Effect of Tou-Bi-Zhuan-Qi on the expression of aquaporin-1 in the synovial tissue of joint in patients with rheumatoid arthritis
Wei Song1, Liu Jian2, Qiu Le3, Chen Zhi-huang1, Shen Ying1

Abstract
BACKGROUND: The abnormal expression of water channel protein in articular cartilage, synovial fluid and synovial cells of patients with rheumatoid arthritis may have influence on rheumatoid arthritis.
OBJECTIVE: To observe the therapeutic effect of Tou-Bi-Zhuan-Qi on rheumatoid arthritis and its effect on the aquaporin-1 in the patients with rheumatoid arthritis.
DESIGN, TIME AND SETTING: Contrast observation was carried out at General Hospital of Guangzhou Military Area Command of Chinese PLA between September 2005 and September 2007.
PARTICIPANTS: Fifteen patients with active rheumatoid arthritis and fifteen patients with knee osteoarthritis. Rheumatoid arthritis group: 5 male, 10 female, age ranged from 20 to 66 years; osteoarthritis group: 4 male, 11 female, age ranged from 56 to 75 years. The drug composition of Tou-Bi-Zhuan-Qi: 1 g curare, 15 g Zhanniuzai, 3 g manchurian wildginger, 15 g tribulus terrestris, 3 g scorpion, 5 g ramulus cinnamomi, 10 ml succus bambusae.
METHODS: The rheumatoid arthritis group was treated with Tou-Bi-Zhuan-Qi for 6 months as 2 therapeutic courses, and then clinical effect and changes of tumor necrosis factor-α, C-reactive protein and erythrocyte sedimentation rate were observed. In osteoarthritis group, only aquaporin-1 was determined before treatment, the clinical effect and aquaporin-1 after treatment were not determined.
MAIN OUTCOME MEASURES: The gene expression of aquaporin-1 in the synovial tissue of joint of rheumatoid arthritis group before and after the treatment and that of osteoarthritis group before treatment.
RESULTS: The clinical symptoms of rheumatoid arthritis group improved significantly, and the inflammatory indices decreased markedly than that before treatment (P < 0.01，P < 0.05); The aquaporin-1 was also found in the synovial cells of knee, the gene expression of aquaporin-1 of rheumatoid arthritis group before treatment increased markedly as compare to that of rheumatoid arthritis group after treatment and that of osteoarthritis group before treatment (P < 0.05).
CONCLUSION: Tou-Bi-Zhuan-Qi could markedly improve the symptom of patients with rheumatoid arthritis and decrease inflammatory indices; high expression of aquaporin-1 maybe one of the mechanisms leading to arthrocele and arthralgia of rheumatoid arthritis.

Wei S, Liu J, Qiu L, Chen ZH,Shen Y. Effect of Tou-Bi-Zhuan-Qi on the expression of aquaporin-1 in the synovial tissue of joint in patients with rheumatoid arthritis.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(28):5444-5447(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-28/28k-5444(ps).pdf]

摘要
背景：水通道蛋白在类风湿性关节炎关节软骨、滑液、滑膜细胞异常表达可能对类风湿性关节炎产生影响。
目的：实验拟观察透痹转气法对类风湿性关节炎疗效及对水通道蛋白1的影响。
设计、时间及地点：对比观察，于2005-09/2007-09在解放军广州军区广州总医院完成。
参试者：选择活动期类风湿性关节炎患者和膝关节骨关节炎患者各15例。类风湿性节炎组男5例，女10例，年龄20~66岁；骨关节炎组男4例，女11例，年龄56~75岁。透痹逐邪方药物组成：马钱子1 g，掌牛仔15 g，细辛3 g，白蒺藜15 g，全蝎3 g，桂枝5 g，竹沥10 mL 等。
方法：类风湿性关节炎组应用透痹转气法治疗，3个月为1个疗程，治疗2个疗程后观察临床疗效及肿瘤坏死因子α、C-反应蛋白、血沉等指标变化。骨关节炎组只进行治疗前的水通道蛋白1测定，未进行疗效观察及治疗后水通道蛋白1检测。
主要观察指标：类风湿性关节炎组治疗前、后及骨关节炎组治疗前关节滑膜水通道蛋白1基因表达。
结果：类风湿性关节炎组临床症状明显改善，与治疗前相比，炎症指标明显降低(P < 0.01，P < 0.05)；水通道蛋白1在膝关节滑膜细胞有表达，类风湿性关节炎组治疗前较治疗后及骨关节炎组水通道蛋白1基因表达明显增强（P < 0.05）。
结论：透痹转气法明显改善类风湿性关节炎患者的症状，降低炎症指标；水通道蛋白1高表达可能是类风湿性关节炎关节肿痛机制之一。
关键词：透痹转气法；类风湿性关节炎；水通道蛋白1；中医药

韦嵩，刘健，邱乐，陈志煌，沈鹰. 类风湿性关节炎关节滑膜组织中水通道蛋白1表达与透痹转气法的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(28):5444-5447 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-28/28k-5444(ps).pdf]

>>本文导读<<

课题背景：本课题为广东省自然科学基金资助项目(06300383)。目前研究表明，类风湿性关节炎患者关节滑膜水通道蛋白1基因表达上调，但机制尚不明确。本试验通过对类风湿性关节炎治疗前后水通道蛋白1表达的观察及与骨性关节炎的对比，探讨类风湿性关节炎的水通道蛋白作用机制。

偏倚或不足：受科研经费有限，除水通道蛋白1外，其他水通道蛋白亚型对类风湿性关节炎的影响本试验尚未涉及。而且由于临床病例来源的限制，试验未设正常对照组，只能以治疗前后及骨性关节炎对照进行研究，在一定程度影响了科研设计的严谨性。

学科概念：水通道蛋白(aquaporins，AQPs)：是与水通透有关的细胞膜上转运水的特异孔道，介导着不同类型细胞膜的跨膜水转运，对水有选择性通透作用。水通道蛋白有许多亚型，广泛分布于机体不同的组织、器官。

0 引言

类风湿性关节炎是风湿病中常见的难治性疾病，具有慢性、进行性、侵袭性特点，致残率高，发病机制有待明确。“透痹转气法”是中医治疗类风湿性关节炎内、外兼治疗的综合性疗法，疗效理想。本文拟观察类风湿关节炎关节滑膜水通道蛋白1的表达并探讨其作用机制。

1 对象和方法

设计：对比观察。
时间及地点：试验于2005-09/2007-09在解放军广州军区广州总医院完成。
对象：选择活动期类风湿性关节炎患者和膝关节骨关节炎患者各15例。类风湿性关节炎组男5例，女10例，年龄20~66岁，病程3个月~ 20年；骨关节炎组男4例，女11例，年龄56~ 75岁，病程3个月~15年。纳入标准：类风湿性关节炎组均符合美国风湿病学会(ARA)1987年分类标准和1988年第一届全国中西医结合风湿类疾病学术会议制定的类风湿性关节炎诊断标准。活动期标准参考采用欧洲抗风湿联盟（European League Against Rheumatism，EULAR）制定的改良疾病活动性标准[1]；骨关节炎组均符合1995年美国风湿病协会(ACR)制订的膝关节骨关节炎的临床症状和体征的诊断标准[2]。由受试者或其家属(监护人)签署同意参加本试验的书面知情同意书。
透痹逐邪方药物组成：马钱子1 g，掌牛仔15 g，细辛3 g，白蒺藜15 g，全蝎3 g，桂枝5 g，竹沥10 mL 等。
熏蒸中药组成：透骨梢12 g，青蒿12 g，羌活12 g，独活12 g，桂枝9 g，冰片1 g 等。

试验过程：
治疗方法：类风湿性关节炎组治疗3个月为1个疗程，2个疗程后评定疗效。曾服非甾体类抗炎药物或激素治疗者，在第1个疗程内减量至停服，并不再服用其他治疗本病的药物。
类风湿性关节炎组治疗过程：口服透痹逐邪方，1剂/d，水煎分2次服。①协同治疗方案：口服透痹逐邪方1周后开始进行中药熏蒸，3次/周，20~30 min/次。②穴位注射：用5 mL 注射器(5号半针头)抽取正清风痛宁注射液[盐酸青藤碱的灭菌水溶液，2 mL/(50 mg?支)]、利多卡因注射液各1 mL (单日注射)和蛇毒注射液、2%利多卡因各1 mL (双日注射)，取穴部位常规消毒后直刺或斜刺，回抽无血即缓慢注入药液，每次每穴注0.3~0.5 mL，2次/周。据关节肿痛程度和个数，随症选穴1~4个。主要穴位有外劳宫、中泉、外关、曲池、天井、肩髎、肩髃、内外膝眼、阴陵泉、阳陵泉、委中、昆仑、照海、解溪、陷谷等。③药蜡局蒸：自制恒温蜡疗机，待石蜡(溶点48~50 ℃)溶解后，迅速掺入透痹散(含透骨梢、川乌、掌牛仔、松节等)，2 min 后以医用纱布浸药蜡裹于患处，1次/d，30 min/次。按课题设计，骨关节炎组只进行治疗前的水通道蛋白1测定，未进行疗效观察及治疗后水通道蛋白1检测。
指标检测：
临床疗效观察项目：关节疼痛、肿胀指数
及个数、晨僵时间。
实验室指标：肿瘤坏死因子α、血沉、C-反应蛋白类、膝关节滑膜（关节镜下钳取膝关节内侧壁滑膜组织，置液罐中备检）水通道蛋白1基因表达。
体格检查及血常规、尿常规、心电图、肝功能、肾功能(肌酐)等。
其他不良反应。
疗效评定：
类风湿性关节炎疗效评定标准：
临床治愈：症状全部消失，功能活动恢复正常，主要理化检查指标正常。
显效：全部症状消除或主要症状消除，关节功能基本恢复，能参加正常工作和劳动，理化检查指标基本正常。
有效：主要症状基本消除，主要关节功能基本恢复或有明显进步，生活不能自理转为能够自理，或者失去工作和劳动能力为劳动和工作能力有所恢复，主要检查指标有所改善。
无效：与治疗前相比较，各方面均无进步。
肿瘤坏死因子α测定：利用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定外周血肿瘤坏死因子α含量。严格按试剂盒说明操作。
水通道蛋白1基因表达测定：采用荧光定量PCR法测定基因表达，参照NCBI的Genebank公布的DNA、mRNA基因序列，正义链物、反义链引物、荧光探针的序列由广州莱德尔生物科技公司设计，在ABI 3900台式高通量DNA合成仪中合成，采用Primer express 2.0软件进行数据处理。滑膜组织经RNA的提取和鉴定，采用PE9600PCR基因扩增仪作反转录反应，取反转录反应产物cDNA，进行荧光定量PCR反应，水通道蛋白1及内参β-actin引物参考文献[3]合成，水通道蛋白1引物Sense 5’-TTC AAG AAG AAG CTC TTC TGG-3’，Antisense 5’-CAG ACC CCT TCT ATT TGG GC-3’，β-actin引物Sense 5’-TTC AAC TCC ATC ATG AAG TGT GAC GTG-3’，Antisense 5’-CTA AGT CAT AGT CCG CCT AGA AGC ATT-3’。阳性定量标准品及样本均按以下反应体系进行：5×定量PCR Buffer 10 μL，上游引物F(25 μmol/L) 1 μL，下游引物R(25 μmol/L) 1 μL，dNTPs(10 mmol/L) 1 μL，荧光探针(20 μmol/L) 1 μL，Taq酶(2 U/μL)2 μL，cDNA 5 μL，双蒸水29 μL。反应条件为：93 ℃ 2 min，然后93 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，共40个循环。采用PE7000全自动荧光定量PCR仪。反应结束后，由电脑自动分析并绘出阳性标准品的扩增曲线和定量标准曲线。各待测样本经荧光定量PCR反应后，与标准曲线比较，通过电脑自动分析和计算，得到各样本的DNA量(拷贝数)，将各样本的拷贝数取对数，通过数据转换后，使服从正态分布，进行统计学分析。
主要观察指标：类风湿性关节炎组治疗前、后及骨关节炎组治疗前关节滑膜水通道蛋白1基因表达。
设计、实施、评估者：试验设计为第一作者，干预实施为第四作者，评估为第二作者。主要实验参与者均经过分子生物学等正规培训，采用盲法评估。
统计学分析：由第三作者采用SPSS 11.0软件完成统计处理，试验数据以x(_)±s表示，等级资料采用Ridit分析；组间计量资料比较采用方差分析，治疗前后计量资料的比较采用配对t检验，显著性水平设α=0.05。

2 结果

2.1 参与者数量分析 纳入活动期类风湿性关节炎患者和膝关节骨关节炎患者各15例，均进入结果分析，无脱落。
2.2 临床疗效 类风湿性关节炎组总有效率达93.33%(14例)，显效率66.67%(10例)，临床疗效理想。
2.3 类风湿性关节炎组治疗前后血沉、C-反应蛋白和临床表现的变化 见表1。



与治疗前相比，类风湿性关节炎组的血沉、C-反应蛋白、晨僵时间、关节疼痛个数、关节肿胀个数、关节疼痛指数、关节肿胀指数治疗后均明显改善，肿瘤坏死因子α明显降低(P < 0.01，P < 0.05)。
2.4 类风湿性关节炎组治疗前后与骨关节炎组治疗前水通道蛋白1基因表达对比 见表2。

类风湿性关节炎组治疗前较治疗后及骨关节炎组水通道蛋白1基因表达明显增强（P < 0.05）。

3 讨论

透痹转气法是传统医学内治与外治有机结合的综合性治疗方法，该疗法治疗类风湿性关节炎较单一口服中药煎剂或中成药治疗存在明显优势，其作用机制可能与调控Fas/FasL系统，促进增殖的滑膜细胞凋亡相关[4-5]。本文在原治疗方案基础上，将蛇毒注射液穴位注射改为正清风痛宁注射液和蛇毒注射液隔日轮流穴位注射，每周增加1次熏蒸治疗，结果可显著改善类风湿性关节炎患者关节疼痛、肿胀程度，缩短晨僵时间，有效降低血沉和C-反应蛋白等炎性指标。传统医学认为类风湿性关节炎具有“病邪深入”、“伏邪为患”等特点。其病邪侵入人体常不即刻发病，而是深入膜原，伏于骨骱，伺机而发，药力难至。“以其邪在膜原，不在腠理，又仅发于一脔，能与药力相避故也”（《读医随笔》）。对于伏邪为患，《素问集注》释曰：“冬伤于寒，邪不即发，寒气伏藏，春时阳气外出，邪随气而化热，发为温病。”认为病邪侵入人体后，邪气性质可由“寒”转“热”，“随气而化”。“透痹转气法”即是通过口服中药煎剂，鼓动体内的伏、顽之邪外出；同时“乘其外发而散之”，通过中药全身熏蒸、药蜡局蒸、正清风痛宁及蛇毒穴位注射等，开通腠理，荡涤积邪，内外合一，使寒湿之邪随气化而外散，达到祛逐风寒湿毒之目的。正清风痛宁是中药青风藤中提取液，青风藤有祛风散寒，湿经通络之功，主要活性成分是盐酸青藤碱，具有较强的抗炎、消肿、止痛、免疫抑制与调节作用，局部用药可减轻关节疼痛、消除肿胀、改善关节活动功能[6-9]。
水通道蛋白是近年来认识的一族广泛存在于原核和真核生物细胞膜上，选择性高效转运水分子的特异孔道，迄今已从动物与人类中鉴定出11种水通道蛋白。它们在于不同的组织器官中，分别介导不同类型细胞膜的跨膜水的转运，并与某些疾病的发生密切相关[10-12]。其中水通道蛋白1在细胞膜中以四聚体的形式存在，四聚体复合物的每一个单体在功能上都是一个独立的水通道，水通道蛋白1作为原生型水通道，在全身分布极为广泛，广泛分布于循环系统、泌尿系统、消化系统、神经系统及运动系统[13-14]。研究表明水通道蛋白1在类风湿性关节炎及骨关节炎的关节软骨、滑液、滑膜细胞都有表达[15-17]，Trujilo等[3]发现水通道蛋白1在风湿关节炎中的滑膜细胞、关节软骨深层的软骨细胞都有表达且较正常上调，且受炎性细胞因子的影响。本试验发现水通道蛋白1定位于膝关节滑膜并在类风湿性关节炎及骨关节炎患者中均有表达，但在膝关节肿痛的患者中，类风湿性关节炎与骨关节炎表达程度明显不同，类风湿性关节炎患者水通道蛋白1表达明显增强于骨关节炎患者，类风湿性关节炎经有效治疗后，随着症状改善、炎症指标下降而水通道蛋白1表达下调。有研究表明，炎症反应时致炎性细胞因子如肿瘤坏死因子α和干扰素γ等表达增加，会直接影响水通道蛋白1的表达，导致细胞膜水通透性增加，引起细胞水肿变性[18-20]。本试验发现经透痹转气法治疗后患者肿瘤坏死因子α下调，推断类风湿性关节炎患者水通道蛋白1表达增强可能与肿瘤坏死因子α等致炎细胞因子相关，透痹转气法通过抑制致炎细胞因子的表达而下调水通道蛋白1，进而改善关节肿痛、晨僵等症状。

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