Repair of osteochondral defects using human transforming growth factor beta 1 gene transfected bone marrow stem cells combined with calcium alginate
Sun Jun1, Hou Xiao-kui2, Li Xu2, Zhang Ru-ming1

Abstract
AIM: To transduce the human transforming growth factor-β1 (hTGF-β1) gene to the bone marrow stem cells (BMSCs) and then combine with the degradable alginate to compose the tissue engineering artificial cartilage with biological activity, expecting to get a better integration of the cartilages.
METHODS: Eighteen masculine goats of 12 months old were provided by the animal experiment center of the Ninth Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University. The recombinant adenoviruses carrying hTGF-β1 were provided by the Orthopaedic Laboratory of the Ninth Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University. Calcium chloride and sodium alginate were the products of Gibco Company. Eight milliliters of bone marrow were obtained from the iliac crest of the goats. The adherent method was used to separate and culture the BMSCs. The third passage cells were transduced with hTGF-β1 and incubated overnight. An acute osteochondral defect model was created in the weight-bearing area of the medial femoral condyle on the both knees of eighteen goats. The goats were randomized into three groups, with six in each group. In the group of transduced cells with calcium alginate, the hTGF-β1 gene transduced BMSCs were suspended in the 1.2% sodium alginate. The cell density was adjusted to 5×1010 cells L-1. Five milliliters of the suspension were injected into the osteochondral defects, and excessive 2.5% calcium chloride was dropped to make the calcium chloride and sodium alginate cross-link to form calcium alginate gels. In the compound control group, the same method was used to inject the gels of non-gene transduced BMSCs into the calcium alginate gels. In the model group, none of the intervention was given. Western blot was employed to detect the expression of the exogenous gene. The reparative tissues were determined for the morphology observation and the defect scoring.
RESULTS: After the transduction of the hTGF-β1 gene, the BMSCs expressed hTGF-β1, synthesized the extracellular matrix of type II collagen and excreted aggrecan. At 24 weeks after the transplantation, the group of transduced cells with calcium alginate got a hyaline cartilage-like restoration. The compound control group and the model group got a fibrous tissue or fibrocartilage-like repair. Comparing the reparative tissues of 12 weeks and 24 weeks, the scores of the group of transduced cells with calcium alginate and the compound control group were significantly higher than those in the model group (P < 0.05). The scores of the reparative tissue in the group of transduced cells with calcium alginate were significantly higher than those in the compound control group (P < 0.05). The scores in the group of transduced cells were significantly increased as the prolonging duration (P < 0.05).
CONCLUSION: The experiments combine the tissue engineering and molecular biology with a success. The gene-transduced BMSCs can make the hTGF-β1 bring into effect continuously and effectively, and gradually transform into mature chondrocytes to excrete the matrix. The hTGF-β1 gene transduced BMSCs combined with calcium alginate could repair the osteochondral defects with satisfactory results.

Sun J, Hou XK, Li X, Zhang RM.Repair of osteochondral defects using human transforming growth factor beta 1 gene transfected bone marrow stem cells combined with calcium alginate.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(29):5636-5638 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-29/29k-5636 (ps).pdf]

摘要
目的：拟利用人转化生长因子β1基因转染骨髓基质干细胞，再与可降解藻酸钙材料复合构建具有较好生物学活性的组织工程化人工骨软骨，以期获得良好的软骨间整合。
方法：雄性12个月龄的崇明山羊18只，由上海交通大学附属第九人民医院动物实验中心提供。携带人转化生长因子β1基因的重组腺病毒由上海交通大学附属第九人民医院骨科研究室提供。制备藻酸钙凝胶的氯化钙、藻酸钠为Gibco公司产品。从羊髂嵴抽取8 mL骨髓，贴壁法分离培养骨髓基质干细胞，传至第3代以携带人转化生长因子β1基因的重组腺病毒转染过夜。18只山羊均于双膝股骨内髁负重区建立骨软骨缺损模型，造模后分为3组，6只/组：转染细胞-藻酸钙组将转染人转化生长因子β1基因的骨髓基质干细胞悬于1.2%藻酸钠中，调整细胞密度为5×1010 L-1，吸取5 mL注入骨软骨缺损处，随后缓慢滴入过量的2.5%氯化钙，使氯化钙与藻酸钠发生交联反应形成藻酸钙凝胶。复合对照组同法注入未转染人转化生长因子β1基因的骨髓基质干细胞-藻酸钙凝胶，模型组不给予任何干预。转染后Western blot法检测细胞外源基因的表达。移植后组织形态学检查及缺损评分。
结果：人转化生长因子β1基因转染后，骨髓基质干细胞表达人转化生长因子β1，并分泌细胞外基质Ⅱ型胶原及Aggrecan。移植后24周，转染细胞-藻酸钙组缺损获得类透明样软骨修复，复合对照组及模型组均为纤维组织或纤维样软骨修复。与模型组比较，移植后第12，24周复合对照组、转染细胞-藻酸钙组骨软骨缺损组织形态学评分均明显升高（P < 0.05），且转染细胞-藻酸钙组升高幅度显著大于复合对照组（P < 0.05）；转染细胞-藻酸钙组缺损评分随着修复时间的延长而明显升高（P < 0.05）。
结论：实验成功将组织工程学与分子生物学有机结合，经基因修饰的骨髓基质干细胞可使人转化生长因子β1持续高效发挥作用，并逐步转化为成熟的软骨细胞且分泌软骨基质，与藻酸钙复合修复骨软骨缺损效果满意。
关键词：骨髓基质干细胞；人转化生长因子β1；骨软骨修复；组织工程；基因转染

孙骏，侯筱魁，李旭，张如明.人转化生长因子β1基因转染骨髓基质干细胞复合藻酸钙修复骨软骨缺损[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(29):5636-5638 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-29/29k-5636(ps).pdf]

0 引言

骨缺损区周缘的软骨细胞被软骨基质包围，其分裂增殖和迁移的能力被限制，几乎不参与缺损区的自发性修复过程，修复主要由软骨前体细胞和细胞因子填充缺损处进行修复[1-3]。一般认为直径超过4 mm的软骨缺损不能自行修复。近年来组织工程的迅速发展，特别是种子细胞体外培养的成熟，可降解生物材料的应用，细胞生长因子的发现，为骨软骨的修复提供了一个合乎生物学原则的思路[4-6]。其中如何通过某种方法使生长细胞因子持续高效发挥作用，调控种子细胞定向分化一直是软骨组织工程学研究亟待解决的关键问题。

1 材料和方法

设计：细胞基因工程与组织工程体内实验。
时间及地点：于2004-07/2005-06在上海交通大学附属第九人民医院及上海中医药大学附属曙光医院完成。
材料：雄性12个月龄的崇明山羊18只，由上海交通大学附属第九人民医院动物实验中心提供，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。
实验方法：
羊骨髓基质干细胞的分离培养：在羊的髂嵴上抽取约8 mL自体骨髓，接种于含10 mL DMEM完全培养液的培养皿中，于37 ℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度条件下培养，第5天首次全量换液，大部分未贴壁的细胞随换液除去，以后隔日换液。当培养的细胞近80%汇合时传代，培养至第3代用于实验。
羊骨髓基质干细胞的基因转染：细胞90%汇合后，分别以携带人转化生长因子β1基因的重组腺病毒、携带Lac-Z报告基因的重组腺病毒Adv-βgal转染过夜，MOI=200，以未进行基因转染的细胞作为空白对照。
免疫沉淀检测细胞人转化生长因子β1的表达：收集转染后5 d的细胞培养上清液5 mL，加入兔抗人转化生长因子β1（一抗，1∶500），室温下旋转混匀4 h，加入ProteinA-Sepharose4B 100 μL，4 ℃旋转混匀过夜。次日离心去上清，加入上样缓冲液，煮沸离心，所得产物通过SDS-PAGE行Western blot检测。
Western Blot检测Ⅱ型胶原及Aggrecan的表达：细胞转染后5 d，加入500μL裂解液充分裂解。15μL裂解产物与15 μL上样液混匀，上样至SDS-PAGE，15 mA电泳约3 h。电泳完毕，取下凝胶，蛋白条带电转膜至硝酸纤维素膜，90 V约2 h。硝酸纤维素膜置于封闭液中，4 ℃过夜。次日先后加入鼠抗人Ⅱ型胶原（一抗，1∶500），羊抗人aggrecan（一抗，1∶500），生物素化二抗(1∶100)、碱性磷酸酯酶联生物素亲和素(1∶4 000)，最后加入化学发光底物，在酶催化作用下显色于X光片。
股骨内髁负重区骨软骨缺损动物模型的建立：18只山羊均造模，于双膝股骨内髁负重区中心位置，选用 3.0 mm钻头低速钻孔，深度5 mm，造成骨软骨缺损。
细胞-藻酸钙复合移植修复骨软骨缺损：造模后分为3组，6只/组：转染细胞-藻酸钙组将转染人转化生长因子β1基因的骨髓基质干细胞悬于1.2%藻酸钠中，调整细胞密度为5×1010 L-1，吸取5 mL注入骨软骨缺损处，随后缓慢滴入过量的2.5%氯化钙，使氯化钙与藻酸钠发生交联反应形成藻酸钙凝胶，确保凝胶完全填充缺损空隙。复合对照组同法注入未转染人转化生长因子β1基因的骨髓基质干细胞-藻酸钙凝胶，模型组不给予任何干预。术后动物圈养，不限活动。分别于第12，24周作大体观察、Ⅱ型胶原免疫组化染色、电镜检查，组织学检查及组织形态学评分。
设计、实施、评估者：实验设计、干预实施为第一作者，结果评估为第二、三、四作者，均经过系统培训，未使用盲法评估。
统计学分析：由第一作者采用SAS 6.12软件进行方差分析及SNK(Student-Newman-Kewls) 检验，数据以 x(_)±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 人转化生长因子β1转染效果 见图1。

2.2 移植后大体观察 术后所有动物均活动正常，伤口Ⅰ期愈合。转染细胞-藻酸钙组第12周缺损区被白色的类软骨组织替代，第24周修复组织与正常软骨组织已难区分，表面光滑。复合对照组第12周为部分组织填充，24周时仍有凹陷及裂隙的存在。模型组第12，24周时缺损依然呈凹陷状，边界十分明晰，底部有暗黄色的组织增生，表面粗糙，不能填充缺损，周围软骨稍有退变。
2.3 Ⅱ型胶原免疫组化检测 正常软骨Ⅱ型胶原免疫组化染色呈棕黄色，软骨下骨负染或淡染。第24周转染细 胞-藻酸钙组修复组织中软骨细胞和陷窝周围明显，胶原粗大，基质染色较周围正常软骨明显，见图2。

2.4 电镜检查 第24周转染细胞-藻酸钙组修复组织中出现具有特征性的软骨细胞褶皱小突起，粗面内质网数量很多，可见周期横纹，见图3。

2.5 组织形态学观察 转染细胞-藻酸钙组第12 周软骨细胞呈圆形，细胞数量增多，散在分布，排列紊乱，修复的表面不甚光滑，新生组织下部细胞已形成了成熟的骨小梁结构，与周围骨组织难以分辨。第24周软骨细胞有所减少，且排列开始逐渐规律，部分呈柱状排列趋势，但正常透明软骨比较仍非常紊乱，出现软骨陷窝，软骨细胞位于软骨陷窝内，修复组织与正常软骨的厚度基本一致，表面光滑。
复合对照组以纤维软骨样组织为主，存在裂隙，软骨下骨仅有部分修复。模型组可见缺损区表面凹陷，内有纤维组织部分填充，修复的基质中可见纺锤形的成纤维细胞。
2.6 骨软骨缺损组织形态学评分 见表1。

3 讨论

骨髓基质干细胞作为组织工程学软骨的细胞来源，其优越性已被多项研究证实[7-8]，其接种密度影响着组织工程软骨构建的成败。有作者[9]认为适合的细胞接种浓度是 2.5×1010 L-1。本实验按照5×1010 L-1细胞浓度修复股骨内髁骨软骨缺损，经分期取材，发现转染人转化生长因子β1的骨髓基质干细胞逐步转化为成熟的软骨细胞，并能分泌软骨基质；在缺损深部软骨下骨部分，经由软骨组织逐渐转变为骨组织，并最终在机体应力环境下塑性，形成正常的软骨下骨组织，新生的软骨及软骨下骨组织与周围正常组织均整合良好。而未转染人转化生长因子β1的骨髓基质干细胞不能很好地转化为成熟的软骨细胞，最终形成纤维软骨样组织。
本实验Western blot检测结果显示转染细胞-藻酸钙组骨髓基质干细胞的人转化生长因子β1基因、Ⅱ型胶原及Aggrecan均有明显表达，提示人转化生长因子β1外源基因导入不仅促进了宿主细胞表达人转化生长因子β1，而且也合成并分泌了细胞外基质Ⅱ型胶原及Aggrecan。术后24周时，软骨细胞有所减少，出现了软骨陷窝，软骨细胞位于软骨陷窝内，修复组织与正常软骨的厚度基本一致，表面光滑。此时，修复组织虽然不能称之为成熟的类透明软骨，但是其形态结构较12周更接近于正常的软骨组织，这可能是由于修复组织在局部应力的作用下发生改建所至。

4 参考文献

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