Effects of compound herb of invigorating kidney and promoting blood flow on serum matrix metalloproteinases-3, tumor necrosis factor alpha, interleukin-1, hyaluronic acid, lipid peroxidation levels and superoxide dismutase activity in patients with knee osteoarthritis

Zeng Yi-rong, Fan Yue-guang, Wu Fan, Li Xian-peng, Fan Hai-jiao

Abstract
BACKGROUND: Compound herb of invigorating kidney and promoting blood flow can improve knee osteoarthritis, but its action mechanism is still unclear.
OBJECTIVE: To investigate the effects of compound herb of invigorating kidney and promoting blood flow on serum matrix metalloproteinases (MMP)-3, tumor necrosis factor (TNF)-α, interleukin-1, hyaluronic acid, lipid peroxidation and superoxide dismutase (SOD) levels in patients with knee osteoarthritis.
DESIGN, TIME AND SETTING: The case-control and own control experiments of cytokines and enzymology determination were performed at the Hip Center, First Affiliated Hospital, Guangzhou University of Chinese Medicine from September 2002 to January 2005.
PARTICIPANTS: Totally 42 patients with knee osteoarthritis were enrolled at the Out-patient clinic or Ward of First Affiliated Hospital, Guangzhou University of Chinese Medicine. They were randomized into 2 groups (n=21), an experimental group and a control group. Ten patients without joint diseases, who received internal fixation removal after fracture union, were enrolled as normal controls.
METHODS: Patients in the experimental group underwent compound herb of invigorating kidney and promoting blood flow. The compound herb was composed of eucommia bark, prepared rhizome of rehmannia, barbary wolfberry fruit, psoralea fruits, cyathula officinalis kuan, doubleteeth pubescent angelica root, flos carthami, papaya, szechwan lovge rhizome and salvia miltiorrhiza and costustroot. The compound herb was made by Guangzhou University of Chinese Medicine, China. Patients took once five pills, three times a day. Patients in the control group were orally administrated with Guxian tablet, once four tablets, three times a day. Thirty days were a course, totally one course.
MAIN OUTCOME MEASURES: Before treatment, and one course after treatment, serum MMP-3, TNF-α, interleukin-1 and hyaluronic acid in patients from the experimental and control groups were respectively detected by enzyme-linked immunosorbent assay, methyl thiazolyl tetrazolium (MTT), double antibody sandwich enzymelinked immurosorbent assay and radioimmunity. Serum lipid peroxidation and SOD levels were measured by the kit. These results were compared with that of normal controls.
RESULTS: MMP-3, interleukin-1 and hyaluronic acid levels in patients from the experimental and control groups were higher than in the normal control group before treatment (P < 0.01). After treatment of a course, MMP-3, interleukin-1, hyaluronic acid and lipid peroxidation levels were decreased in the experimental and control groups compared with that before treatment (P < 0.05-0.01), but serum SOD levels were higher than that before treatment (P < 0.05).
CONCLUSION: Compound herb of invigorating kidney and promoting blood flow has a similar effect as Guxian Tablet. The compound herb can be useful to treat knee osteoarthritis by decreasing MMP-3, TNF-α, interleukin-1 and hyaluronic acid levels, increasing SOD activity and inhibiting immune damage.

Zeng YR, Fan YG, Wu F, Li XP, Fan HJ. Effects of compound herb of invigorating kidney and promoting blood flow on serum matrix metalloproteinases-3, tumor necrosis factor alpha, interleukin-1, hyaluronic acid, lipid peroxidation levels and superoxide dismutase activity in patients with knee osteoarthritis.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(28):5436-5439(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-28/28k-5436(ps).pdf]

摘要
背景：补肾活血复方中药能改善膝骨关节炎患者的症状，但对其作用途径尚无统一认识。
目的：观察补肾活血复方中药对膝骨关节炎患者血清中基质金属蛋白酶3、肿瘤坏死因子α、白细胞介素1、透明质酸、脂质过氧化物含量及超氧化物歧化酶活性的影响。
设计、时间及地点：病例-对照及自身对照的细胞因子及酶学检测实验，于2002-09/2005-01在广州中医药大学第一附属医院髋中心完成。
对象：选择广州中医药大学第一附属医院门诊或病房收治的膝骨关节炎患者42例，按随机数字表法分为2组（n=21），即补肾活血中药组和骨仙片组。另外选择10例无关节疾病的骨折愈合后来本院拆除内固定的患者作为正常对照组。
方法：补肾活血中药组以补肾活血方治疗，中药复方由杜仲、熟地、枸杞子、补骨脂、川牛膝、独活、红花、木瓜、川芎、丹参和木香组成，由广州中医药大学第一附属医院自制，5片/次，3次/d；骨仙片组采用口服中成药骨仙片治疗，4片/次，3次/d。 30 d为1个疗程，共治疗1个疗程。
主要观察指标：补肾活血中药组和骨仙片组治疗前及治疗1个疗程后，分别采用酶联免疫法、四甲基偶氮唑蓝法、双抗体夹心酶联免疫吸附实验及放射免疫法测定患者血清基质金属蛋白酶3、肿瘤坏死因子α、白细胞介素1及透明质酸含量；应用试剂盒测定血清脂质过氧化物含量及超氧化物歧化酶活性，并与正常对照组对比。
结果：治疗前补肾活血中药组和骨仙片组患者血清基质金属蛋白酶3、白细胞介素1及透明质酸含量均高于正常对照组（P <
0.01）。治疗1个疗程后，补肾活血中药组和骨仙片组患者血清基质金属蛋白酶3、白细胞介素1、透明质酸及脂质过氧化物含量均低于治疗前（P < 0.05~0.01），血清超氧化物歧化酶活性高于治疗前（P < 0.05）。
结论：补肾活血中药与骨仙片具有类似的效果，可降低膝骨关节炎患者血清中的基质金属蛋白酶3、肿瘤坏死因子α、白细胞介素1和透明质酸含量，提高超氧化物歧化酶活性，抑制免疫损害进程，从而达到治疗膝骨关节炎的目的。
关键词：骨关节炎，膝/中药疗法；补肾；活血；金属蛋白酶类；肿瘤坏死因子；白细胞介素1；透明质酸；超氧化物歧化酶；过氧化脂质类

曾意荣，樊粤光，吴凡，李显澎，范海蛟. 膝骨关节炎患者血清基质金属蛋白酶3、肿瘤坏死因子α、白细胞介素1、透明质酸、脂质过氧化物含量及超氧化物歧化酶活性变化与补肾活血中药的干预[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(28):5436-5439 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-28/28k-5436(ps).pdf]

>>本文导读<<

应用要点：文章结果表明膝骨关节炎发病与患者血清基质金属蛋白酶3、肿瘤坏死因子α、白细胞介素1、透明质酸、脂质过氧化物含量及超氧化物歧化酶活性有关，补肾活血中药可降低血清中基质金属蛋白酶3、肿瘤坏死因子α、白细胞介素1和透明质酸含量，提高超氧化物歧化酶活性，抑制免疫损害进程。

同行评价：文章观察补肾活血中药对膝骨性关节炎患者血清基质金属蛋白酶3、肿瘤坏死因子α、白细胞介素1、透明质酸、脂质过氧化物含量及超氧化物歧化酶活性的影响，分析膝骨关节炎患者发病过程中细胞因子与补肾活血中药的相关性，选题较好。

相关链接：补肾活血复方中药能显著改善膝骨关节炎患者的症状，对其作用途径大部分学者认为与细胞因子在骨关节炎发病中的作用有关。

0 引言

膝骨关节炎基本病理特征为关节软骨组织发生进行性退变，关节边缘骨赘形成和软骨下骨质反应性改变，病变的过程涉及整个关节，病变结果通常最终导致膝关节功能丧失。引起关节出现骨关节炎病理变化主要有两种途径：第一为关节软骨生物学材料构成异常或关节结构存在生物力学缺陷，从而直接或间接引起骨关节炎；第二为各种物理机械性外力对关节软骨造成损伤，进而发展为骨关节炎。近来的研究大都认为酶类对软骨的降解是发生骨关节炎的关键因素，细胞因子在骨关节炎的发病中起着重要作用。常见的炎性抑制因子包括金属蛋白酶组织抑制剂、白细胞介素4、白细胞介素10、白细胞介素13等；致炎性因子包括金属蛋白酶、自由基、前列腺素E2、白细胞介素1、肿瘤坏死因子、Ⅰ，Ⅲ，Ⅹ型胶原等。目前认为骨性关节炎病理的关键是关节软骨细胞的功能改变，Ⅱ型胶原总量丢失，三股螺旋变性易被金属蛋白酶降解。降解始发于软骨表层，属Ⅱ型胶原、蛋白多糖的非自身免疫降解[1-2]。目前已证明基质金属蛋白酶是1族具有降解细胞外基质主要功能的酶，存在于正常人体内，参与骨吸收等过程[2-4]。基质金属蛋白酶3是金属蛋白酶的主要成员之一，虽不能降解Ⅱ型胶原，但它可降解细胞外蛋白多糖、Ⅸ型胶原等多种基质蛋白底物[5-6]。本文通过测定补肾活血中药治疗前后膝骨关节炎患者血清中基质金属蛋白酶3、肿瘤坏死因子α、白细胞介素1、透明质酸、脂质过氧化物含量及超氧化物歧化酶活性变化，分析以上因子在骨关节炎发病过程中所起的作用，以期为阐明骨关节炎的发病机制及补肾活血中药对膝骨关节炎的防治效果提供资料。

1 对象和方法

设计：病例-对照及自身对照的细胞因子及酶学检测实验。
时间及地点：2002-09/2005-01，广州中医药大学第一附属医院髋中心。
对象：选择广州中医药大学第一附属医院门诊或病房收治的膝骨关节炎患者42例，均经X射线片确诊，按随机数字表法分为2组：补肾活血中药组21例，男9例，女12例，平均（60±6）岁，平均病程（45.0±6.9）个月；骨仙片组21例，男7例，女14例，平均（60±7）岁，平均病程（46.0±7.4）个月。根据Kellgren和Lawrence X射线片分级标准[1]：I级7例，男3例，女4例；Ⅱ级19例，男7例，女12例；Ⅲ级13例，男5例，女8例；Ⅳ级3例，男1例，女2例。两组患者治疗前临床资料比较差异无显著性意义（P > 0.05），具有可比性。正常对照组：10例正常血清取自均无关节疾病的骨折愈合后来本院拆除内固定患者，男6例，女4例，年龄45~65岁，平均（53±5）岁。所有患者对实验及治疗方案均知情同意，且得到医院伦理道德委员会批准。

病例选择标准：西医诊断标准：临床诊断参考美国风湿病学会所制定膝骨关节炎制定标准[7]。中医辨证标准：根据本方的制方原则，适用于肾虚血瘀型，症见膝关节疼痛、肿胀、活动不利，伴有腰膝酸软、头晕、耳鸣等，舌质暗淡或有瘀斑、瘀点，苔少或无，脉细涩。纳入标准：符合西医诊断标准和中医辨证标准，年龄40~70岁，并能按计划坚持治疗者。
排除标准：妊娠或哺乳期妇女，过敏体质等；合并严重心、脑血管疾病；肝、肾及造血系统严重原发性疾病，精神病患者；骨髓炎、骨肿瘤及骨结核引起的骨性关节炎的患者；年龄在40岁以下70岁以上者；凡不符合纳入标准，未按规定治疗，无法判断疗效，资料不全影响疗效判断者。
方法：补肾活血中药组以补肾壮骨、活血止痛为治则组成的补肾活血方治疗，由杜仲、熟地、枸杞子、补骨脂、川牛膝、独活、红花、木瓜、川芎、丹参和木香药物组成，由广州中医药大学第一附院制剂室提供，5片/次，3次/d；骨仙片组采用口服中成药骨仙片，4片/次，3次/d。30 d为1个疗程，共治疗1个疗程。
标本采集：骨性关节炎患者血清均于上午8点采集，所有标本均离心取上清液，置-20 ℃低温保存待测。
基质金属蛋白酶3含量测定：采用酶联免疫法测定。
肿瘤坏死因子α含量测定：采用四甲基偶氮唑蓝法。
白细胞介素1含量的测定：采用双抗体夹心酶联免疫吸附实验法。
透明质酸含量测定：采用放射免疫法检测。
超氧化物歧化酶活性和脂质过氧化物含量测定：按试剂盒说明操作。
所有上述指标在治疗前后各检查1次。
主要观察指标：各组患者治疗前后血清基质金属蛋白酶3、肿瘤坏死因子α、白细胞介素1、透明质酸、脂质过氧化物含量及超氧化物歧化酶活性。
设计、实施、评估者：实验设计、实施、评估均为本文作者，均经过正规培训。
统计学分析：由第一作者采用SPSS 11.5软件包进行数据统计分析，数据比较采用t检验。

2 结果

2.1 参与者数量分析 纳入补肾活血中药组及骨仙片组各21例，正常对照组10例，全部进入结果分析，中途无脱落。
2.2 各组患者治疗前后血清基质金属蛋白酶3、肿瘤坏死因子α、白细胞介素1、透明质酸、脂质过氧化物含量及超氧化物歧化酶活性比较 见表1。

基质金属蛋白酶3含量：
治疗前补肾活血中药组和骨仙片组患者血清基质金属蛋白酶3含量显著高于正常对照组(P < 0.01)；治疗后两组患者血清基质金属蛋白酶3含量低于治疗前(P < 0.05~0.01)，与正常对照组相比差异无显著性意义(P >0.05)。

肿瘤坏死因子α含量：
42例膝骨关节炎患者血清中只有2例呈阳性结果，阳性率为4.7%，平均病程9.5年。其余均检测不到肿瘤坏死因子α。

白细胞介素1含量：
治疗前补肾活血中药组和骨仙片组患者血清白细胞介素1含量显著高于正常对照组(P?? < 0.01)；治疗后两组患者血清白细胞介素1含量低于治疗前(P < 0.05)。

透明质酸含量：
治疗前补肾活血中药组和骨仙片组患者血清透明质酸含量显著高于正常对照组(P < 0.01)；治疗后两组患者血清透明质酸含量均低于治疗前(P < 0.05)，两组间比较差异具有显著性意义(P < 0.05)。

超氧化物歧化酶活性：
治疗前补肾活血中药组与骨仙片组患者血清超氧化物歧化酶活性差异无显著性意义(P > 0.05)；治疗后两组患者血清超氧化物歧化酶活性均高于治疗前(P < 0.05)，两组间比较差异具有显著性意义(P < 0.05)。

脂质过氧化物含量：
治疗后补肾活血中药组和骨仙片组患者血清脂质过氧化物含量均低于治疗前(P < 0.05)，两组间相比差异无显著性意义(P > 0.05)。

3 讨论

近来发现骨性关节炎早期即有Ⅸ型胶原降解的征象[8-9]，Ⅸ型胶原主要见于关节软骨表面[10]。基质金属蛋白酶3还参与间质胶原酶的激活[11]，由此可见基质金属蛋白酶3间接参与Ⅱ型胶原的降解。本文中补肾活血中药组和骨仙片组骨关节炎患者血清基质金属蛋白酶3水平明显高于正常人水平，补肾活血中药组骨性关节炎患者经治疗后血清基质金属蛋白酶3水平明显降低，与治疗前相比有显著性差异，治疗后与正常对照组相比无显著性差异，这可能是补肾活血复方中药治疗骨性关节炎的作用机制之一。
白细胞介素1、肿瘤坏死因子α是炎症反应的重要调节剂[12-13]。白细胞介素1可有广泛的单个核细胞产生，是关节软骨破坏的最重要的一种细胞因子。有白细胞介素1α和白细胞介素1β两种亚型。其主要作用有：①介导软骨破坏最有效的细胞因子。②调节骨吸收。③刺激滑膜组织巨噬细胞、成纤维细胞、软骨细胞中白细胞介素8的生成来加强骨性关节炎破坏性关节炎症的过程。④通过直接或间接作用刺激成纤维细胞增殖，促进疤痕和纤维化。⑤延长中性粒细胞存活，增进炎症过程。肿瘤坏死因子α和白细胞介素1只有3%的同源性，其生物学活性作用比白细胞介素1的生物学作用低100倍，且不能激活鼠T细胞效应[14]。肿瘤坏死因子α能诱导其他细胞因子，包括白细胞介素1、单核粒细胞刺激因子的产生，而白细胞介素1能提高肿瘤坏死因子α的活性[15]。肿瘤坏死因子α与白细胞介素1β有着协同作用，能介导对关节组织的破坏[16]。本实验结果显示，治疗前膝骨关节炎患者血清白细胞介素1水平明显高于正常人水平，与正常对照组相比有显著性差异，这可能也是补肾活血复方中药治疗骨性关节炎的作用机制之一。
透明质酸属粘多糖物质，是关节液及软骨基质的主要组成成分，关节液中透明质酸主要由滑膜衬里细胞的B型细胞产生。滑液中正常浓度及正常属性的透明质酸对维持关节功能起着重要作用[17]。骨性关节炎原因可能是局部滑膜炎，产生炎性介质如前列腺素、白细胞介素1、肿瘤坏死因子α等，使滑膜B型细胞及其他细胞产生大量低分子量透明质酸，而低分子量透明质酸活动度高，可通过淋巴管道较多地进入血循环[18]。本文结果显示治疗前的补肾活血中药组和骨仙片组膝骨关节炎患者血清透明质酸浓度增高，与正常对照组比较差异有显著性意义(P < 0.01)，这可能也是补肾活血中药治疗膝骨关节炎的作用机制。
在本文中作者发现氧自由基也参与了致病因素中，他们与细胞炎性因子一起作用于软骨，加重关节软骨的损伤，损伤的软骨又产生更多的有害因子，形成恶性循环[19-20]。而补肾活血复方中药在清除氧自由基方面也有较好的疗效。补肾活血中药组、骨仙片组治疗前后的比较证明了这个假设。因此，补肾活血中药治疗骨性关节炎是非常有意义的。
本文结果表明补肾活血复方中药能显著降低膝骨关节炎患者血清基质金属蛋白酶3水平，间接预防Ⅱ型胶原总量丢失，显著降低膝骨关节炎患者血清白细胞介素1水平，显著降低膝骨关节炎患者血清透明质酸水平，显著提高超氧化物歧化酶活性，降低乳过氧化物酶活性，清除氧自由基，这可能是补肾活血复方中药治疗骨性关节炎的作用途径。

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