Effects of bone marrow mesenchymal stem cells on transforming growth factor beta and monocyte chemoattractant protein-1 in lung injury rats
Zhao Feng, Li Sheng-qing, Ti Xin-yu, Song Li-qiang, Li Zhi-kui, Wu Chang-gui, Qi Hao-wen

Abstract
BACKGROUND: Transforming growth factor-β(TGF-β) and monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) are key cytokines during pulmonary fibrosis. It has been verified that bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) can decrease collagen content and pulmonary fibrosis in injured pulmonary tissues.
OBJECTIVE: To investigate the effect of BMSCs on TGF-βand MCP-1 in lung injury rats.
DESIGN, TIME AND SETTING: The randomized control experiment was performed at the Fourth Military Medical University of Chinese PLA from May 2005 to February 2006.
MATERIALS: Twenty clean female Sprague Dawley (SD) rats were randomly divided into normal control group, cell control group, lung injury group and cell transplantation group, with 5 rats in each group. Five male SD rats were used for BMSCs collection.
METHODS: Lung injury models were created by intratrachealy injecting bleomycin of 5 mg/kg (0.2-0.3 mL) into rats of the lung injury group and cell transplantation group. Twelve hours later, rats of the cell transplantation group and cell control group were injected with 0.5 mL of BMSCs of 0.5×106 per rat into the tail vein. Serum-free DMEM-F12 0.5mL was injected into rats of the normal control group by the same method.
MAIN OUTCOME MEASURES: Hematoxylin-eosin staining was used to observe the morphology in lung tissue. Acid hydrolyzation was employed to measure hydroxyproline concentration in lung tissues. Enzyme-labeled immunosorbent assay (ELISA) was used to detect the contents of TGF-βand MCP-1 in serum and bronchoalveolar lavage fluid (BALF).
RESULTS: Two weeks after transplantation, most of alveolar space was intact in rats of the normal control and cell control groups. The lung structure of rats in the lung injury group was destroyed and the thickness of alveolar wall and lung interstitium were increased. The lung injury degree was significantly reduced in the cell transplantation. Hydroxyproline content in lung interstitium of rats in lung injury group and cell transplantation group were significantly increased compared to the normal control group (P < 0.01 or 0.05). Increased degree in the cell transplantation group was significantly lower compared to the lung injury group (P < 0.01). TGF-βand MCP-1 expression in serum and BALF were similar to the hydroxyproline content in each group.
CONCLUSION: BMSCs can decrease hydroxyproline content, and relieve lung injury and fibrosis in lung tissues of rats, which may be associated with the decreased expression of TGF-βand MCP-1.

Zhao F, Li SQ, Ti XY, Song LQ, Li ZK, Wu CG, Qi HW.Effects of bone marrow mesenchymal stem cells on transforming growth factor beta and monocyte chemoattractant protein-1 in lung injury rats.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(29):5627-5630 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-29/29k-5627(ps).pdf]

摘要
背景：转化生长因子β及单核细胞趋化蛋白1是肺纤维化形成过程中的重要细胞因子，已证实骨髓间充质干细胞可降低损伤肺组织中的胶原含量，减轻肺纤维化。
目的：观察骨髓间充质干细胞对肺损伤大鼠转化生长因子β及单核细胞趋化蛋白1的影响。
设计、时间及地点：随机对照，细胞学体外实验，于2005-05/2006-02在解放军第四军医大学完成。
材料：清洁级雌性SD大鼠20只，随机分为正常对照组、细胞对照组、肺损伤组、细胞移植组，5只/组。雄性SD大鼠5只用于骨髓间充质干细胞的采集。
方法：肺损伤组、细胞移植组大鼠经气管注入5 mg/kg博来霉素0.2~0.3 mL诱发建立肺损伤模型。造模后12 h，细胞移植组、细胞对照组大鼠经尾静脉注入骨髓间充质干细胞悬液0.5 mL，约5×106个细胞；肺损伤组、正常对照组大鼠同法注入无血清DMEM-F12 0.5 mL。
主要观察指标：苏木精-伊红染色观察肺组织形态学变化。酸解法测定肺组织羟脯氨酸含量。ELISA法检测血清及支气管肺泡灌洗液中转化生长因子β、单核细胞趋化蛋白1的表达。
结果：细胞移植2周后，正常对照组及细胞对照组的肺泡腔均匀完整；肺损伤组的肺泡结构破坏，肺泡间隔增厚，间质增生；细胞移植组肺损伤程度明显减轻。与正常对照组比较，肺损伤组、细胞移植组的肺组织羟脯氨酸含量均显著升高 （P < 0.01或0.05），细胞移植组升高幅度明显低于肺损伤组（P < 0.01）。各组大鼠血清及支气管肺泡灌洗液中转化生长因子β、单核细胞趋化蛋白1的表达水平与肺组织羟脯氨酸含量基本相似。
结论：骨髓间充质干细胞可减少肺损伤大鼠肺组织羟脯氨酸含量，减轻大鼠肺损伤及纤维化程度，可能与降低转化生长因子β、单核细胞趋化蛋白1的表达有关。
关键词：骨髓间充质干细胞；转化生长因子β；单核细胞趋化蛋白1；肺损伤

赵峰，李圣青，遆新宇，宋立强，李志奎，吴昌归，戚好文.骨髓间充质干细胞对肺损伤大鼠转化生长因子β及单核细胞趋化蛋白1的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(29):5627-5630
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-29/29k-5627(ps).pdf]

>>本文导读<<

课题背景：课题主要研究方向为异体骨髓间充质干细胞对博来霉素引起的大鼠肺损伤的治疗作用以及对肺损伤大鼠转化生长因子β、单核细胞趋化蛋白1的影响。目前已取得的成果显示：骨髓间充质干细胞可明显减少肺损伤大鼠肺组织羟脯氨酸含量，减轻大鼠肺损伤及肺纤维化的形成，其作用机制可能与转化生长因子β及单核细胞趋化蛋白1的降低有关。

偏倚或不足：仅应用ELISA法对大鼠血清及支气管肺泡灌洗液中的转化生长因子β、单核细胞趋化蛋白1含量进行了初步检测，后续实验可对此两种细胞因子在大鼠肺组织不同组织细胞中的表达以及在分子水平进行测定，并用两种细胞因子的抗体拮抗其作用，以充分证明两种细胞因子在骨髓间充质干细胞治疗肺纤维化中的作用。此外，延长动物观察周期对实验结果的确定更具有说服力。

重要的概念：羟脯氨酸是机体胶原蛋白中的一种主要而又相对恒定的氨基酸，约占胶原蛋白氨基酸总量的13%，在弹性蛋白中含量极少，而在其他蛋白中则不存在。测定组织中羟脯氨酸的含量即可换算出胶原蛋白的含量，因此羟脯氨酸含量可用来表示胶原的代谢情况，从而判断组织纤维化的程度。

0 引言

研究发现骨髓间充质干细胞在药物博来霉素诱发的肺损伤模型中可分化为肺泡上皮细胞，并降低肺组织中的胶原含量，减轻肺纤维化[1-5]。转化生长因子β及单核细胞趋化蛋白1可促进成纤维细胞的分化、生长，使胶原蛋白合成增加，降解减少，是肺纤维化形成过程中重要的细胞因子[6-7]。本实验拟观察骨髓间充质干细胞对肺损伤大鼠肺组织中转化生长因子β及单核细胞趋化蛋白1的影响，初步探讨骨髓间充质干细胞治疗肺纤维化的作用机制，为将骨髓间充质干细胞用于肺纤维化的临床治疗提供实验室依据。

1 材料和方法

设计：随机对照，细胞学体外实验。
时间及地点：于2005-05/2006-02在解放军第四军医大学完成。
材料：清洁级雌性SD大鼠20只，体质量200~250 g，随机分为正常对照组、细胞对照组、肺损伤组、细胞移植组，5只/组。清洁级雄性SD大鼠5只，体质量100~ 150 g，用于骨髓间充质干细胞的采集。动物均由解放军第四军医大学实验动物中心提供，动物质量合格证号：SCXK（军）2002-005，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。羟脯氨酸检测试剂盒为南京建成生物工程研究所产品；转化生长因子β、单核细胞趋化蛋白1 ELISA检测试剂盒为上海森雄科技有限公司产品。
实验方法：
骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定[8]：无菌获取雄性SD大鼠股骨、胫骨骨髓，用1.073 g/mL的Percoll液分离，用含10％胎牛血清的DMEM-F12悬浮细胞，于 37 ℃、体积分数为0.05的CO2孵箱内培养，48 h后弃掉未贴壁细胞，细胞长到80％融合时消化、传代，扩增培养，通过多次传代对细胞进行纯化。流式细胞仪检测第3代细胞CD34、CD44、CD45及CD166的表达。
大鼠肺损伤模型的建立：肺损伤组、细胞移植组大鼠经气管注入5 mg/kg博来霉素0.2~0.3 mL诱发建立肺损伤模型；正常对照组、细胞对照组不造模，仅注入等量生理盐水。
骨髓间充质干细胞的移植：取第3~10代的骨髓间充质干细胞，无血清DMEM-F12稀释至1×1010 L-1。造模后12 h，细胞移植组、细胞对照组大鼠经尾静脉注入骨髓间充质干细胞悬液0.5 mL，约5×106个细胞；肺损伤组、正常对照组大鼠经尾静脉注射无血清DMEM-F12 0.5 mL。2周后处死大鼠，取肺组织进行相关指标检测。
肺组织形态学观察：取大鼠右肺一叶，4％多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，切片5 μm，苏木精-伊红染色，显微镜下观察肺组织形态变化。
肺组织羟脯氨酸含量检测[9]：其余右肺组织按1 g肺组织加5 mL生理盐水比例制成匀浆，采用酸解法测定肺组织羟脯氨酸的含量。
血清中转化生长因子β及单核细胞趋化蛋白1的表达：取大鼠腹主动脉血，采用ELISA法检测转化生长因子β及单核细胞趋化蛋白1的表达水平，具体步骤按说明书进行操作。
支气管肺泡灌洗液中转化生长因子β及单核细胞趋化蛋白1的表达：大鼠左肺用37 ℃无菌生理盐水行支气管肺泡灌洗，2 mL/次，共3次，采用ELISA法检测支气管肺泡灌洗液中转化生长因子β及单核细胞趋化蛋白1的表达水平，具体步骤按说明书进行操作。
主要观察指标：①骨髓间充质干细胞的鉴定。②肺组织形态学观察。③肺组织羟脯氨酸含量。④大鼠血清及支气管肺泡灌洗液中转化生长因子β、单核细胞趋化蛋白1的表达。
设计、实施、评估者：设计为第一作者，实施为第一、二、三、四作者，评估为第五、六、七作者，均经过系统培训，未使用盲法评估。
统计学分析：由第一作者采用SPSS 12.0软件进行单因素方差分析，数据均以x(_)?s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 骨髓间充质干细胞的鉴定 从骨髓中分离的细胞接种后贴壁生长，1周后细胞大部分为梭形及纺锤形，传代后细胞显示为均匀的梭形，增殖明显加快。流式细胞仪检测结果显示培养至第3代的细胞CD44阳性率为71.5%，CD166阳性率为83.2%，不表达CD34与CD45，表明实验分离培养所获得的细胞为骨髓间充质干细胞。
2.2 肺组织形态学观察 细胞移植2周后，苏木精-伊红染色可见正常对照组肺泡腔均匀、完整；细胞对照组大鼠肺组织肺泡腔均匀、完整，未见明显肺间质增生；肺损伤组的肺泡结构破坏，部分肺泡腔变小，肺泡间隔增厚，间质增生，成纤维细胞增多；细胞移植组的肺泡结构仍有破坏，但大部分肺泡结构完整，部分肺泡肺泡壁增厚，肺间质增生减轻，见图1。

2.3 肺组织羟脯氨酸含量检测结果 细胞移植2周后，正常对照组、细胞对照组、肺损伤组、细胞移植组的肺组织羟脯氨酸含量分别为（1.32±0.29），（1.29±0.30），（3.30±0.42），（2.39±0.52）mg/g。
与正常对照组肺组织羟脯氨酸含量比较，细胞对照组无明显变化（P > 0.05）；肺损伤组、细胞移植组均显著升高（P < 0.01，P < 0.05），细胞移植组升高幅度明显低于肺损伤组（P < 0.01）。
2.4 大鼠血清及支气管肺泡灌洗液中转化生长因子β、单核细胞趋化蛋白1的表达 细胞移植2周后与正常对照组比较，细胞对照组大鼠血清及支气管肺泡灌洗液中转化生长因子β、单核细胞趋化蛋白1含量均无明显变化（P > 0.05）；肺损伤组、细胞移植组均显著升高（P < 0.01或P < 0.05），细胞移植组升高幅度明显低于肺损伤组（P < 0.01或P < 0.05），见表1。

3 讨论

药物博来霉素诱发的动物肺纤维化模型目前广泛用于肺纤维化的研究[10]。大鼠体内注入博来霉素后可引起肺组织内肺泡上皮细胞、血管内皮细胞等损伤，继之肺组织内大量炎性细胞浸润，肿瘤坏死因子α、转化生长因子β等细胞因子大量产生，导致肺间质增生，胶原大量聚集，形成肺纤维化[11-13]。本实验中在博来霉素注射后12 h植入骨髓间充质干细胞的大鼠肺组织中，肺间质的增生明显减轻，羟脯氨酸含量明显降低，表明骨髓间充质干细胞可有效减轻肺损伤大鼠肺组织间质的增生，减少胶原的含量，减轻肺纤维化。
转化生长因子β是肺纤维化形成过程中的重要细胞因子，它可促进成纤维细胞的分化、生长与增殖，抑制上皮细胞、内皮细胞的增殖，上调胶原mRNA表达水平，使胶原蛋白合成增加，降解减少[6，14-16]。单核细胞趋化蛋白1是另一个致纤维化的重要细胞因子，它可促进肺组织胶原的合成[17-19]。研究发现，小鼠肺纤维化模型中白细胞介素5、单核细胞趋化蛋白1 mRNA增加[7]，特发性肺纤维化和胶原病纤维化患者支气管肺泡灌洗液中白细胞介素5、单核细胞趋化蛋白1和血清中单核细胞趋化蛋白1含量均增加[20]。本实验结果显示，骨髓间充质干细胞的植入可显著降低肺损伤大鼠血清及支气管肺泡灌洗液中转化生长因子β、单核细胞趋化蛋白1的含量，由此可能减轻损伤的肺组织中成纤维细胞的增生，减少胶原的合成，从而减轻肺纤维化。骨髓间充质干细胞在损伤大鼠肺组织中可分化并取代肺泡及支气管上皮细胞，减轻细胞的损伤，促进组织修复[5]。Rojas等[2]发现骨髓间充质干细胞可使博来霉素引起的肺损伤小鼠肺组织中干扰素γ、白细胞介素2、白细胞介素1β和白细胞介素4 mRNA表达减少，肺组织炎症反应的程度减轻，时间缩短，由此减轻肺纤维化的形成。故推测肺组织炎症的减轻有可能使得转化生长因子β、单核细胞趋化蛋白1等促纤维化细胞因子的合成减少，从而抑制基质胶原的合成与分泌，减轻肺纤维化，但其确切的作用机制尚需深入分析。

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