Influence of cytokines on expression of thyrotropin receptor and adipogenesis in patients with Graves ophthalmopathy during the adipogenesis of orbital adipocytes
Yan Yu-qing, He Jian-feng, Li Kai-jun

Abstract
BACKGROUND: Thyroid-stimulating hormone receptor is an autoantigen shared by thyroid follicuar cells and ocular orbital tissues, and cytokines plays an important role on the pathogenesis of Graves ophthalmopathy (GO). It is still a puzzle that the relation of cytokines and thyroid-stimulating hormone receptor in the pathogenesis of GO.
OBJECTIVE: To study the influence of various cytokines on the expression of thyroid-stimulating hormone receptor in the process of adipogenesis of in vitro cultured orbital adipose cells in GO patients.
DESIGN, TIME AND SETTING: A single sample observation was carried out in the Central Laboratory, Department of Ophthalmology, Sun Yat-sen University (Guangzhou, Guangdong, Province) from September 2003 to March 2004.
MATERIALS: Orbital adipose cells were obtained from eight serious GO patients undergoing orbital decompression. Recombinant human interleukin 2 (IL-2), IL-4, IL-6, IL-10, and interferon γ (IFN-γ) were purchased from PEORO TECH EC Company.
METHODS: Orbital adipose cells were cultured and treated by groups. IL-2, IL-4, IL-6, IL-10 and IFN-γ was added to the culture media in the experimental group, while no any cytokine was given in the untreated group, and orbital adipose cells were primarily cultured in the control group. The cells were all collected twelve days later.
MAIN OUTCOME MEASURES: The expression of thyroid-stimulating hormone receptor was examined with reverse transcriptase-polymerase chain reaction, and the content of cyclic adenosine monophosphate was measured with simultaneous radioimmunoassay. The quantitation of adipose in cells was detected by staining intracytoplasmic lipids with oil red O.
RESULTS: The expression of thyroid-stimulating hormone receptor was significantly higher in cells treated with IL-2, IL-4, IL-6 and IL-10 than that in the untreated cells and in the cells treated with IFN-γ. Treatment of GO orbital adipose cells with IL-2, IL-4, IL-6 and IL-10 during differentiation resulted in significantly greater cyclic adenosine monophosphate production by different degrees. The highest production achieved in the treatment with IL-6, which was two times as many as control group. The cyclic adenosine monophosphate production was significantly lower in the cells treated with IFN-γ than in the untreated cells.
CONCLUSION: IL-6, IL-4 and IL-10 can upregulate the expression of thyroid-stimulating hormone receptor in the orbital adipose cells of GO patients, and stimulate adipose differentiation. Conversely, IFN-γ can restrain this process.

Yan YQ, He JF, Li KJ. Influence of cytokines on expression of thyrotropin receptor and adipogenesis in patients with Graves ophthalmopathy during the adipogenesis of orbital adipocytes.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(28):5448-5452 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-28/28k-5448(ps).pdf]

摘要
背景：研究证明，促甲状腺素受体是甲状腺和眼眶组织的共享抗原，细胞因子在Graves眼病的发生发展中起着重要的作用，但细胞因子与促甲状腺素受体在Graves眼病的发生发展中的关系仍不清楚。
目的:验证细胞因子对Graves眼病患者体外培养的眼眶脂肪细胞分化过程中促甲状腺素受体表达的影响。
设计、时间及地点：单一样本观察，于2003-09/2004-03在中山大学眼科中心中心实验室完成。
材料：Graves眼病患者球后脂肪组织来源于行眼眶减压手术8例严重Graves眼病患者；人重组白细胞介素2，4，6，10和人重组干扰素γ购自PEORO TECH EC公司。
方法:对8例患者的眼眶脂肪细胞进行分化培养和分组处理。实验组：分别加入白细胞介素2、白细胞介素4、白细胞介素6、白细胞介素10和干扰素γ等细胞因子刺激，12 d收集细胞；未处理组：不加入任何细胞因子；对照组：作原代培养。
主要观察指标：通过反转录-聚合酶链反应观察促甲状腺素受体的表达；放射免疫法检测促甲状腺素刺激后细胞内cAMP的含量；油红染色提取法检测细胞内脂肪含量。
结果：①白细胞介素6、白细胞介素4、白细胞介素10、白细胞介素2等细胞因子处理组的目的条带均强于未处理组和干扰素γ组。②白细胞介素6组对促甲状腺素刺激后cAMP的产量最高，是对照组的2倍，白细胞介素2、白细胞介素4和白细胞介素10处理组也均有不同程度的增高，而干扰素γ处理组对促甲状腺素刺激后cAMP的产量则明显低于对照组。
结论：白细胞介素6、白细胞介素4、白细胞介素10等细胞因子可促进Graves眼病患者眼眶脂肪细胞分化过程中促甲状腺素受体的表达和增加细胞内的脂肪含量，干扰素γ可抑制促甲状腺素受体的表达和降低脂肪含量。
关键词：格雷夫斯病；眼眶；脂肪类；细胞因子；受体，促甲状腺素

严宇清，何剑峰，李凯军. 细胞因子对Graves眼病患者体外培养眼眶脂肪细胞分化过程中促甲状腺素受体表达和脂肪合成的干预[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(28):5448-5452
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-28/28k-5448(ps).pdf]

>>本文导读<<

课题背景：课题是广西医科大学博士启动基金（304161）资助。近年来，甲状腺相关眼病的患病率有上升趋势。由于其发病机制的复杂性、临床表现的多样性和治疗效果的不确定性，已引起了眼眶病学者的高度重视。目前，国内外研究主要集中在寻找甲状腺眼眶共享抗原及其表达的影响因素。本课题组在细胞因子对Graves眼病患者体外培养的眼眶脂肪细胞分化过程中最可能的甲状腺眼眶共享抗原（促甲状腺素受体）表达的影响方面做了一些探索。

同行评价：文章观察了培养的Graves眼病患者脂肪细胞促甲状腺素受体表达及施加细胞因子的作用，结果与以往的研究相矛盾，作者从中提出的见解具有一定创新性，为临床Graves眼病的发病机制研究开辟了新的理念。

相关链接：国内外研究主要集中在寻找甲状腺眼眶共享抗原及其表达的影响因素。众多的研究已经表明，促甲状腺素受体最可能是甲状腺眼眶的共享抗原，细胞因子在Graves眼病的发生发展中起着十分重要的作用。但是细胞因子和甲状腺眼眶共享抗原是通过什么样的途径和方式起作用，这些问题的解决将会对Graves眼病的治疗起到十分重要的影响。

0 引言

研究发现在正常人和Graves眼病患者的眶后脂肪结缔组织中存在促甲状腺素受体的表达，其表达存在相当大的个体差异，提示促甲状腺素受体在眼眶组织中的表达可能受某些因素的影响，但这些影响因素仍不清楚[1-4]。本实验应用反转录-聚合酶链反应技术检测了Graves眼病患者体外培养的眼眶脂肪细胞分化过程中促甲状腺素受体的表达以及白细胞介素2、白细胞介素4、白细胞介素6、白细胞介素10和干扰素γ等细胞因子对细胞分化过程中促甲状腺素受体表达和脂肪形成的影响。

1 材料和方法

设计：单一样本观察。
时间及地点：实验于2003-09/2004-03在中山大学眼科中心中心实验室完成。实验室的生物安全的防护水平为BSL-2级。
材料：标本来源：Graves眼病患者球后脂肪组织来源于行眼眶减压手术严重的Graves眼病患者(n=8)，患者对术中处理均签署了知情同意书。眼眶组织标本置于含培养液的无菌培养皿中，立即作细胞培养。主要试剂：DMEM/F-12(1∶1)、一步法RNA提取液(TrizoL)、胰蛋白酶、MMV逆转录酶(200 U/μL)等购自GIBCO公司；I型胶原酶、人转铁蛋白、三碘甲状腺素原胺酸(T3)、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBNX)、油红O、cAMP放射免疫测试盒等购自Sigma公司；无支原体胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所；生物素、泛酸盐购自深圳晶美公司；TaDNA聚合酶(5 U/μL)购自TaKaRa公司Rnasin、dNTP(10 mmol/L)、Oligo(dT)18购自上海生物工程公司；2 000 bp DNA Marker购自宝生物工程有限公司；人重组白细胞介素2，4，6，10和人重组干扰素γ购自PEORO TECH EC公司。
技术路线：
细胞培养液配制：培养液A：按说明取DMEM/F-12培养粉13.4 g，灭菌三蒸水定溶至1 000 mL，加入胎牛血清使其体积分数为0.2。培养液B：按说明取DMEM/F-12培养粉13.4 g，加入终浓度为15 mmol/L NaHCO3，15 mmol/L hepes，33μmol/L生物素，17 μmol/L 泛酸盐，10 mg/L人转铁蛋白，0.2 nmol/L T3，10 mg/L 胰岛素，1 μmol/L地塞米松，三蒸水定溶至1 000 mL。培养液C：取培养液A 200 mL，加入IBMX使其终浓度为0.25 mmol/L。以上溶液用磁力搅拌器使其充分溶解，调pH至7.2~7.4，0.22 μm微孔滤膜正压滤过除菌，真空抽滤分装后置于4 ℃冰箱中备用。使用前加入青霉素100 U/mL，链霉素100 U/mL。消化液：取I型胶原酶150 mg，牛血清白蛋白2 g，0.01 mol/L磷酸缓冲液定溶至100 mL，调pH值至7.2~7.4，0.22 μm微孔滤膜正压滤过除菌，分装后-30 ℃冰箱中保存备用。
细胞培养：术中取出的眶脂肪组织迅速置于灭菌的玻璃培养皿中，用含青霉素(100 U/mL)、链霉素(100 U/mL)的磷酸盐缓冲液漂洗2次，再用无抗生素的磷酸盐缓冲液清洗2次，分离去除脂肪组织中肉眼可见的纤维成分和血管，剪成1 mm×1 mm的小块加入消化液，置37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱内消化，15 h后，200 g离心10 min，去除漂浮的脂肪块及上清液，沉积的细胞用培养液A制成混悬液，分别接种于10 cm2的培养瓶，密度为3×104/cm2细胞，置37 ℃、体积分数0.05的CO2培养箱孵育16 h后，换用培养液C诱导和维持细胞分化， 3 d后更换为培养液B进行分化培养。在此后12 d的分化培养中，培养液中分别加入人重组白细胞介素2，4，6，10和人重组干扰素γ，浓度均为1 μg/L，培养过程中每3天更换培养液1次。在培养的第12天收集细胞置-70 ℃低温冰箱保存待作反转录-聚合酶链反应检测。而用作cAMP检测的细胞，在培养第12天将培养液置换为含 1 mmol/L IBMX (1 mL/孔)培养液，培养2 h后置换培养液，加入含3×10-7 mol/L重组人促甲状腺素的培养液,继续培养2 h，用于测cAMP产量。
检测方法：
培养脂肪细胞总RNA提取：采用异硫氢酸胍一步法。
cDNA的制取：吸取4 μL总RNA于20 mmol/L oligo(dT)182 μL混合，75 ℃变性10 min，冰上快速冷却1 min后，在冰上加入14 μL反应混合液(5×反转录缓冲液2 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，200 U/μL MMLV反转录酶1 μL，40 U/μL Rnasin 0.5 μL, DEPC处理过的去离子水9.5 μL)混匀，800 g离心3 min，42 ℃反应 60 min。反应完成后95 ℃ 5 min灭活反转录酶，-30 ℃保存。
用甘油磷酸脱氢酶引物定量cDNA溶液样品浓度(作阳性对照)，用于扩增的GAPDH的引物由上海生物工程公司合成，序列为(基因序列号 BC025925.1)：上游引物CAT CTT CTT TTG CGT CGC CA，下游引物TCG CCC CAC TTG ATT TTG G，扩增产物长度310 bp。 循环参数：95 ℃ 变性30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸50 s，24，26个循环后，72 ℃ 延伸7 min，取8 μL产物上样在20 g/L琼脂糖凝胶上电泳，分别对比各样品在24个循环后GADPH产物的量，调节cDNA溶液样品的浓度，使得在24个循环后GAPDH产物的量相同。用磷酸盐缓冲液上样作阴性对照。
促甲状腺素受体基因的扩增：促甲状腺素受体基因的扩增除引物不同外，聚合酶链反应其他条件甘油磷酸脱氢酶相当，样品为调解cDNA浓度后的样品。首先进行扩增的指数期测定，35个循环为指数期。选取早期指数期循环进行扩增。促甲状腺素受体基因特征性引物由上海生物工程公司合成，序列为(基因序列号AY429111.1) 上游引物：GGA CAA AGC TGG ATG CTG TTT，下游引物：GGT TTG AGA CAC GTC CAG CAA，上游引物为外显子7，下游引物为外显子8，跨内含子7，扩增长度213 bp。循环参数95 ℃ 变性30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸50 s，末次延伸72 ℃ 7 min。
cAMP产量的检测：用作测cAMP的培养细胞加入0.1 mol/L 过氯酸， 1 mL/孔，10 min，使细胞溶解， 4 ℃，600 g离心10 min，将上清夜置另一管中，用 1 mol/L KOH中和至pH 7.0后再以4 ℃，600 g离心 10 min，再取上清夜移至另一管中，真空减压干燥，置-70 C°保存待检。用放射免疫检测法检测脂肪细胞分化过程中cAMP的产量，操作按试剂盒说明进行，cAMP浓度以nmol/L表示。
细胞内脂肪含量的测定：采用油红O染色提取法[5]，培养细胞用40 g/L甲醛等渗盐缓冲液固定1 h，蒸馏水票洗。吸取油红O工作液5 mL，置于培养瓶内，使培养面向下浸染2 h，然后倒掉瓶内的油红O工作液，蒸馏水漂洗培养瓶数次直至将多余的油红O工作液漂洗干净。然后将已染色的培养瓶置于37 ℃孵箱内蒸发掉瓶内水份，加入1 mL异丙醇，萃取出的染液立即用吸管吸出，置于HITACHI G2000型分光光度计测吸光度值(A值)，检测波长570 nm。
主要观察指标：①细胞因子对眼眶脂肪细胞分化过程中促甲状腺素受体 mRNA表达的影响。②细胞因子对眼眶脂肪细胞中功能促甲状腺素受体表达的影响。③细胞因子对前脂肪细胞分化过程中细胞内脂肪含量变化的影响。
设计、实施、评估者：为本文作者，均受过博士、硕士课程培训。
统计学方法：所有数据均由第二作者用SPSS for Windows(11.0)软件包建立数据库。数据以x(_)±s表示，采用χ2检验和t检验，显著性检验水准以P < 0.05为有意义。

2 结果

2.1 细胞因子对眼眶脂肪细胞分化过程中促甲状腺素受体 mRNA表达的影响 半定量反转录-聚合酶链反应检测显示：Graves眼病患者眼眶培养的脂肪细胞在分化过程中各细胞因子处理组均可见一条约213 bp的条带。白细胞介素6、白细胞介素4、白细胞介素10、白细胞介素2等细胞因子处理组的目的条带均强于未处理组，而干扰素γ组明显弱于其他细胞因子处理组，与未处理组无明显差别，见图1。

2.2 细胞因子对眼眶脂肪细胞中功能促甲状腺素受体表达的影响 以培养的脂肪细胞在分化过程中对促甲状腺素刺激后cAMP的产量来表示功能促甲状腺素受体在细胞内的表达。结果见表1。
经细胞因子处理后的Graves眼病患者培养的眼眶脂肪细胞对促甲状腺素刺激2 h后cAMP的产量白细胞介素6组最高，是未给予细胞因子处理组(对照组)的2倍多，白细胞介素2、白细胞介素4和白细胞介素10处理组也均有不同程度的增高，干扰素γ处理组对促甲状腺素刺激后cAMP的产量则明显低于无细胞因子组，经统计分析，促甲状腺素刺激后cAMP的产量白细胞介素4、白细胞介素6、白细胞介素10和干扰素γ各细胞因子刺激组与无细胞因子组比较差异均有显著性(P分别为0.045，0.000 0，0.034，0.000 0)，而白细胞介素2与无细胞因子组比较其差异则无统计学意义(P=0.057)。

2.3 细胞因子对前脂肪细胞分化过程中细胞内脂肪含量变化的影响 经油红Ｏ染色提取法测定前脂肪细胞分化过程中细胞内的脂肪含量显示：Graves眼病患者白细胞介素6、白细胞介素4和白细胞介素10等细胞因子处理组细胞内脂肪含量均高于未处理组，白细胞介素2组细胞内脂肪含量略高于未处理组，而干扰素γ处理组细胞内脂肪含量则明显降低。经统计分析，白细胞介素4、白细胞介素6、白细胞介素10和干扰素γ组与未处理组细胞内脂肪含量比较差异有统计学意义(均P < 0.05)，而白细胞介素2与未处理组细胞内脂肪含量的差异无统计学意义(均P > 0.05)，见图2。

3 讨论

细胞因子是多种细胞分泌的，能调节细胞生长分化、免疫功能，参与炎症反应和创伤愈合等小分子多肽的统称。许多研究发现在严重的Graves眼病患者球后组织中存在干扰素γ、肿瘤坏死因子α、白细胞介素2、白细胞介素4、白细胞介素5、白细胞介素6、白细胞介素10等细胞因子[6-14]，本实验亦发现体外培养的Graves眼病患者的眼眶脂肪细胞在分化过程中，促甲状腺素受体mRNA的表达明显增强，促甲状腺素刺激的cAMP产量也明显增加。说明促甲状腺素受体mRNA的表达是功能性的表达。
本实验显示：白细胞介素6、白细胞介素4、白细胞介素10、白细胞介素2等细胞因子处理组的目的条带均强于未处理组，而干扰素γ组明显弱于其他细胞因子处理组，与未处理组无明显差别。经细胞因子处理后的Graves眼病患者培养的眼眶脂肪细胞对促甲状腺素刺激2 h后cAMP的产量白细胞介素6组最高，是未给予细胞因子处理组(对照组)的2倍多，白细胞介素2、白细胞介素4和白细胞介素10处理组也均有不同程度的增高，干扰素γ处理组对促甲状腺素刺激后cAMP的产量则明显低于无细胞因子组，提示白细胞介素2、白细胞介素4、白细胞介素6和白细胞介素10可提高体外培养的眼眶脂肪细胞在分化过程中促甲状腺素受体 mRNA的功能性表达，干扰素γ则对体外培养的眼眶脂肪细胞在分化过程中促甲状腺素受体 mRNA的表达有抑制作用。
本实验还发现，Graves眼病患者白细胞介素6、白细胞介素4和白细胞介素10等细胞因子处理组细胞内脂肪含量均高于未处理组，白细胞介素2组细胞内脂肪含量略高于未处理组，而干扰素γ处理组细胞内脂肪含量则明显降低。提示白细胞介素4、白细胞介素6和白细胞介素10均能增加脂肪细胞在分化过程中细胞内的脂肪含量，干扰素γ则对体外培养细胞的脂肪转化有抑制作用。说明白细胞介素6等细胞因子通过抑制或促进促甲状腺素受体在脂肪细胞中的表达外还通过促进或抑制脂肪转化参与Graves眼病的发生发展过程。
这些结果支持促甲状腺素受体可能是甲状腺眼眶共享抗原的假说。白细胞介素6、白细胞介素4和白细胞介素10等细胞因子通过提高共享抗原促甲状腺素受体在眼眶组织中的表达和促进脂肪转化而在Graves眼病的发生发展中起着重要作用。本实验干扰素γ抑制促甲状腺素受体在眼眶培养的脂肪细胞在分化过程中的表达和降低脂肪分化似乎对Graves眼病的发展有一定抑制作用，这与其他研究干扰素γ诱导和促进组织相容性抗原DR、热休克蛋白和黏附分子在眼眶成纤维细胞和内皮细胞的表达，促进成纤维细胞产生和分泌大量葡胺聚糖和细胞因子参与Graves眼病发生发展相矛盾[15-20]。这提示细胞因子具有的多重生物学特性决定了细胞因子复杂的生物效应，某一种特定的细胞因子在Graves眼病病程阶段的某一时点所起的作用受同时出现的与Graves眼病发病因素有关的其他细胞因子的影响。而存在于患者眼眶中细胞因子相互间复杂的多向性生物学效应(协同或拮抗)可能决定着Graves眼病患者病情的严重程度和病程。

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