Assessment of tissue-engineered cartilage tissues with soluble protein 100 and alpha-actin
Ji Ling1，Yang Lin2，Wu Yan-ge2，Wang Zheng2

Abstract
BACKGROUND: Alcian blue staining protocol is usually used to identify cartilage tissues, however, it cannot show the secretion of extracellular matrix well in the early formation stage of tissue-engineered cartilage tissues.
OBJECTIVE: To observe the feasibility to identify artificial tissue-engineered cartilage with soluble protein 100 antigen and α-actin antigen immunohistochemical method.
DESIGN，TIME AND SETTING: A contrast observation was carried out between December 2006 and February 2008 in the Medical Science Research Center of Shenzhen People's Hospital, Shenzhen, Guangdong, China.
MATERIALS: Sprague-Dowly rats of SPF grade, aged 2 weeks, weighing 50-60 g, were used to culture xiphoid chondrocytes; DegraPol scaffolds, 20 mm long, 0.75 mm thickness, internal/outer diameter 2.5/4 mm, were provided by Swiss Federal Institute of Technology (Zurich).
METHODS: Passage 3 xiphoid chondrocytes were harvested and seeded onto DegraPol scaffolds to from chondrocyte-polymer composites, and were implanted in the greater omentum of homologous rats to culture in vivo for 1 week following 3-week in vitro static culture. The chondrocyte-polymer composites were harvested after 3-week in vitro static culture and 1-week in vivo culture, respectively, to perform HE staining and soluble protein 100 and α-actin immunohistochemical staining.
MAIN OUTCOME MEASURES: Changes of chondrocyte-polymer composite were observed under inverted microscope; identification of chondrocytes was performed by immunohistochemistry staining.
RUSULTS：After 3-week in vitro static culture, HE staining showed that chondrocytes were in cartilage lacunas and cartilage matrix was stained blue. After implanting chondrocytes and culturing for 3 weeks, the inner side of scaffold was soluble protein 100-positive and α-actin-negative, which indicates chondrocyte-polymer composite has formed new tissue-engineered cartilage layer before implanting in the greater omentum of homologous rats. After 1-week in vivo culture, the obtained tissues were mixed cell structures, soluble protein 100 positive reactions concentrated in the inner side of the scaffold and α-actin positive reactions concentrated in the outer side of the scaffold.
CONCLUSION: Cartilage tissue was soluble protein 100-positive and connective tissue was α-actin-positive, soluble protein 100 and α-actin can be used as indices of tissue-engineered cartilage tissues.

Ji L，Yang L，Wu YG，Wang Z. Assessment of tissue-engineered cartilage tissues with soluble protein 100 and alpha-actin.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(28):5554-5557
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-28/28k-5554(ps).pdf]

摘要
背景：通常采用阿辛蓝染色技术鉴定软骨组织，然而对于组织工程软骨形成早期，阿辛蓝染色不能很好的显示细胞外基质的分泌情况。
目的：拟观察采用免疫组织化学法S-100抗原结合α-肌动蛋白抗原染色鉴别人工合成组织工程化软骨结构的可行性。
设计、时间及地点：对比观察，于2006-12/2008-02在深圳市人民医院临床医学研究中心完成。
材料：2周龄SPF级SD大鼠，体质量50~60 g，用于体外培养剑突软骨细胞；DegraPol材料，长20 mm，内/外径分别为2.5/ 4 mm，管壁厚度为0.75 mm，由瑞士联邦理工大学聚合材料研究所提供。
方法：于第3代收集软骨细胞接种于DegraPol管状支架形成软骨细胞-支架复合物，体外培养3周后植入同系大鼠腹腔大网膜体内培养1周。分别于体外培养3周和体内培养1周后取软骨细胞-DegraPol复合物制备组织学检测标本行苏木精-伊红染色和S-100抗原、α-肌动蛋白抗体免疫组织化学染色。
主要观察指标：倒置显微镜观察软骨细胞-DegraPol复合物的变化；免疫组织化学染色鉴定软骨细胞。
结果：体外培养3周后，苏木精-伊红染色显示软骨细胞位于软骨陷窝内，软骨基质呈蓝色。种植软骨细胞于DegraPol管状泡沫材料支架内侧面，体外培养3周后，在管腔的内侧壁S-100抗原阳性表达，α-肌动蛋白抗原阴性。证实在细胞-支架复合物植入同系大鼠体内培养之前已经形成了新的组织工程化软骨层。置入动物体内培养1周后，所获得的新组织为混合性的细胞结构，S-100抗原阳性多集中在管腔的内侧壁，而α-肌动蛋白抗原阳性反应多集中在管腔的外侧壁。
结论：软骨组织S-100抗原阳性表达，结缔组织α-肌动蛋白抗原阳性表达，S-100和α-肌动蛋白抗原可作为组织工程化软骨的鉴定指标。
关键词：软骨细胞；体外培养；组织工程；S-100；α-肌动蛋白

纪玲，杨林，武延格，王正. 应用免疫组织化学S-100和α-肌动蛋白抗原鉴定组织工程软骨[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(28):5554-5557 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-28/28k-5554(ps).pdf]

>>本文导读<<

课题背景：课题为国家自然科学基金资助项目（30500499），名称为“大网膜包盖促进血管再生，不同发展程度的组织工程气管原位重建的动物实验研究”。本实验拟采用S-100和α-肌动蛋白抗原免疫组织化学的方法对早期组织工程化软骨进行评价，观察体外和体内培养条件下种植到支架上的软骨细胞是否具有维持软骨细胞的功能。

偏倚或不足：实验中仅对体外和体内培养的组织工程化软骨进行免疫组织化学观察，没有在软骨细胞植入前进行标记，以排除植入后周围组织的影响。在今后的研究中将会考虑对软骨细胞进行示踪标记。

临床应用性：实验结果证实在组织工程软骨形成早期，细胞外基质合成较少，尤其是当混杂有成纤维细胞所形成的纤维结缔组织时，应用S-100抗原和α-肌动蛋白抗原免疫组织化学方法可以用来鉴定体外和体内培养的组织工程化软骨。

0 引言

气管软骨缺损后的修复是外科界的一个重要课题。对气管缺损修复问题，人们采取自体组织[1-2]、异体组织移植修复[3]，人工材料支撑物[4]等方法，但是都存在不足之处。组织工程方法为彻底解决临床上各种原因引起的软骨缺损带来方向。组织工程的基本思想是收集少量细胞体外培养扩增，接种到三维可降解支架上，然后种植到体内形成新的具有生命力的组织或器官[5]。
软骨细胞的主要功能是合成和分泌基质。通常采用阿辛蓝染色技术显示硫酸软骨素基质，用来鉴定软骨组织，然而对于组织工程软骨形成早期，细胞外基质合成较少，尤其是当混杂有成纤维细胞所形成的纤维结缔组织时，阿辛蓝染色不能很好的显示细胞外基质的分泌情况。本实验将软骨细胞种植于DegraPol管状支架形成软骨细胞-支架复合物，体外静态培养后包埋于同系大鼠体内，采用S-100和α-肌动蛋白抗体免疫组织化学染色观察体外培养和体内培养形成组织工程化软骨的情况。

1 材料和方法

设计：对比观察。
时间及地点：实验于2006-12/2008-02在深圳市人民医院临床医学研究中心完成。
材料：选取2周龄SPF级SD大鼠，体质量50~60 g，雌雄不拘，由广东省医学实验动物中心提供（许可证号SCXK(粤) 2003-0002）。DegraPol（3-D polyesteruthane polymer）材料，
长20 mm，内/外径分别为2.5/4 mm，管壁厚度为0.75 mm，采用冷沉淀技术[6]将DegraPol泡沫管状支架材料用环氧乙烷消毒后，置于已灭菌的培养瓶中备用(瑞士联邦理工大学聚合材料研究所)。

实验过程：
软骨细胞分离、传代、接种和体外培养：将SD大鼠幼鼠剑突软骨取出后，立即在无菌超净台上去除软骨膜，应用0.2%Ⅱ型胶原酶的无血清Ham's F12溶液，37 ℃ 消化8 h。离心后收集细胞，种植入含体积分数为0.1胎牛血清的Ham’s F12培养液，在细胞培养瓶中进行传代培养，倒置显微镜观察软骨细胞贴壁生长形态改变和增殖情况。于第3代收集软骨细胞。收集浓度为2.4×1010 L-1 的软骨单细胞悬液0.1 mL。将管状的DegraPol支架事先晾干置于6孔培养板中，单细胞悬液均匀种植于DegraPol管腔内表面上，再向6孔培养板中加入10 mL Ham’s F12培养液，将含软骨细胞-DegraPol复合物的培养板放入37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中体外静态培养，每周换液一二次，并在倒置显微镜下观察软骨细胞-DegraPol复合物的变化。
组织工程化软骨组织体外培养的形态学检测：软骨细胞-DegraPol复合物在体外静态培养3周后，从6孔培养板中取出分送不同检测。组织学检测标本以体积分数为0.04的甲醛固定，石蜡包埋和切片。苏木精-伊红染色观察软骨基质和细胞形态；应用SP法行S-100抗体(1∶100)和α-肌动蛋白抗体(1∶100)免疫组织化学染色鉴定软骨细胞，以正常大鼠气管对照。
组织工程化软骨体内培养和鉴定：上述实验所得到软骨细胞-DegraPol支架在体外静态培养3周后，置入SD大鼠腹腔大网膜体内培养1周后，取出行组织学检测，以体积分数为0.04的甲醛固定，石蜡包埋和切片。应用SP法行S-100抗
体 (1∶100)和α-肌动蛋白抗体(1∶100)免疫组织化学染色鉴定软骨细胞，以大鼠气管对照。
主要观察指标：倒置显微镜观察软骨细胞-DegraPol复合物的变化；免疫组织化学染色鉴定软骨细胞。
设计、实施、评估者：实验设计、实施、评估由全部作者共同完成，所有参加实验人员均受过专业训练。

2 结果

2.1 光镜观察软骨细胞-DegraPol复合物的变化 软骨细胞-DegraPol支架体外培养3周后，行苏木精-伊红染色结果显示软骨细胞呈圆形，位于软骨陷窝内，软骨基质呈蓝色，见图1，图2。

2.2 免疫组织化学染色结果 正常大鼠气管软骨部分S-100抗原阳性表达，α-肌动蛋白抗原阴性表达，而外周的结缔组织部分α-肌动蛋白抗原阳性，S-100抗原阴性表达，见图3。

体外培养时，大鼠剑突软骨细胞被种植于管状多聚物的内侧，因而，软骨细胞核内见S-100抗原阳性标记的颗粒，多集中在管腔的内侧壁，见图4。

α-肌动蛋白抗原阴性，见图5，证实在三维支架上有新生软骨层的形成。

但是种植了软骨细胞的多聚物置入动物体内，由于周围纤维结缔组织浸入支架，所获得的新组织为混合性的细胞结构，S-100抗原阳性多集中在管腔的内侧壁，见图6。

而α-肌动蛋白抗原阳性反应多集中在管腔的外侧壁，见图7。

3 讨论

组织工程软骨培养的关键环节是有理想的种子细胞和细胞外基质材料。同种异体软骨来源广，容易取材，一次可获得大量软骨细胞。应用同种异体软骨细胞作为种子细胞用于软骨缺损修复，未发现明显的排斥反应[7]。鉴于幼鼠的剑突软骨细胞易于获取，体外培养后还可以将组织工程化的组织进行体内培养或进行原位气管移植试验，因而选用大鼠剑突软骨细胞进行组织工程气管软骨的培养。支架材料的选择一直是软骨组织工程研究的重点[8-10]，笔者的实验已证实DegraPol支架是体外培养组织工程软骨的良好支架材料[11]。本实验拟采用S-100和 α-肌动蛋白抗原免疫组织化学的方法对早期组织工程化软骨进行评价，观察体外和体内培养条件下种植到支架上的软骨细胞是否具有维持软骨细胞的功能。
S-100是一种与神经嵴有关的胞浆蛋白，主要分布于中枢神经系统和周围神经系统的神经胶质细胞和Schwann细胞以及某些神经元细胞、黑色素细胞、软骨细胞和脂肪细胞中[12-15]。S-100蛋白是神经系统细胞表达的标志分子，软骨细胞也可表达该蛋白质，但是成纤维细胞和成骨细胞则不表达，而且S-100蛋白的存在与关节软骨基质中的蛋白多糖和胶原蛋白代谢活动有关。因此S-100蛋白可用以鉴定软骨细胞的表型[16]。α-肌动蛋白只表达于横纹肌、心肌、血管平滑肌和肠道平滑肌，同时也是肌成纤维细胞激活的标志[17]。有文献报道[18]，在增生性瘢痕中α-肌动蛋白表达水平增高。通常，软骨组织S-100抗原阳性表达，平滑肌α-肌动蛋白抗原阴性表达，而结缔组织α-肌动蛋白抗原阳性，S-100抗原阴性表达。因此本实验采用S-100抗体结合α-肌动蛋白抗体免疫组织化学染色对人工合成软骨组织结构进行检测。
本实验将软骨细胞接种在三维环状结构的支架上体外培养，免疫组织化学染色显示细胞核内见S-100抗原阳性，表明软骨细胞维持表型，并且有新生软骨组织生成。实验证实在细胞-支架复合物植入同系大鼠体内培养之前已经形成了新的组织工程软骨层。
软骨组织工程的研究很大程度上受限于移植物缺乏血液供应而导致细胞营养障碍。大网膜具有丰富的血管网和再血管化功能，当与其他组织接触后6 h，即开始有毛细血管生长，并与其他组织发生纤维素粘连，24 h 内两者之间的粘连逐渐致密，至48~72 h，可见肉芽组织生长。近年来，许多实验成功应用大网膜包盖促进组织的早期再血管化。因此实验中设计了大网膜包裹组织工程化软骨的体内培养过程。然而，当种植了软骨细胞的多聚物置入动物体内，所获得的新组织为混合性的细胞结构，S-100抗原阳性多集中在管腔的内侧壁，而α-肌动蛋白抗原阳性反应多集中在管腔的外侧壁。体内培养并没有形成所理想的内为软骨层外为结缔组织层的组织工程气管结构，考虑原因可能是多孔支架材料具备较好的渗透性，较好的代谢活性和细胞营养，但如果工程化的软骨组织少而机械强度较差也易于纤维血管组织的侵入，而纤维结缔组织将会导致管腔的狭窄和表面粗糙。没有形成完整环状软骨层的原因是否因为体外培养的效率不够或置入时机问题，尚有待进一步研究。不过，这与软骨细胞被种植于DegraPol管腔内侧和纤维结缔组织从管腔外侧爬行渗透相吻合。因此，证实应用S-100抗原和α-肌动蛋白抗原免疫组织化学方法可以用来鉴定体外和体内培养的组织工程化软骨。

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