells cultured with 400 or 800 mg/L glycated albumin was significantly enhanced (P < 0.05). This increment suggested a dose-dependent manner. The expression of monocyte chemoattractant protein-1 in HUVECs cultured with 400 mg/L glycated albumin for 6 and 12 hours were significantly increased (P < 0.05) and reached a peak with 800 mg/L glycated albumin. Glycated albumin increased the expression of monocyte chemoattractant protein-1 in a time- and dose-dependent manner.
CONCLUSION: Glycated albumin inhibits the proliferation of cultured HUVECs in a time- and dose-dependent manner. To some extent, it also increases the expression of monocyte chemoattractant protein-1 in HUVECs at a time-dependent manner.
Zhang L, Shen CX, Feng Y, Ma GS.Effects of glycated albumin on the expression of monocyte chemoattractant protein-1 in human umbilical vein endothelial cells.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(28):5422-5426
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-28/28k-5422(ps).pdf]
摘要
背景：研究表明，糖化白蛋白在内皮细胞凋亡过程中发挥重要作用，并通过增加丝裂原活化蛋白激酶、酪氨酸激酶活性和产生活性氧产物介导单核细胞趋化因子1。
目的：观察糖化白蛋白对培养的人脐静脉内皮细胞的单核细胞趋化因子1表达的影响。
设计、时间及地点：单一样本观察，于2006-05/11在东南大学心血管实验室完成。
材料：脐静脉内皮建株人脐静脉内皮细胞ECV304，引自中国科学院上海细胞生物研究所。
方法：实验分两部分，第一部分以糖化白蛋白 (浓度为400 mg/L) 对人脐静脉内皮细胞分别干预0，8，16，24，48，72 h；第二部分以不同浓度 (100，200，400，800 mg/L) 的糖化白蛋白对人脐静脉内皮细胞干预24 h。两部分实验均用无血清培养基RPMI 1640和不含牛血清白蛋白葡萄糖干预 (浓度为400 mg/L) 的无血清培养基作为对照。
主要观察指标：四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法检测人脐静脉内皮细胞增殖，酶联免疫吸附法检测人脐静脉内皮细胞上清液单核细胞趋化因子1含量。
结果：①不同时间点糖化白蛋白对人脐静脉内皮细胞增殖的抑制作用依次为48 h > 24 h > 16 h （相临时间点比较，P均 < 0.05）；干预8 h对细胞的抑制无明显作用，72 h抑制作用弱于48 h。②与RPMI 1640组和牛血清白蛋白组相比，糖化白蛋白400 mg/L及800 mg/L对细胞的抑制作用明显增强（P < 0.05），并随着糖化白蛋白浓度的增高而增强。③用浓度为 400 mg/L的糖化白蛋白干预6 h及12 h，人脐静脉内皮细胞单核细胞趋化因子1表达持续升高（P < 0.05）；随着糖化白蛋白浓度加大，细胞的单核细胞趋化因子1表达进一步增高，800 mg/L时达到最高峰。
结论：①糖化白蛋白以浓度、时间依赖方式抑制人脐静脉内皮细胞增殖，并在一定时间范围内呈时间依赖性地增加人脐静脉内皮细胞表达单核细胞趋化因子1表达。
关键词：糖化白蛋白；单核细胞趋化因子1；人脐静脉内皮细胞；组织构建
张丽，沈成兴，冯毅，马根山.人脐静脉内皮细胞中单核细胞趋化因子1表达与糖化白蛋白的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(28):5422-5426 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-28/28k-5422(ps).pdf]
>>本文导读<<
课题背景：课题为江苏省卫生厅开放课题基金（WK0510）。拟验证在单核细胞趋化因子1等趋化因子的作用下，循环中的巨噬细胞和中性粒细胞等聚集在动脉壁启动炎症反应，巨噬细胞吞噬脂质形成泡沫细胞，血管平滑肌细胞增殖的反应。
应用要点：实验应用体外培养的人脐静脉内皮细胞，观察糖化白蛋白对人脐静脉内皮细胞表达单核细胞趋化因子1的影响。结果发现糖化白蛋白能明显诱导人脐静脉内皮细胞表达单核细胞趋化因子1。并且随着糖化白蛋白浓度增加和作用时间延长，单核细胞趋化因子1的表达也增加，呈剂量和时间依赖性。
术语解析：单核细胞趋化蛋白作为一种特异性单核细胞趋化因子,通过与单核细胞表面的CCR2的结合使血液中的单核细胞迁入血管内膜下,并活化为巨噬细胞,摄取已进入内膜并发生修饰的脂蛋白形成单核细胞源性泡沫细胞。
0 引言
糖化白蛋白是生物胺与还原糖在无酶条件下经复杂的重排、脱水及缩合而成的不可逆的共价产物[1-2]，本实验证以人脐静脉内皮细胞为实验对象，观察糖化白蛋白对人脐静脉内皮细胞的单核细胞趋化因子1表达的影响。
1 材料和方法
设计：单一样本观察。
时间及地点：实验于2006-05/11在东南大学心血管BSL-2级实验室完成。
材料：脐静脉内皮为建株人脐静脉内皮细胞ECV304(引自中国科学院上海细胞生物研究所)。
实验方法：
人脐静脉内皮细胞培养及鉴定：2.5 g/L胰蛋白酶(Gibco公司)消化人脐静脉内皮细胞，培养的人脐静脉内皮细胞其细胞形态学符合内皮细胞特征，抗人VIII因子抗体染色阳性。取2~3代内皮细胞用于下述 实验。
对人脐静脉内皮细胞的干预及四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法测定：将人脐静脉内皮细胞按密度 5×107 L-1移入96孔板中，待细胞长到次融合状态后换成无血清培养液饥饿24 h，然后弃去上清，加入干预培养液及对照，继续培养至设定时间。
四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法测定：每孔加入四甲基偶氮唑盐溶液 (5 g/L) 20μL，37 ℃，继续孵育4 h，终止培养小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入150 μL二甲基亚砜，振荡10 min，使结晶物充分溶解。选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。每种干预实验独立重复3次。
糖化白蛋白干预人脐静脉内皮细胞不同时间对细胞增殖的影响：实验组中加入糖化白蛋白 (浓度为 400 mg/L) 对人脐静脉内皮细胞分别干预0，8，16，24，48，72 h，分别用无血清培养基RPMI 1640和不含葡萄糖的牛血清白蛋白(浓度为400 mg/L) 无血清培养基作为对照。
不同浓度的糖化白蛋白对人脐静脉内皮细胞增殖的影响：实验组中分别加入不同浓度 (100，200，400， 800 mg/L) 的糖化白蛋白对人脐静脉内皮细胞干预 24 h，分别用无血清培养基RPMI 1640和不含葡萄糖牛血清白蛋白干预 (浓度为400 mg/L) 的无血清培养基作为对照。
主要观察指标：①糖化白蛋白干预人脐静脉内皮细胞不同时间对生长抑制的影响。②不同浓度的糖化白蛋白对人脐静脉内皮细胞生长的影响。③糖化白蛋白干预人脐静脉内皮细胞不同时间对单核细胞趋化因子1的影响。④不同浓度的糖化白蛋白对人脐静脉内皮细胞表达单核细胞趋化因子1的影响。
设计、实施、评估者：为本文作者，均受过专业培训。
2 结果
2.1 糖化白蛋白干预人脐静脉内皮细胞不同时间对生长抑制的影响 以倒置显微镜进行细胞形态学观察。
正常对照组：
细胞呈上皮型，紧贴瓶底，细胞密集，细胞间连接紧密，细胞增殖快，见图1a。
处理组：
细胞增殖受抑制，细胞数随糖化白蛋白的浓度增加而减少，细胞连接较松，上清液中有较多的浮起变圆细胞，细胞碎片也较多，贴壁细胞欠透明，部分发生皱缩，胞浆中有较多颗粒，见图1b，c，d。
四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法测定。
用浓度为400 mg/L的糖化白蛋白干预人脐静脉内皮细胞：
在0，8，16，24，48，72 h不同时间点细胞增殖受到抑制。
干预8 h：
对细胞的抑制无明显作用，与0 h相比P > 0.05。
干预16 h：
促进细胞抑制，与0 h相比有显著性差异（P < 0.05）。
干预48 h：
对细胞的抑制作用最明显，干预72 h增殖也受到抑制（P < 0.05）。
实验组与对照组间比较有显著性差异(P < 0.05)；RPMI 1640组和牛血清白蛋白组两对照组比较无明显差异(P > 0.05)。
2.2 不同浓度的糖化白蛋白对人脐静脉内皮细胞生长的影响
糖化白蛋白在浓度小于等于200 mg/L时：
干预人脐静脉内皮细胞24 h，对细胞的生长抑制尚无明显作用，与RPMI1640组和牛血清白蛋白组相比P > 0.05。
糖化白蛋白达到400 mg/L时：
干预人脐静脉内皮细胞24 h，对细胞的抑制作用明显增强，与RPMI 1640组和牛血清白蛋白组相比P < 0.05。
糖化白蛋白浓度增高至800 mg/L时：
干预人脐静脉内皮细胞24 h，对细胞抑制作用最明显P < 0.05，显示糖化白蛋白浓度在一定范围促进人脐静脉内皮细胞生长抑制，见表2。
2.3 糖化白蛋白干预人脐静脉内皮细胞不同时间对单核细胞趋化因子1的影响
用浓度为400 mg/L的糖化白蛋白干预人脐静脉内皮细胞 0，6，12 h：
干预6 h 人脐静脉内皮细胞的单核细胞趋化因子1表达即已升高，与0 h相比，P < 0.05。
干预12 h单核细胞趋化因子1表达持续增高，与0 h相比，P < 0.05。
在一定时间范围内糖化白蛋白呈时间依赖性地增加人脐静脉内皮细胞表达单核细胞趋化因子1，见表3。
2.4 以牛血清白蛋白组为对照，不同浓度的糖化白蛋白对人脐静脉内皮细胞表达单核细胞趋化因子1的影响
用浓度为100，200，400，800 mg/L的糖化白蛋白干预人脐静脉内皮细胞12 h：
糖化白蛋白在浓度为100 mg/L时，细胞的单核细胞趋化因子1表
达即已升高，与牛血清白蛋白组相比，P < 0.05。
随着糖化白蛋白浓度的增高，细胞的单核细胞趋化因子1表达进一步增高，800 mg/L时达到最高峰，见表4。
3 讨论
目前研究表明，通过糖化白蛋白诱导诱生型一氧化氮合酶引发的凋亡[3-5]，可看出在内皮细胞凋亡过程中，糖化白蛋白发挥的重要作用。在微血管和大血管中，伴随凋亡出现的内皮细胞层丢失，可能促进血浆同细胞外基质和平滑肌细胞的接触，从而激发与动脉粥样硬化相似的级联事件爆发。动脉粥样硬化病变区的凋亡较正常区域明显增多 (约高4倍)，当内皮细胞凋亡后，不但局部抗凝和纤溶机制削弱，而且凋亡的内皮细胞具有致凝作用，这些因素可以启动凝血机制，造成血管壁局部血栓形成。凋亡和增生的平衡是血管正常结构的保障。动脉粥样硬化中由于细胞凋亡过度和失去对细胞增生的制约，结果血管的细胞构成和功能异常，非细胞成分过多，促成粥样病变的同时，导致管壁变形变硬，血管重构。
本课题采用人脐静脉内皮细胞结果显示糖化白蛋白对细胞增殖起抑制作用。本实验观察不同浓度的糖化白蛋白对人脐静脉内皮细胞增殖的影响，结果显示了200 mg/L，400 mg/L糖化白蛋白抑制人脐静脉内皮细胞增殖，48 h增殖最明显，而在72 h增殖也受到抑制。本实验在一定程度上说明了糖化白蛋白通过抑制人脐静脉内皮细胞增殖从而引起内皮功能障碍。
研究表明当血糖水平比正常升高2倍，早期白蛋白糖基化产物从1.1%增加到2.8%[6]。尽管直接比较糖化白蛋白与糖基化终产物的生物效应较困难，但糖化白蛋白的浓度明显高于糖基化终产物，表明糖化白蛋白在促进动脉粥样硬化发展中发挥重要的作用。
单核细胞趋化因子1属于趋化因子类细胞因子，最早从鼠成纤维细胞中分离出来。单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞、成纤维细胞等都可表达单核细胞趋化因子1，高血糖、氧化应激、炎症及白细胞介素1、肿瘤坏死因子α等细胞因子可上调单核细胞趋化因子1的表达。血管内皮损伤及功能不良，黏附分子表达增加，化学增活剂的释放，单核细胞聚集，在单核细胞趋化因子1等趋化因子的作用下，循环中的巨噬细胞和中性粒细胞等聚集在动脉壁启动炎症反应，巨噬细胞吞噬脂质形成泡沫细胞，血管平滑肌细胞增殖，形成粥样斑块[7-8]。
糖基化终产物介导单核细胞趋化因子1、白细胞介素6等细胞因子的产生，Ehlermann等[9]用AGEP修饰蛋白预培养人脐静脉内皮细胞72 h后，再用异二聚体S100A8 /S100A9刺激48 h，人脐静脉内皮细胞分泌单核细胞趋化因子1明显增多。AGEP 诱导单核细胞趋化因子1表达增加是AGEP参与糖尿病动脉粥样硬化发生的机制之一。因此，糖化白蛋白也介导增加血管炎症反应的细胞趋化因子单核细胞趋化因子1，这对动脉粥样硬化的发展有重要影响。
本实验应用体外培养的人脐静脉内皮细胞，观察糖化白蛋白对人脐静脉内皮细胞表达单核细胞趋化因子1的影响。结果发现糖化白蛋白能明显诱导人脐静脉内皮细胞表达单核细胞趋化因子1。并且随着糖化白蛋白浓度增加和作用时间延长，单核细胞趋化因子1的表达也增加，呈剂量和时间依赖性。
糖化白蛋白通过增加丝裂原活化蛋白激酶、酪氨酸激酶活性和产生活性氧产物介导单核细胞趋化因子1。Takaishi等[10]在研究高糖环境中孵化的人脐静脉内皮细胞时发现，高糖血症通过p38丝裂原活化蛋白激酶、活性氧簇敏感信号转导通路加速了血管内皮细胞单核细胞趋化因子1mRNA表达和单核细胞趋化因子1的分泌，诱导单核细胞向大血管内皮聚集，从而导致血管内皮系统功能的损害引起动脉粥样硬化。血管内皮损伤及功能不良，黏附分子表达增加，化学增活剂的释放，单核细胞聚集，白细胞黏附及迁移，氧化型低密度脂蛋白被巨噬细胞摄取，泡沫细胞形成，活化的单核细胞释放细胞因子，平滑肌细胞迁移和增殖，最终形成粥样斑块。
并且单核细胞趋化因子1的表达和分泌与外周血糖的浓度呈正相关关系。糖尿病微血管病变主要表现在视网膜、肾、神经、心肌组织，其中主要是糖尿病肾病和视网膜病。Chow等[11]在2型糖尿病合并肾病的db/db大鼠模型中发现，持续的高糖状态、肾小球免疫复合物的沉积增加了肾脏单核细胞趋化因子1的产生，诱导单核/巨噬细胞在肾小球的聚集，从而加速了糖尿病肾病的发生和发展。
体内和体外实验均证实，在特定的受体介导作用下，血液中游离的糖化白蛋白或糖化血红蛋白(HbA1c)对单核细胞具有选择性趋化作用，当游移的单核细胞遇到组织中或血管壁上固定的糖基化产物便与之结合并被激活，合成并释放血小板源性生长因子、胰岛素样生长因子1 、白细胞介素1、肿瘤坏死因子和单核细胞趋化因子1等细胞因子，从而引起炎症反应、血管内膜损伤和平滑肌细胞增殖，逐渐形成粥样硬化斑块[12-13]。同时，糖化白蛋白与单核巨噬细胞上的受体结合后可刺激细胞内的释放，以旁分泌和自分泌的方式刺激单核巨噬细胞的生长，增强其功能和效应。
糖化白蛋白增加氧化应激反应和自由基损伤[14]，主要是由于随着Amadori产物形成，白蛋白分子构想发生移动[15]。在体外已证实了糖化白蛋白的直接病理影响，而相关的在体内研究表明糖化血清蛋白水平与冠心病冠脉病变严重程度有关[16-17]。有一些糖尿病肾病的发病机制的研究[18]，Abrass[19]发现动脉粥样硬化与进展的肾病有相似的致病机制。内皮功能障碍密切联系着糖尿病微血管和大血管病变，并且在动脉粥样硬化和肾小球硬化之间有相似的生化学和组织学的变化[20]。因此，糖化白蛋白具有多重的促动脉粥样硬化影响[21-22]。
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