Regulatory effect of human beta-interferon matrix attachment region on transgene expression in CHO cells
Zan Yu-xi, Wang Tian-yun, Zhang Jun-he, Wang Li

Abstract
BACKGROUND: Matrix attachment region (MAR), a DNA sequence, is still bound to the nuclear matrices after chromatin digested with restriction endonuclease, not only affects expression of endogenous gene, but also overcames transgenic silence and improves transcription and expression of exogenous gene.
OBJECTIVE: To investigate the influence of β-interferon MAR of CHO cells on the transgenic expression of chloramphenicol acetyltransferase (CAT).
DESIGN, TIME AND SETTING: The opening experiment was performed at the Department of Biochemistry and Molecular Biology, Molecular Institute, Xinxiang Medical College from October 2006 to April 2007.
MATERIALS: CHO cell lines were obtained from China Center for Type Culture Collection. The pCATG vector of CAT and G418 screening markers were constructed by this laboratory.
METHODS: Human β-interferon MAR by PCR was digested with SacI/KpnI and BamHI/SalI, and was inserted into pCATG vector, which was propagated in Escherichia coli JM109, then extracted and purified followed by enzyme digestion analysis. Vector of CAT expression cassette and human β-interferon MAR by the two sides was successfully constructed, and christened as pCAT-MAR. Two methods were compared between CHO cells of pCATG transformation and CHO cells of pCATG-MAR transformation. After G418 selecting, genome DNA of cell lines of G418 was extracted, then primers for PCR to amplify the CAT target gene fragment was designed.
MAIN OUTCOME MEASURES: The activity of CAT was analyzed by ELISA method. It was also tested to see if the pCATG-MAR was stably integrated into genomic DNA in the transfected cells.
RESULTS: CHO cells of pCATG transformation was screened to have 16 strains of positive cell, and CHO cells of pCATG-MAR transformation was screened to have 17 strains of positive cell. Human β-interferon MAR could increase the CAT gene expression by 2.8 fold. The coefficient of variation of CHO cells of pCATG transformation was 2.065 0, and coefficient of variation of CHO cells of pCATG-MAR transformation was 0.813 1. Genome DNA of stable transformation cell lines was amplified by a fragment of 437 bp. The results confirmed the pCAT-MAR vector was stably integrated into genomic DNA.
CONCLUSION: Human β-interferon MAR can increase transgenic expression in CHO cells and decrease the transgenic expression variation in different transfected cells.

Zan YX, Wang TY, Zhang JH, Wang L.Regulatory effect of human beta-interferon matrix attachment region on transgene expression in CHO cells.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(29):5623-5626(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-29/29k-5623(ps).pdf]

摘要
背景：核基质附着区是染色质被限制酶消化后仍附着在核基质上的DNA序列，不仅可影响邻近内源基因的表达，还能克服转基因沉默，提高外源基因的转录与表达。
目的：探讨在CHO细胞中β-干扰素核基质附着区对氯霉素乙酰转移酶转基因表达的影响。
设计、时间及地点：开放性实验，于2006-10/2007-04在新乡医学院生物化学与分子生物学实验室及分子研究室完成。
材料：CHO细胞株由中国典型培养物保藏中心提供。含氯霉素乙酰转移酶报告基因及G418筛选标记的质粒pCATG载体由本实验室构建。
方法：将PCR扩增得到的人β-干扰素核基质附着区分别用SacI/KpnI及BamHI/SalI酶切，连接至用相应内切酶酶切的pCATG载体上，转化E.coliJM109，提取质粒行酶切电泳，将构建好的载体命名为pCAT-MAR，该载体含氯霉素乙酰转移酶报告基因表达盒及两侧的β-干扰素核基质附着区。分别用载体pCATG及pCAT-MAR转化CHO细胞，提取具有G418抗性的细胞株基因组DNA，PCR扩增氯霉素乙酰转移酶基因。
主要观察指标：ELISA法分析氯霉素乙酰转移酶报告基因的表达。PCR法检测pCAT-MAR载体是否稳定整合在宿主基因组上。
结果：①pCATG转化的CHO细胞共筛选出16个阳性细胞株，pCAT-MAR转化的CHO细胞筛选出17个阳性细胞株。 β-干扰素核基质附着区可使氯霉素乙酰转移酶报告基因表达水平提高2.8倍，pCATG转化CHO细胞的变异系数为2.065 0，pCAT-MAR转化CHO细胞的变异系数仅为0.813 1。②稳定转化的细胞株基因组DNA均扩增出437 bp目的片段，证明pCAT-MAR载体已经稳定整合到基因组上。
结论：β-干扰素核基质附着区能提高转基因在CHO细胞的表达水平，并且可降低不同转化细胞株之间转基因表达的差异性。
关键词：核基质结合区；转基因；基因沉默；报告基因

昝玉玺，王天云，张俊河，王俐.人β-干扰素核基质附着区在CHO细胞中对转基因表达的调控[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(29):5623-5626 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-29/29k-5623(ps).pdf]

>>本文导读<<

课题背景：转基因沉默是基因工程存在的一种普遍现象，核基质附着区构建载体能提高外源基因表达水平，增强外源基因表达的稳定性，但有关其促进效应报道并不一致。CHO细胞表达系统能使外源基因完成蛋白质正确折叠和翻译后加工，为基因工程中一个重要的表达系统。因此寻找能显著提高CHO表达系统外源基因表达水平的核基质附着区片段具有重要意义。

应用要点: 实验选择CHO细胞表达系统，能使外源基因完成蛋白质正确折叠和翻译后加工。另外以人类基因组克隆的β-干扰素核基质附着区已经在其他宿主细胞被证实有提高转基因表达水平的作用，以此作为DNA片段，使实验设计更加可行。创新之处在于首次在CHO哺乳表达系统证实β-干扰素核基质附着区片段能提高转基因表达水平。

重要的概念: 核基质亦称核骨架，指真核细胞核内除去核膜、核纤层、染色质、核仁以外存在的一个由纤维蛋白构成的网架体系。可能参与染色体DNA有序包装和构建；对于间期核内DNA有规律的空间构型起着维系和支架作用；可能是DNA复制的基本位点；与基因表达密切有关，可能是细胞核中RNA转录位点和核不均一RNA的加工场所。

0 引言

核基质附着区是染色质被限制酶消化后仍附着在核基质上的DNA序列，长度为200~ 2 000 bp。核基质附着区富含AT碱基对（> 60%），并含几个短的“共有序列”等[1]。研究表明核基质附着区不仅在染色质折叠中起到重要作用，影响邻近内源基因的表达，而且核基质附着区能影响转基因的表达，克服转基因沉默，提高外源基因的转录与表达水平[2-7]。利用核基质附着区是近年来发展起来的克服外源基因失活的一种有效方法[8-9]。目前关于核基质附着区序列的研究尚处于早期阶段，核基质附着区的促进效应随不同核基质附着区、载体及宿主细胞而存在差异，作用机制尚不清楚[8-10]。
CHO细胞是一种重要的哺乳动物细胞表达系统，是目前重组糖基蛋白生产首选体系，与其他表达系统相比，它具有许多优点[11-12]。目前已有越来越多的药用蛋白在CHO细胞中获得了高效表达，然而由于位置效应等导致的CHO细胞株表达不稳定，转基因表达水平不高却是制约CHO细胞应用的一个重要因素，克服或利用位置效应是当前获得稳定高表达重组蛋白细胞株的有效途径[13]，因此研究转基因在CHO细胞高效表达具有理论和实践上的重要意义。为进一步探讨核基质附着区对转基因表达的影响及建立稳定高效表达的CHO细胞系，将β-干扰素核基质附着区克隆到转基因氯霉素乙酰转移酶（chloramphenicol acetyltransferase，CAT）表达盒两侧构建载体，转染CHO细胞，分析其在CHO细胞中对转基因表达的调控作用。

1 材料和方法

设计：开放性实验。
时间及地点：于2006-10/2007-04在新乡医学院生物化学与分子生物学实验室及分子研究室完成。
材料：CHO细胞株由中国典型培养物保藏中心提供。DNA限制酶、DMEM细胞培养基、小牛血清、G418（美国Gibco公司）；凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒（杭州维特洁生化公司）；含氯霉素乙酰转移酶报告基因及G418筛选标记的质粒pCATG载体由本实验室构建；氯霉素乙酰转移酶ELISA检测试剂盒（美国Roche公司）；LipofectamineReagent脂质体转染试剂（Invitrogen公司）；其他所用试剂均购自上海生物工程有限公司，引物合成及测序由该公司完成。
方法：
pCAT-MAR载体的构建：将PCR扩增得到的人β-干扰素核基质附着区[4]分别用SacI/KpnI及BamHI/SalI酶切，T4连接酶连接至用相应内切酶酶切的pCATG载体上，转化E.coliJM109，提取质粒酶切电泳鉴定。构建好的载体命名为pCAT-MAR，载体含氯霉素乙酰转移酶报告基因表达盒及两侧的β-干扰素核基质附着区。
质粒转染及稳定表达株的筛选：参考文后文献[4]的方法，在6孔板内以3×105/孔接种CHO细胞，次日取经限制酶BglII线性化的pCAT-MAR质粒6μg，参照说明书利用LipofectamineReagent脂质体转染试剂转染CHO细胞。48 h后按1∶10消化传代，加入700 mg/L G418进行持续筛选2周，10~15 d待稳定转化的细胞集落形成以后，2.5 g/L胰酶消化，转入培养瓶内继续培养，待细胞密度达80%~90%时，收集细胞。
氯霉素乙酰转移酶基因表达的分析：参考试剂盒说明进行，具体如下：收集细胞，调整细胞浓度为 109 L-1,用预冷的磷酸盐缓冲液洗3遍，加入1 mL裂解液（5倍稀释）轻轻晃动，室温放置30 min，4 ℃ 12 500 r/min离心15 min。吸出上清，每个样本吸出 200 μL加入EP管中，并设一阳性及阴性对照，阴性对照为样本缓冲液，阳性对照为1∶100稀释的氯霉素乙酰转移酶，用锡纸盖住，防止水分蒸发。37 ℃水浴箱孵育1 h，250μL washing buffer 洗5遍，加一抗 200 μL 37 ℃水浴箱孵育1 h，250 μL washing buffer 洗5遍，加二抗 200 μL 37 ℃ 水浴箱孵育 1 h，250 μL washing buffer 洗5遍，加 200 μL POD终止显色，检测波长405 nm，参考波长490 nm 比色，进行数据处理。
稳定整合试验：分别收集稳定筛选的细胞株，用常规基因组提取方法提取基因组DNA，根据氯霉素乙酰转移酶基因及CHO细胞的肌动蛋白基因（actin gene）的序列设计引物：P1为5'-ATA TAT CCC AAT GGC ATC GTA-3'，P2为5'-AAA TCA AAA CTG GTG AAA CTC-3'，P3为5'-GTC TTT CTT CTG CCG TTC TC-3'，P4为5'-ACC AGC CTC ATT AGG TTT GT-3'。P1及P2用以扩增氯霉素乙酰转移酶基因，目的片段大小为 437 bp，以肌动蛋白基因作为内参照，片段大小为 196 bp。PCR程序：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，4 cycles，72 ℃ 10 min；95℃ 30 s，59.5 ℃ 1 min，然后从59.5 ℃降低至50 ℃，每次降低0.5 ℃，每个温度1 min，72 ℃ 1 min，20 cycles，最后 72 ℃ 10 min。扩增的DNA行1%琼脂糖凝胶电泳检测。
主要观察指标：①pCAT-MAR载体的构建。②氯霉素乙酰转移酶报告基因的表达。③核基质附着区稳定转化株的鉴定。
设计、实施、评估者：设计为第二作者，实施为第一、三、四作者，评估为第二作者，均经过系统培训，未使用盲法评估。

2 结果

2.1 pCAT-MAR载体构建情况 构建的载体pCAT-MAR经KpnI，KpnI/BglII，BamHI/SalI，BamHI 4组内切酶酶切后的结果见图1，单酶切片段大小为7 500 bp, 双酶切均切出800 bp左右的片段，与预期片段大小相符，表明本实验构建的载体正确。

2.2 氯霉素乙酰转移酶报告基因的表达分析结果 分别用载体pCATG及pCAT-MAR转化CHO细胞，G418筛选获得稳定表达的细胞株，ELISA法分析比较细胞氯霉素乙酰转移酶活性。结果pCATG转化的CHO细胞共筛选出16个阳性细胞株，pCAT-MAR转化的CHO细胞筛选出17个阳性细胞株，提示含核基质附着区的表达载体pCAT-MAR转化的细胞氯霉素乙酰转移酶含量显著高于不含核基质附着区的载体pCATG转化的细胞。从分别挑取的单细胞克隆的统计结果看出，β-干扰素核基质附着区可使氯霉素乙酰转移酶报告基因表达水平提高2.8倍，并且核基质附着区可降低不同CHO细胞转化株氯霉素乙酰转移酶表达水平的差异，在pCATG转化CHO细胞中，变异系数（Coefficient of Variation）为2.065 0，而pCAT-MAR转化CHO细胞的变异系数为0.813 1。见表1。说明核基质附着区能在一定程度上提高外源基因的表达水平，并能降低不同转化细胞株之间转基因表达的差异性。

2.3 核基质附着区稳定转化株的鉴定 为证实pCAT-MAR载体是否稳定整合在宿主基因组上，提取具有G418抗性的细胞株基因组DNA，设计引物PCR扩增氯霉素乙酰转移酶基因，结果稳定转化的细胞株基因组DNA均扩增出437 bp目的片段，而未转化对照组无目的片段，说明pCAT-MAR载体已经稳定整合到基因组上，见图2。

3 讨论

提高外源基因表达水平、克服基因沉默至关重要。真核细胞中CHO细胞是目前重组糖基蛋白生产的首选体系，因为与其他表达系统相比，它具有许多优点[12]：①具有准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子。②具有产物胞外分泌功能，便于下游产物分离纯化。③具有重组基因的高效扩增和表达能力。④具有贴壁生长特性，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力，可以进行悬浮培养，表达水平较高。⑤CHO细胞属于成纤维细胞(fibroblast)，很少分泌自身的内源蛋白，利于外源蛋白的分离。但CHO细胞培养成本高，条件难掌握，易污染，在一定程度上影响了它的广泛应用。目前已有越来越多的药用蛋白在CHO细胞中获得了高效表达，其中部分药物已投放市场。然而由于位置效应等导致的CHO细胞株表达不稳定，转基因表达水平不高却是制约CHO细胞应用的一个重要因素，克服或利用位置效应是当前获得稳定高表达重组蛋白细胞株的有效途径[13]，因此研究转基因在CHO细胞高效表达具有理论和实践上的重要意义。
前期的研究从人类基因组克隆了β-干扰素核基质附着区，并研究了其在NIH3T3细胞中对转基因表达的调控功能[14]。为建立稳定高效表达的CHO细胞表达系统及研究核基质附着区的功能，将核基质附着区片段克隆到报告基因载体氯霉素乙酰转移酶两侧转染CHO细胞，分析其对转基因表达的调控功能。实验结果表明，核基质附着区对转基因氯霉素乙酰转移酶的表达有明显的促进作用，这与以往的研究结果基本一致[15-18]。现在普遍认为，核基质附着区作为边界元件（boundary elements）限定了染色质的集缩程度，将不同的基因片段界定于不同的染色质环内，并阻挡了邻近染色质区的顺式调控元件对环内基因的影响。转基因连有核基质附着区时，有可能形成一个独立的环区，此区受周围染色质的影响很小，使得外源基因能够进行高水平的转录。另外本实验还发现，核基质附着区可在一定程度上降低不同细胞转化株转基因表达的差异性，关于核基质附着区降低不同转化株转基因表达的差异报道不一，有的实验证实核基质附着区可以降低转化株的表达差异[19]，有的则认为没有影响或影响不显著[20]。
关于核基质附着区的作用研究目前还处于早期阶段，有关核基质附着区促进基因表达的作用机制尚有待于进一步分析。

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