Changes in pathomorphology of synovial membrane tissues and levels of serum interleukin 4, interleukin 10 in adjuvant-induced arthritis rats following acupuncture treatment
Xu Su-qin, Bao Zhao-sheng, Wu Zhong-min, Wang Yong, Qi Yong-xiao, Zhang Jian-xing

Abstract：Sixty male SD rats were divided into four groups randomly, and each group contained 15 rats. Normal group received no disposal, while other groups were subjected to establishing adjuvant-induced arthritis rat models using Freund’s complete adjuvant. Model group retained untreated, acupuncture group was treated with the electo-acupncture at the Shenyu acupoint, and bloodletting therapy group was treated with bloodletting puncture at the Zhaohai acupoint. Compared to the normal group, marked hyperplasy, fibroplasia and infiltration of inflammatory cells in synovial membrane of model rats (P < 0.01). Levels of serum interleukin 4 and interleukin 10 were degraded. Compared to the model group, the pathomorphology changes of synovial tissue of the joint were lessened in each treatment group, and acupuncture therapy took a notable effect. Levels of serum interleukin 4 and interleukin were significantly increased in each treatment group between acupuncture group and model group (P < 0.01). The results suggest that acupuncture could relieve the pathomorphology changes of synovial tissues in rheumatoid arthritis patients effectively. One of the possible mechanisms is related with the increasing concentrations of serum interleukin 4 and interleukin 10 in adjuvant-induced arthritis rats.

Xu SQ, Bao ZS, Wu ZM, Wang Y, Qi YX, Zhang JX. Changes in pathomorphology of synovial membrane tissues and levels of serum interleukin 4, interleukin 10 in adjuvant-induced arthritis rats following acupuncture treatment.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(28):5440-5443(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-28/28k-5440(ps).pdf]

摘要: 取雄性SD大鼠60 只，按体质量随机分为4组,每组15只。正常组大鼠不做任何处理, 其余各组大鼠用弗氏完全佐剂制作佐剂性关节炎大鼠模型。模型组不做任何治疗, 针刺治疗组用电针刺激肾俞穴, 刺血治疗组则在照海穴刺络放血。与正常组比较，模型组大鼠关节滑膜炎细胞浸润、滑膜细胞和滑膜纤维组织增生显著增多( P < 0.01)，血清白细胞介素4、白细胞介素10含量降低。与模型组比较，各治疗组关节滑膜组织形态学改变减轻，其中针灸治疗组病理改变减轻较刺血治疗组明显；针灸组血清白细胞介素4、白细胞介素10含量显著增高(P < 0.01)。结果表明针灸治疗能有效减轻类风湿性关节炎对滑膜组织病理形态学的改变，其机制之一可能与其提高佐剂性关节炎模型大鼠血清白细胞介素4、白细胞介素10含量相关。
关键词：针灸；佐剂性关节炎；病理形态学；白细胞介素 4；白细胞介素10；组织构建

许素琴，包兆胜，吴仲敏，王勇，戚永孝，张建兴. 佐剂性关节炎大鼠血清白细胞介素 4、白细胞介素 10含量及滑膜组织病理形态学对针灸干预的反应[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(28):5440-5443
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0 引言

类风湿性关节炎是以慢性对称性多关节炎为主要表现的一种全身性自身免疫性疾病。大鼠佐剂性关节炎是一种免疫性炎症模型，与人类类风湿性关节炎的关节病理改变较为相似，是国内作为研究治疗类风湿性关节炎疗效的最常用动物模型[1]。本实验通过动物实验观察针灸对佐剂性关节炎大鼠滑膜组织病理形态学的改变和血清白细胞介素4、白细胞介素10水平的影响， 并探讨针灸的作用机制。

1 材料和方法

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：实验于2006-04/2007-01在台州学院医学院BSL-2级动物实验室完成。
材料：清洁级雄性SD大鼠60只(购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK(沪)2003-0003),体质量（200±50）g。弗氏完全佐剂为sigma 公司产品；大鼠白细胞介素4、白细胞介素10定量酶联检测试剂盒为Rapidbio 公司产品。显微镜BH-2为Olympus公司产品；statFax2100 型酶标仪为Tec Honlogyin 公司产品；LH202H韩氏穴位神经刺激仪为北京华卫产业开发公司产品。
动物分组：动物购回自然饲养1 周以适应环境后，按体质量随机分为4组，每组15只，即正常组、模型组、针刺治疗组、刺血治疗组。正常组不加任何处理，其余各组按造模方法制造佐剂性关节炎大鼠模型。
造模方法：用弗氏完全佐剂造成类似于人的类风湿性关节炎的佐剂性关节炎大鼠模型。于需造模鼠右后足跖皮下进针至距小腿关节(踝关节)，注射弗氏完全佐剂0.1 mL/只，诱导关节炎发生。
实验干预：
模型组：不作任何处理。
针刺治疗组：用自制大鼠固定仪固定大鼠，参照李忠仁[2]《实验针灸学》方法，取“肾俞”穴（第2腰椎下两旁），用0.5寸针灸针针刺。“肾俞”穴刺法：在“肾俞”穴向下直刺0.5~0.6 cm。把韩氏穴位神经刺激仪自粘皮肤电极的输出线换为鳄鱼头夹子的输出线后连接两部位针灸针，调节刺激参数：电流2.0~3.0 mA，以大鼠身体轻微抖动为度，频率50 Hz，连续波，时间30 min， 1次/d，针刺6次为1个疗程，休息2 d后继续下1个疗程，共4个疗程。
刺血治疗组：用自制大鼠固定仪固定大鼠，参照李忠仁《实验针灸学》方法，取“照海”穴（后肢内踝下1 mm），用三棱针刺络放血。“照海”穴刺血法：用三棱针在“照海”穴向下直刺0.2~0.3 cm，挤压使之出血一两滴。隔天1次，3次为1个疗程，休息2 d后继续下1个疗程，共4个疗程。
标本采集方法：实验第32天末次治疗后各组大鼠禁食24 h，每只大鼠股静脉放血2 mL，室温放置1 h；1 500 r/min 离心10 min，吸取血清，-80 ℃储存备用。放血后处死大鼠，无菌工作台上取下右距小腿关节，40 g/L中性甲醛关节腔灌注固定6~8 h后，分离滑膜组织，常规制片，苏木精-伊红染色。
病理评分标准：对炎细胞浸润、滑膜细胞增生和滑膜纤维组织增生进行评分，按大鼠滑膜病理5级评分法[3]。

白细胞介素4、白细胞介素10含量检测方法：采用ELISA双抗体夹心法, 操作按试剂盒说明书进行测定。
主要观察指标：①关节滑膜病理改变评价。②关节滑膜组织形态学改变。③各组血白细胞介素4、白细胞介素10含量比较。
统计学方法：数据分析应用SPSS 10.0软件处理，采用单因素方差分析，结果以x(_)±s 表示。
设计、实施、评估者：实验设计为第二作者，实施为第一至六作者，评估为第三作者，均受过医学实验动物学培训。

2 结果

2.1 实验动物数量分析 实验选用大鼠60只，分为4组，实验过程中刺血组死亡1只，进入结果分析59只。
2.2 关节滑膜病理改变评价 见表1。

从表1可知，模型大鼠关节滑膜炎细胞浸润、滑膜细胞和滑膜纤维组织增生与正常组比较显著增多( P < 0.01)，各治疗组关节滑膜的病理改变较模型组为轻，其中针灸治疗组疗效显著( P < 0.01)。
2.3 关节滑膜组织形态学改变 见图1。

正常组：
大鼠关节滑膜衬里层细胞多呈单层,或两三层,排列规则,滑膜组织较为疏松,无炎性细胞浸润。

模型组：
大鼠关节滑膜衬里层细胞明显增厚,滑膜组织呈绒毛状或指状肥大,滑膜内可见淋巴细胞、浆细胞,以及巨噬细胞、中性粒细胞等炎性细胞浸润,并趋向和形成淋巴样小结或淋巴滤泡，滑膜血管增多，血管壁及其周围炎性细胞浸润明显。

针灸治疗组：
大鼠滑膜细胞增生程度较模型组明显降低,滑膜内炎性细胞浸润及血管炎表现均显著减轻,关节软骨面较完整,滑膜与关节软骨连接区无明显的软骨及软骨下骨质侵蚀。

刺血治疗组：
大鼠滑膜细胞增生程度较模型组降低,滑膜内炎性细胞浸润及血管炎表现均有所减轻，但不如针灸组明显。

2.4 各组血白细胞介素4、白细胞介素10含量比较 见表2。

从表2数据提示：针灸组血清白细胞介素4、白细胞介素10含量与模型组相比显著增高( P < 0.01)。

3 讨论

类风湿性关节炎以肾精不足为本，肾俞穴为肾之背俞穴，具有益肾气的功用[4]，临床上常用于肾虚腰痛，阳痿，水肿等及包括类风湿病在内的各种骨关节病的治疗。刺络放血法早在马王堆汉墓帛书就有“用砭启脉”的记载，临床上常运用此法治疗肿胀疼痛，效果确凿[5]。
大鼠佐剂性关节炎模型的组织学特点包括滑膜增生、单核细胞浸润、关节软骨及骨组织破坏,与人类类风湿性关节炎的关节病理改变较为相似。本课题应用弗氏完全佐剂制作佐剂性关节炎大鼠模型,并用针刺、刺血治疗,比较并观察两种治疗方法对佐剂性关节炎大鼠模型致炎作用的影响。实验结果发现, 各治疗组较模型组病理改变有不同程度减轻，血清白细胞介素4、白细胞介素10含量普遍升高。其中针灸治疗组较刺血组疗效显著，其大鼠滑膜细胞增生程度、滑膜内炎性细胞浸润及血管炎表现均不如刺血组明显，提示可能与配穴有关，炎症局部不宜取穴。
白细胞介素4为Th2型细胞因子，在类风湿性关节炎中的作用主要表现为促进巨噬细胞沿趋化梯度移动到炎症部位；抑制巨噬细胞分泌白细胞介素6和肿瘤坏死因子；抑制Th1 细胞介导的免疫应答,从而抑制类风湿性关节炎患者体内异常的免疫反应[6]。
白细胞介素10 又称细胞因子合成抑制因子。白细胞介素10对类风湿性关节炎动物模型具有保护作用。白细胞介素10无论在发病前后应用都能明显减轻由胶原和链球菌细胞壁诱导的关节肿胀、浸润、细胞因子合成和软骨变形坏死。白细胞介素10的这一作用可能与抑制滑膜巨噬细胞和T细胞合成炎性细胞因子有关[7]。
白细胞介素10 能抑制人单核细胞、中性粒细胞等产生细胞因子[8]；还能降低血清及关节液内炎性细胞因子含量,明显抑制免疫细胞炎性细胞因子的产生,发挥抗炎作用；正向调节具有抗炎性递质作用的白细胞介素1ra ,并与其呈现协同作用[9]。
本实验发现,针灸治疗可以明显改善佐剂性关节炎 大鼠滑膜组织病理形态学改变, 改善关节局部以及整体状态。ELISA 实验结果表明, 针灸可以明显提高佐剂性关节炎大鼠血清白细胞介素 4、白细胞介素 10的含量。
由此可以认为, 针灸可以通过调节白细胞介素 4、白细胞介素 10 两种重要的抗炎因子的表达, 来缓解关节炎症, 达到治疗的目的, 这可能是针灸治疗类风湿性关节炎的作用机制之一。

4 参考文献

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郭凤莲,潘竞锵,肖柳英,等. 加减补阳还五汤抑制大鼠佐剂性关节炎作用[J].中医研究, 2006,19(7):17-18
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