Effects of nerve growth factor on the differentiation of neural stem cells and the formation of neuronal axons
Wu You-tu, Wang Yun-jie

Abstract
BACKGROUND: The differentiation of neural stem cells (NSCs) is an important for NSCs to be applied in clinical treatment. And whether the neurons differentiated from NSCs can be connected with other neurons or not comes into being a critical problem.
OBJECTIVE: To observe the effect of nerve growth factor (NGF) on the growth and differentiation of in vitro cultured NSCs, and on the formation and growth of axons.
DESIGN, TIME AND SETTING: The cytology in vitro experiment was performed at the Equipment Center of China Medical University from June 2007 to December 2008.
MATERIALS: Three 2-3 day male Sprague Dawley rats were used in this study. NGF was purchased from Peprotech.
METHODS: NSCs were isolated from neonatal rats by enzyme digestion and mechanical separation. At the fourth passage, cell clone masses received nestin immunocytochemistry. Remaining cells were dispersed by mechanical separation. Monoclone NSCs were incubated by limiting dilution assay, and made into 108 L-1 monoplast suspension in complete medium. NSCs were assigned into 2 groups. NSCs in the control group were incubated in 10% fetal bovine serum (FBS). NSCs in the induction group were incubated in the 10% FBS+50 μg/L NGF for 5-7 days. The five isolated neurons with positive expression of neuron specific enolase (NSE) were observed. The number of axons was measured through concentric circles (37.5 μm and 75 μm diameter) circling neurons to detect the length of long axon.
MAIN OUTCOME MEASURES: Cultured cells were identified by nestin, NSE and glial fibrillary acidic protein (GFAP) immunohistochemistry to test the number of neurons, number and length of axons.
RESULTS: Neurospheres were Nestin-positive and could differentiate into the NSE-positive or GFAP-positive cells. At day 6, the numbers of neurons and axons were significantly more, and the length of longest axons was significantly longer in the induction group than in the control group (t=3.301, 2.982, 4.012, P < 0.01).
CONCLUSION: NGF can induce the differentiation of NSCs into neurons, and increase the number and length of the axons of the neurons differentiated from NSCs.

Wu YT, Wang YJ.Effects of nerve growth factor on the differentiation of neural stem cells and the formation of neuronal axons.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(29):5631-5635
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-29/29k-5631(ps).pdf]

摘要
背景：将大量的神经干细胞定向诱导分化后的神经细胞能否与其他神经细胞建立功能联系是目前解决神经干细胞应用于临床的重要问题之一。
目的：观察神经生长因子对体外培养的神经干细胞生长和分化的影响，以及神经生长因子对神经轴突形成和生长的作用。
设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2007-06/2008-12在中国医科大学设备处完成。
材料：清洁级二三天龄新生SD雄性大鼠3只，神经生长因子为peprotech公司产品。
方法：酶消化和机械分离法相结合体外分离培养新生鼠神经干细胞，传至第4代的细胞克隆团行巢蛋白免疫细胞化学染色观察，剩余细胞团用机械法分散，采用有限稀释法进行单克隆神经干细胞培养，加入完全培养基制成108 L-1的单细胞悬液，分为2组滴入培养板，对照组加入10%FBS，诱导组加入10%FBS+50 μg/L神经生长因子，培养5~7 d。连续观察5个神经元特异烯醇化酶染色阳性且未与其他神经元发生连接的孤立神经元，求助于以神经元为圆心的同心圆，分别计数内径为 37.5 μm和75 μm圆环内的突触数量，将两者均值视为神经元轴突数量，通过此同心圆测量最长轴突的长度。
主要观察指标：通过巢蛋白、神经元特异烯醇化酶、胶质原纤维酸性蛋白免疫组化染色对培养细胞进行鉴定。检测神经元数量及轴突数量、长度。
结果：所培养出的细胞团均为巢蛋白阳性，诱导分化后均可产生神经元特异烯醇化酶、胶质原纤维酸性蛋白阳性细胞。诱导分化第6天，诱导组神经元数量、单个神经元轴突数量、最长轴突长度均明显高于对照组（t=3.301，2.982，4.012， P均< 0.01）。
结论：神经生长因子可促进神经干细胞向神经元的分化，还可以增加由神经干细胞分化而来的神经元突起数量及长度。
关键词：神经干细胞；神经生长因子；神经元；轴突

乌优图，王运杰.神经生长因子对神经干细胞分化及神经元轴突形成的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(29):5631-5635 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-29/29k-5631(ps).pdf]

>>本文导读<<

应用要点：①成功地在体外培养出神经干细胞，并对传统的细胞分离方法进行改进。②以往国内外实验证明神经生长因子对已成熟轴突具有促进其再生、出芽和分枝的作用，本实验初步证明神经生长因子对神经干细胞分化而来的初级神经元也具有促进其轴突形成的作用，拓展了人们对神经生长因子的认识。

偏倚或不足：实验初步论证了神经生长因子可以促进初级神经元轴突形成和生长，应进一步研究在此过程中神经生长因子所采用的是何种信号传导途径，究竟引发了什么样的作用机制来促进神经元初期突起的形成和生长。

重要的概念：初级神经元是指那些新生的、未极化的或未完全成熟的神经元。轴突的出芽分枝是指由神经元极化后直接形成的一级轴突再次出现分枝的现象。神经元的极化现象是指初级神经元由开始的圆形或椭圆形状态向不均衡、不规则形状演变的过程。生长锥是初级神经元向不规则形状发生极化时伸出的锥形突起，生长锥不断延长最终形成轴突。

0 引言

神经干细胞因具有高度自我更新能力、多潜能分化、低免疫原和迁移功能等特性[1]，神经干细胞移植在治疗急、慢性神经系统损伤以及多种神经系统疾病如多发性硬化症、阿尔茨默氏病、帕金森病、亨廷顿病和缺血性脑损伤方面具有广阔的临床应用前景。
近年研究表明神经干细胞在体外存活和分化受诸多因素调控[2]，一类是内部因素，即基因调控，包括Notch信号转导途径、螺旋-环-螺旋（BHLH）转录因子家族、PTEN基因、Numb基因、Nurrl核转录因子等；另一类就是外部因素，表皮生长因子、成纤维细胞生长因子家族、脑源性生长因子、神经生长因子、神经营养素3、白细胞抑制因子、血小板源性生长因子等。在对诸多影响神经干细胞存活分化的外部因素的研究中，尤以对神经生长因子的认识和研究较早也较全面，有实验证明神经生长因子可以促进神经干细胞存活分化的潜能[3-4]，且能够促进诱导神经干细胞向胆碱能神经元分化。
神经干细胞被诱导分化成特定神经细胞后能否与其他神经细胞建立功能联系，已成为目前解决神经干细胞应用于临床的重要问题之一。神经系统内细胞与细胞建立功能联系的重要物质基础就是突触联系，从神经系统发育过程来看，神经系统内细胞与细胞间正常突触联系的建立要经历一个从多到少，由无序到有序的重塑过程[5-6]。所以建立一个数量较多的突触联系就成为建立正常功能联系的首要前提，而建立大量的突触联系就必须存在大量的轴突。为此实验采用出生后3 d大鼠为神经干细胞的组织来源，通过施加神经生长因子进行干预，观察神经干细胞的分化以及轴突触生长情况，以确定神经生长因子对神经干细胞的诱导分化和轴突形成的作用。

1 材料和方法

设计：细胞学体外观察。
时间及地点：于2007-06/2008-12在中国医科大学设备处完成。
材料：清洁级二三天龄新生SD雄性大鼠3只，由中国医科大学实验动物中心提供，动物质量合格证号SCXK（辽）2003-0009，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。主要试剂：DMEM/F12（1∶1， Hyclone公司）；B27（Gibco公司）；表皮生长因子(peprotech公司）；碱性成纤维生长因子（peprotech公司）；神经生长因子（peprotech公司）；FBS（Hyclone公司）；巢蛋白，神经元特异烯醇化酶，胶质原纤维酸性蛋白免疫化学试剂盒（武汉博士德公司）；BrdU（武汉博士德公司）；多聚赖氨酸（sigma公司）；胰蛋白酶（sigma公司）。
实验方法：
脑组织单细胞悬液的制备和原代培养[7-8]：将新生SD大鼠脱臼处死，无菌条件下完整地取出脑组织，仔细剥离去掉脑膜，切除鼻裂之前以及海马之后的脑组织，再将鼻裂与海马之间脑组织的周围皮质切除，得到的就是含高密度神经干细胞的侧脑室周围和海马组织，用无菌D-HANKS液清洗1 min。眼科剪刀剪碎脑组织至1 mm大小，再加入0.1%胰蛋白酶10 mL，37 ℃下消化3 min。完毕加入二三倍体积的血清终止胰蛋白酶的消化，4 ℃下以1 000 r/min离心5 min，弃上清液，反复2~3次以免胰蛋白酶的残留。加入DMEM/F12/B27培养基15 mL轻轻吹打将沉淀物制成悬液，先后用200目和400目的细胞筛过滤此悬液，最终得到较为纯净的脑组织单细胞悬液。计数细胞，求得细胞浓度。以DMEM/F12培养基稀释细胞悬液至所需浓度108 L-1。分置于3~5个培养瓶中，并于每瓶中加入20 μg/L的表皮生长因子和碱性成纤维生长因子后，于37 ℃、体积分数为0.05的CO2中培养。原代培养每隔1 d半量换液1次，隔4 d传代。传代时对细胞团机械分离（200目孔径76 μm的细胞筛分散细胞或者用带5号针头的无菌注射器反复吹打进行机械分离）。以完全培养基制成单细胞悬液。计数细胞，求得细胞浓度。以完全培养基稀释细胞悬液至所需浓度108 L-1后，分装至培养瓶中继续培养。
单克隆神经干细胞的培养：将上述培养4代的细胞克隆团用机械法分散，将细胞悬液静置30 s，使大细胞团沉淀后将上清进行细胞计数，然后采用有限稀释法，将细胞接种于96孔培养板（理论上每孔细胞为 1个/10 μL），继续培养。
神经干细胞的诱导分化：传至第4代时，取部分细胞团进行巢蛋白免疫组织化学染色观察，其余的细胞团按上述方法机械分离。用完全培养基制成所需浓度 108 L-1的单细胞悬液，并加入10%FBS以促进其分化。将此单细胞悬液分2组滴入培养板，对照组加入10%FBS，诱导组加入10%FBS+50 μg/L神经生长因子，6孔/组。培养5~7 d后，进行神经元特异烯醇化酶、胶质原纤维酸性蛋白免疫组织化学染色观察。
免疫组织化学染色[9-10]：将培养的细胞克隆滴在经多聚赖氨酸处理过的无菌盖薄片上，加少量完全培养基继续培养3~5 h，取出盖薄片用PBS液清洗冷风吹干，4%多聚甲醛室温下固定30 min，PBS液清洗3次×3 min。一抗（巢蛋白1∶500，神经元特异烯醇化酶1∶100，胶质原纤维酸性蛋白1∶100）4 ℃孵育过夜，滴加生物素化二抗，SABC室温孵育20 min，DAB显色。
神经元数量及轴突长度、数量的比较：神经元特异烯醇化酶染色后两组每孔中随机取5个高倍视野(×400)，计算神经元特异烯醇化酶阳性细胞数的均数，比较两组神经元数量有无差异。在每孔中连续观察5个神经元特异烯醇化酶染色阳性且未与其他神经元发生连接的孤立神经元，求助于如图1所示的以神经元为圆心的同心圆，分别计数内径为37.5 μm和75 μm圆环内的突触数量[11]。将两者均值视为神经元突触的数量，比较组间轴突数量有无显著差异。再通过此同心圆测量它们最长轴突的长度，并求得平均长度。

主要观察指标：①细胞形态观察。②巢蛋白、胶质原纤维酸性蛋白和神经元特异烯醇化酶免疫组织化学染色结果。③神经元数量及轴突长度、数量的比较。
设计、实施、评估者：设计、实施是第一作者，评估是第二作者，均经过系统培训，未使用盲法评估。
统计学分析：由第一作者采用SPSS 13.0软件进行统计学处理，数据以x(_)±s表示，巢蛋白阳性细胞数、神经元突触数量、轴突长度行t检验分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 细胞形态观察 新生鼠脑组织单细胞悬液培养 24 h后可见小细胞团悬浮于培养液中，此时细胞团体积较小，由几个到十几个细胞组成，细胞团边界清楚，折光性较强，此时亦有少量细胞贴壁分化成有突起的神经细胞，而且有些细胞团周围也出现了少量的放射状突起，贴壁细胞周围可见少量的细胞碎片；培养4 d时可以看到悬浮于培养液中的细胞团明显增大，由数十个细胞至数百个细胞组成不等，此时仍有一定数量细胞贴壁分化成不规则形态的细胞，并且有些细胞之间形成了轴突联系，此时细胞碎片较前有所增多；传至第3代时可以看到悬浮细胞团依然生长活跃，但贴壁分化的细胞数量较前有所减少，细胞碎片也较少见；单克隆神经干细胞培养24 h后，就可以发现明显的细胞团生长，该细胞团体积较大，约有数百个细胞组成，边界清晰，折光性较强，而且增殖较快，周围偶可见形状不规则有放射状突起的细胞生长，细胞碎片较少见，见图2。

2.2 免疫组织化学染色 将单克隆神经干细胞团进行巢蛋白免疫组织化学染色，绝大多数细胞呈阳性反应。细胞团由成百上千个巢蛋白阳性细胞构成，细胞团周围可见少量的散在的巢蛋白阳性细胞，形状多呈三角形；对诱导分化后的细胞分别进行胶质原纤维酸性蛋白和神经元特异烯醇化酶免疫组织化学染色，均有阳性细胞存在，见图3。

2.3 神经元数量及轴突数量、长度的比较 诱导分化后第1天可见一定数量的细胞贴壁生长，并可见少量放射状突起，随后贴壁生长的细胞不断增多，突起数量及长度也在不断增加。诱导分化第6天，诱导组与对照组的神经元特异烯醇化酶阳性细胞数分别为（12.9±2.4）个，(5.8±1.7)个，即诱导组神经元数量明显高于对照组(t=3.301，P < 0.01），见图4。

对单个神经元轴突数量进行计数显示，诱导组单个神经元细胞轴突的平均数量明显高于对照组[（8.9±0.5）个，（3.9±0.2）个，t=2.982，P < 0.01]，诱导组最长轴突平均长度明显高于对照组[（80±12）μm，（20± 2）μm，t=4.012，P < 0.01]，见图5。

3 讨论

本实验成功的对神经干细胞进行了体外培养，同时也观察了神经生长因子对神经干细胞分化的作用，并着重探讨了在神经干细胞分化过程中神经生长因子对神经轴突形成和生长的作用。在神经干细胞单细胞悬液制备过程中，单纯酶消化法存在酶的浓度和消化时间都不易把握的缺点，当酶的浓度过低或者消化时间过短往往无法将较大的组织块充分消化，致使细胞液中含有大量的小组织块，在培养过程中不利于神经团的观察。消化酶浓度过高或消化时间过长时，容易使细胞发生死亡，也不利于细胞的培养。而单纯的机械分离也容易造成组织块不易被分离，或者细胞遭受较大的机械力而发生死亡的现象。所以本实验尝试了酶消化和机械分离两种方法相结合的方法对所获组织块进行分离，即先进行短时间的酶消化，然后再进行轻柔的机械分离，最终获得了满意的分离效果。
通过对细胞培养过程的观察，可以看到从原代培养第2天开始出现细胞克隆团，一直到第6天细胞传代之前此细胞团体积在不断扩增，而且数量也在不断增多，同时坏死的细胞碎片也在逐渐减少，这说明所培养的细胞是一种具有高度自我增殖能力的细胞。单克隆细胞团经过巢蛋白免疫细胞化学染色显示均成呈阳性，而且经过分化培养后均能产生神经元特异烯醇化酶与胶质原纤维酸性蛋白阳性细胞，说明该细胞可以分化为神经元和神经胶质细胞。这些都表明了所培养细胞是具有高度自我复制能力和分化能力的神经干细胞，而神经元和胶质细胞则没有这种特性。
在通过对此神经干细胞诱导分化培养后，证实了神经生长因子可以促进神经干细胞分化为神经元这一结论。对单克隆神经干细胞分组分化培养，结果显示诱导组神经元特异烯醇化酶阳性细胞数明显多于对照组，因神经元特异烯醇化酶染色对神经元具有特异性，所以诱导组中的神经干细胞经过分化所产生的神经元数量显著多于对照组，这一结果说明神经生长因子可促进神经干细胞分化为神经元。
另有实验表明神经生长因子能促使神经元轴突的增粗增长[12]，并且还能促进神经元轴突出芽分枝[13]。但这些有关论证神经生长因子能促进轴突生长和再生的实验大多都集中在对损伤神经元和已成熟轴突的研究上，而在神经干细胞向神经元分化过程中，或者在初级神经元生成轴突的过程中，它们对突起生长的作用还缺乏一定的认识。本实验主要观察在神经干细胞向神经元分化过程中神经生长因子对轴突生长的作用，结果显示诱导组单个神经元的平均轴突数量和最长轴突平均长度均远大于对照组，说明神经生长因子不但对神经元已有的轴突具有促进其出芽、分枝和生长的功能[14-15]，而且在神经干细胞向神经元分化过程中或者初级神经元轴突形成过程中，还能够促进那些未长出突起的神经细胞向极化状态转变并增加生长锥的生成，最终增加分化后神经元突起数量。
通过将本实验与其他关于神经生长因子促进轴突生长和再生的实验[16-17]相联系，不难推测神经元在初期生长出生长锥和突起的机制与后期轴突出芽[18]，分枝和再生的机制可能基本相同。即使这两个机制不相同，也不可否认这两种机制均能够被神经生长因子所启动。下一步实验应该进一步研究神经生长因子在此过程中所采用的是什么样的信号传导途径，究竟引发了何种机制来促进神经元初期突起的形成和生长，必须将大量神经干细胞诱导分化为特定的神经细胞，并与其他神经细胞建立功能联系才能最终达到治疗的目的，这就要求细胞与细胞之间应建立起必要的突触联系，所以揭示轴突生长的诱导因素及其机制就显得由为重要[19]。
本实验成功的对神经干细胞进行了体外培养，并对传统的神经干细胞单细胞悬液的制备方法进行了改进，同时进一步证明神经生长因子可以促进神经干细胞向神经元细胞分化，且对神经突起形成和生长均有明显的促进作用。
致谢：非常感谢中国医科大学附属一院神经外科王运杰主任在实验过程中给予的悉心指导，同时也非常感谢中国医科大学解剖教研室和设备处在实验技术设备方面所给予的极大帮助！

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