Effects of combined transplantation of recombinant human erythropoietin and skeletal muscle satellite cells on acute myocardial infarction in rabbits
Chen Ke-qi, Dong Shao-hong, Luo Lin-jie, Zhang Peng, Liang Xin-jian, Pang Xin-li, Li Jiang-hua

Abstract
BACKGROUND: Erythropoietin has many physiological effect of non-hematological system, such as participating in normal development of mammal embryo, inhibiting inflammation, enhancing vessel growth, as well as inhibiting apoptosis, reducing infarcted area and accelerating functional recovery in injuries to many tissues and cells.
OBJECTIVE: To study whether recombinant human erythropoietin (rhEPO) can cooperate with skeletal muscle satellite cells to cure acute myocardial infarction rabbit.
DESIGN, TIME AND SETTING: The randomized control animal experiment was performed at the Central Laboratory of Shenzhen People’s Hospital from January to July 2006.
MATERIALS: Autologous transplantation: Fifty New Zealand male rabbits were randomly assigned into sham operation group, model control group, cell transplantation group, rhEPO group and combination group with 10 rabbits in each group. Allograft opposite sex transplantation: Ten New Zealand male rabbits of the same strain (donors) were used to prepare skeletal muscle satellite cells. An additional ten female rabbits (recipients) were allocated into five groups. rhEPO was purchased from Shenyang Sunshine Pharmaceutical Co., Ltd.
METHODS: Autologous transplantation: Rabbit models of acute myocardial infarction were established in the model control group, cell transplantation group, rhEPO group and combination group. 3 000 U/kg rhEPO was injected by muscle injection method when ligating coronary artery in the rhEPO group and combination group. 200 μL of DMEM supplemented with about 107 skeletal muscle satellite cells was infused into the infarcted areas in the cell transplantation group and combination group. Allograft opposite sex transplantation: Rabbit models of acute myocardial infarction were created in the cell transplantation group and combination group. Skeletal muscle satellite cells and rhEPO were infused according to the requirement of each group. The concentration and method were the same as above procedures. Polymerase chain reaction was used 5 days later.
MAIN OUTCOME MEASURES: Infarcted area was measured. Immunohistochemistry was used to identify blood transportation and desmin expression of myocardial tissues. Fluorescence was applied to examine skeletal muscle satellite cells. Polymerase chain reaction was used to proliferate the gene SRY.
RESULTS: At 4 weeks after transplantation, infarcted area significantly reduced in the cell transplantation group, rhEPO group and combination group, especially in the combination group, compared with the model control group (P < 0.05). The number of C34 positive cells was similar to above-mentioned results. The desmin was positively expressed in the myocardial tissues in the cell transplantation group and combination group, but negatively in the sham operation group, model control group and rhEPO group. DAPI-positive cells were more in the combination group than in the cell transplantation group. In allograft opposite sex transplantation, the width and brightness of SRY gene amplified band were significantly stronger in the combination group than in the cell transplantation group.
CONCLUSION: Combined transplantation of rhEPO and akeletal muscle satellite cells can shorten rabbit myocardial infarcted area, improve blood supply, and enhance the survival rate of skeletal muscle satellite cells after transplantation. rhEPO and akeletal muscle satellite cells have cooperation on treatment of acute myocardial infarction.

Chen KQ, Dong SH, Luo LJ, Zhang P, Liang XJ, Pang XL, Li JH.Effects of combined transplantation of recombinant human erythropoietin and skeletal muscle satellite cells on acute myocardial infarction in rabbits.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(29):5639-5642 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-29/29k-5639(ps).pdf]

摘要
背景：研究发现促红细胞生成素尚具有多种非血液系统生理效应，如参与哺乳动物胚胎的正常发育、抑制炎症、促进血管生长，以及在多种组织和细胞损伤中抑制细胞凋亡、减少梗死面积、促进功能恢复等作用。
目的：观察重组人促红细胞生成素与骨骼肌卫星细胞联合移植对兔急性心肌梗死是否具有积极作用？
设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2006-01/07在深圳市人民医院中心实验室完成。
材料：自体移植：清洁级雄性新西兰大白兔50只，随机分为假手术组、模型对照组、细胞移植组、重组人促红细胞生成素组、联合组，10只/组。异体异性移植：同品系雄性新西兰大白兔10只，作为供体用于制备骨骼肌卫星细胞；另取雌性兔10只作为受体，分为细胞移植组、联合组，5只/组。重组人促红细胞生成素为沈阳三生制药股份有限公司产品。
方法：自体移植实验：除假手术组外，其余4组建立急性心肌梗死模型。重组人促红细胞生成素组、联合组在冠脉结扎同时，采用肌注法一次性给予重组人促红细胞生成素3 000 U/kg；细胞移植组、联合组将含有约107个骨骼肌卫星细胞的DMEM溶液200 μL多点直接注射在心脏表面梗死区。异体异性移植实验：细胞移植组、联合组均建立急性心肌梗死模型，根据分组要求注射骨骼肌卫星细胞和重组人促红细胞生成素，浓度及方法同上，5 d后取材行PCR检测。
主要观察指标：测定心肌梗死面积，免疫组织化学法检测心肌组织血运改善及desmin表达，荧光检测骨骼肌卫星细胞，SRY基因PCR检测结果。
结果：移植后4周与模型对照组比较，细胞移植组、重组人促红细胞生成素组、联合组心肌梗死面积均明显减小（P < 0.05），且联合组减小幅度强于另外两组（P < 0.05）。各组梗死中心区CD34阳性细胞数量与上面结果相似。细胞移植组、联合组心肌组织desmin呈阳性表达，其余3组呈阴性。联合组移植区DAPI标记的蓝色荧光细胞数较细胞移植组明显增多。异体异性移植实验中，联合组SRY基因扩增条带的宽度和亮度均明显强于细胞移植组。
结论：重组人促红细胞生成素与骨骼肌卫星细胞联合移植能够进一步缩小兔心肌梗死面积，改善梗死区血运，提高骨骼肌
卫星细胞移植后的存活率，二者对治疗急性心肌梗死具有协同作用。
关键词：骨骼肌卫星细胞；促红细胞生成素；移植；心肌梗死

陈科奇，董少红，罗林杰，张鹏，梁新剑，庞新利，李江华.重组人促红细胞生成素联合骨骼肌卫星细胞移植对兔急性心肌梗死的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(29):5639-5642
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-29/29k-5639(ps).pdf]

>>本文导读<<

课题背景：课题为深圳市科技局资助项目，编号200602004，项目名称为“促红细胞生成素联合骨骼肌卫星细胞心肌移植的实验研究”，于深圳市人民医院中心实验室在心内科移植小组团队合作下共同完成。目前课题研究已初步证明重组人促红细胞生成素具有提高骨骼肌卫星细胞心肌移植后存活率、协同干细胞可缩小梗死面积的作用。

应用要点：在骨骼肌卫星细胞移植研究出现瓶颈时，引入重组人促红细胞生成素促红细胞生成之外的生理作用，将两者联合移植有可能为骨骼肌卫星细胞下一步研究提供新的方向。此外，采用的异体移植细胞、PCR检测细胞量的方法在目前相关研究中应用者较少，具有避免常用方法中假阳性细胞的影响。

偏倚或不足：重组人促红细胞生成素作为激素，生理机制复杂，可能产生多种生理病理效应，实验未观察重组人促红细胞生成素全身应用可能出现的副作用，因此无法全面评价其在急性心肌梗死治疗中的作用。后续试验可增加移植后细胞凋亡情况等更多的检测指标。

0 引言

大量研究已经证实骨骼肌卫星细胞心肌移植后能够抑制心肌重构、改善梗死区血运、改善心功能，可能的机制包括：具有收缩性的移植细胞直接提高心脏收缩功能[1-3]；移植细胞作为一种支架加强左室壁，减缓心室重塑，限制梗死瘢痕扩展[4]；移植细胞作为释放细胞生长因子和/或血管源性生长因子的介质，诱导细胞和血管再生[5]。因此如何进一步完善此种治疗方法成为下一步研究的重点。
随着近年来研究不断进展，发现促红细胞生成素尚具有多种非血液系统生理效应，主要有参与哺乳动物胚胎的正常发育，抑制炎症，促进血管生长，在多种组织和细胞，包括大脑皮质、脊髓、视网膜、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞的缺氧复氧及缺血再灌注损伤中，具有抑制细胞凋亡，减少梗死面积，减少心肌再灌注心律失常发生、促进功能恢复等作用[6-9]。因此将骨骼肌卫星细胞与重组人促红细胞生成素联合移植入梗死心肌可能会起到积极的协同治疗作用，但据作者检索目前国内外尚无此方面相关研究报道。
为观察重组人促红细胞生成素能否提高骨骼肌卫星细胞移植后存活率及与骨骼肌卫星细胞联合移植能否对缩小梗死面积产生协同作用等，实验拟将骨骼肌卫星细胞与重组人促红细胞生成素联合治疗急性心肌梗死。

1 材料和方法

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：于2006-01/07在深圳市人民医院中心实验室完成。
材料：①自体移植实验：清洁级雄性新西兰大白兔50只，体质量（2.0±0.3）kg，由广东省医学实验动物中心提供，动物质量合格证号：SCXK（粤）2003-0002，粤监证字2006A001，随机分为5组：假手术组、模型对照组、细胞移植组、重组人促红细胞生成素组、联合组，10只/组。②异体异性移植实验：取同品系雄性新西兰大白兔10只，作为供体用于制备骨骼肌卫星细胞；另取雌性兔10只作为受体，分为细胞移植组、联合组，5只/组。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。重组人促红细胞生成素为沈阳三生制药股份有限公司产品。　α-sarcomeric actin抗体、desmin抗体、CD34抗体为武汉博士德公司产品。
实验方法：
骨骼肌卫星细胞的分离培养和纯化：将安定3 mg与阿托品0.3 mg混合后于兔臀部肌肉注射，20％乌拉坦按1 g/kg的用量耳缘静脉注射麻醉，仰卧位固定于台上，股内侧备皮、消毒，铺巾，沿股纵行切开皮肤，尽可能分离筋膜至肌肉层，沿肌肉走行方向取股四头肌肌肉，2.0 cm×1.0 cm×0.3 cm，保存于装有4 ℃血清DMEM培养基的青霉素小瓶中，无菌封口。采用组织块法培养原代骨骼肌卫星细胞，用15%的胎牛血清进行培养，3 d后换液，细胞进入对数生长期后每日换液1次，后结合Ficoll分离和差速贴壁法纯化成肌干细胞，所得细胞采用免疫组化方法加以鉴定。传代培养细胞增殖到107个准备移植。移植前1 d使用DAPI标记细胞过夜，移植当天将细胞悬浮于100 μL DMEM无血清培养基中备用。
自体移植实验：
动物模型制备：模型对照组、细胞移植组、重组人促红细胞生成素组、联合组兔建立急性心肌梗死模型，用20%乌拉坦5 mL/kg静脉麻醉后仰卧固定，针形电极刺入四肢及剑突处皮下，记录6个肢体及单极胸导联心电图。在第2~4肋间水平，沿胸骨正中线切开皮肤，钝性分离，暴露左侧第2、3、4肋软骨，每根肋骨在近远端双线结扎后，于结扎线间剪断肋骨，牵拉结扎线拉开切口，打开心包膜，充分暴露心脏，在肺动脉圆锥和左心耳交角下方约0.5 cm处用6-0的带针缝线穿过心肌双重结扎，结扎牢固后可见心肌颜色变暗。假手术组兔仅麻醉开胸，但不结扎冠脉。
各组干预措施：重组人促红细胞生成素组、联合组在结扎同时，采用肌注方法一次性给予重组人促红细胞生成素3 000 U/kg，其余3组均给予等量生理盐水。稳定30 min后行心电图检查，若有相关导联ST段弓背向上抬高则提示模型制作成功。细胞移植组、联合组将含有约107个骨骼肌卫星细胞的DMEM溶液200 μL多点直接注射在心脏表面梗死区，其余3组种植等量的不含骨骼肌卫星细胞的无血清DMEM溶液。逐层关胸，回笼饲养。连续3 d肌注青霉素预防感 染。
梗死范围测定：移植后4周再次麻醉，颈部备皮，切开皮肤，从一侧颈静脉刺入肝素帽套管针，肝素冲洗抗凝，备用。再次开胸，暴露心脏，并扩大切口，从套管针注入10％KCl 5 mL，心脏即停搏在收缩期，钳夹肺动脉和主动脉，将心脏剪下，浸泡于生理盐水中，从左心耳注入1％的伊文思蓝，静置，观察心肌逐渐染色，染色毕，松开血管钳，冲洗心脏，至为清澈液体流出为止。拍照，剪去右心室和心耳，左心室称重，再切片，剪下缺血区，将缺血区称重，计算重量比。
骨骼肌卫星细胞荧光检测及心肌组织desmin表达免疫组织化学检测：取出心脏，甲醛固定，石蜡包埋，使用荧光显微镜在460 nm激发光下观察DAPI标记的细胞，随机选5个细胞数目较多的区域，计数细胞，取平均值。采用免疫组织化学染色观察心肌梗死区desmin的表达。
心肌梗死区血运改善状况评估：免疫组织化学标记梗死区CD34，光学显微镜下计算微血管数目，以此评估心肌血运改善状况。
异体异性移植实验：
动物模型制备与干预措施：移植前4 h，细胞移植组、联合组兔肌肉注射环胞素A 5 mg/kg，使用冠脉结扎法制作兔急性心肌梗死模型。确认模型制作成功后，根据分组要求注射骨骼肌卫星细胞和重组人促红细胞生成素，浓度及方法同上，随即缝合肌肉至皮肤各层，术后连续5 d肌注青霉素和环胞素A 2.5 mg/kg抗感染、抗排斥。
SRY基因PCR检测：动物麻醉、固定同前，迅速开胸取出心脏，冰生理盐水冲洗，寻找到结扎线，以其为标志，剪下心肌梗死区域，切成1 cm×1 cm×1 cm的小块，装入冷冻管中，迅速放入液氮中保存，通过冷冻研磨和组织匀浆的方法裂解组织样品，裂解液为TRIZOL，基因组DNA提取采用常规酚：氯仿：异戊醇抽提法，样品DNA定量采用紫外分光光度计进行测量和计算。
主要观察指标：①骨骼肌卫星细胞形态和特性。②心肌梗死面积。③心肌组织desmin及CD34免疫组织化学检测。④骨骼肌卫星细胞荧光检测结果。⑤SRY基因PCR检测结果。
设计、实施、评估者：实验设计为第一、二、三、四作者，实施为第四、五、六、七作者，评估为第一作者，均经过系统培训，未使用盲法评估。
统计学分析：由第四作者采用SPSS 12.0软件处理，数据用x(_)±s表示，组间比较采用单因素方差分析(Bonferroni法)，样本均数间比较用q检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 骨骼肌卫星细胞形态和特性 组织块接种后3 h完全贴壁，3 d时于倒置相差显微镜下可见细胞开始从贴壁组织块的边缘游出，呈针形，散在排列，见图1。

静置培养5~7 d后，组织块边缘细胞密度明显增大，细胞逐渐伸展，呈梭形或纺锤形，有两极，胞核折光性强，少数细胞呈多角形，有突起。随培养时间延长，细胞呈放射状增殖排列，开始进入对数生长期。当细胞数目达到培养面80%以上时，采用Ficoll密度梯度离心法及连续3次差速贴壁法纯化原代骨骼肌卫星细胞，纯化后的细胞约5 h全部贴壁、伸展，24 h后细胞即开始增殖，3~4 d后细胞增殖加速，呈规律性放射状排列，细胞呈梭形，细胞透明度较原代细胞大，胞核、胞膜清晰，细胞核椭圆形，多数1个核仁，少数可见2-3个核仁，胞浆内无颗粒或可见少量颗粒，无空泡。培养细胞DAPI染色呈现明亮的蓝色荧光，见图2。

2.2 心肌梗死面积测定结果 与模型对照组比较，细胞移植组、重组人促红细胞生成素组、联合组心肌梗死面积均明显减小（P < 0.05），且联合组减小幅度强于另外两组（P < 0.05），见图3。

2.3 心肌组织desmin表达免疫组织化学检测 移植后4周，假手术组、模型对照组、重组人促红细胞生成素组心肌组织desmin呈阴性；细胞移植组、联合组心肌组织desmin呈阳性表达，见图4。

2.4 心肌组织血运改善状况 移植后4周，各组心肌组织CD34均呈阳性表达，见图5。
假手术组、模型对照组、细胞移植组、重组人促红细胞生成素组、联合组心肌梗死中心区CD34阳性细胞数分别为（15.090±0.566），（4.980±0.545），（6.820±0.701），（8.020±0.396），（10.100±0.686）个。与模型对照组比较，细胞移植组、重组人促红细胞生成素组、联合组梗死中心区CD34阳性细胞数均明显增多（P < 0.01），且联合组增加幅度显著强于其他两组（P < 0.01）。

2.5 骨骼肌卫星细胞荧光检测结果 移植后4周取材，通过荧光显微镜在梗死中心区观察DAPI标记的骨骼肌卫星细胞，可以看到显示蓝色荧光的细胞，随机取5个区域分别计数荧光标记的细胞均值，与细胞移植组比较，联合组移植区蓝色荧光细胞数显著增多（P < 0.05），见图6，7。

2.6 SRY基因PCR检测结果 对细胞移植组、联合组进行PCR检测，可见编码Y染色体的SRY基因表达，根据gen genius软件检测，联合组（3#）SRY基因的扩增条带宽度和亮度均明显强于细胞移植组（1#、2#），见图8。

3 讨论

3.1 心肌梗死面积变化 Xu等[10]研究重组人促红细胞生成素对心肌缺血再灌注损伤大鼠模型的影响，结果显示缺血再灌注损伤诱导的心肌梗死面积明显缩小。研究表明重组人促红细胞生成素通过促进心肌细胞增殖[11]，减少心肌细胞凋亡，减轻局部炎症反应，改善冠状动脉血流等方面缩小梗死面积。
从本实验的心肌梗死面积变化的结果亦可以看出重组人促红细胞生成素具有缩小急性心梗后心肌梗死面积的作用，骨骼肌卫星细胞也有缩小梗死面积的作用，同时两者联合起来应用产生协同作用。细胞移植组心肌内注射了干细胞，既往许多研究表明骨骼肌卫星细胞移植入梗死心肌，可以减小梗死面积，可能的机制为植入后存活下来的细胞继续扩增，相互之间融合，形成肌纤维，弥补坏死的心肌组织，减少梗死面积，而同时卫星细胞具有旁分泌作用，可以部分改善缺血区的血运，减小梗死面积；重组人促红细胞生成素组肌注了重组人促红细胞生成素，其作用于心脏后，可同时引起血管内皮细胞和平滑肌细胞的增生，促进缺血心肌组织血管再生和侧支循环建立，减少和防止心肌梗死范围的扩大。
相比较而言，细胞移植组与重组人促红细胞生成素组之间在梗死面积上基本相似（P > 0.05），分析造成这种结果的原因有：①心肌梗死面积计算过程中产生的误差，因需要切割、称重，有可能出现实验误差，可通过增大样本量、仔细操作、统一标准等方法尽量减少误差的出现。②移植入心梗区的细胞数量少，造成治疗效果不明显，差异减小，可通过增加移植细胞数量来进一步实验验证。联合组同时给予了干细胞和重组人促红细胞生成素，可能综合上述两种治疗方法的优点，并起到协同作用，使梗死面积进一步缩小。实验只选取了最后一个时间点即移植后4周取材进行测量，所以结果一方面仅能反映重组人促红细胞生成素联合骨骼肌卫星细胞移植于缺血心肌后的早期效应，另一方面因为动物数量偏少，可能存在统计学误差。
3.2 心肌血运改善状况评价 通过免疫组化微血管计数的方法，对给予治疗后4周局部血运改善状况进行分析，从结果可以看出对改善心肌血运效果最好的是联合组，其次是重组人促红细胞生成素组，再次是细胞移植组（P < 0.05），这一方面说明两种治疗方法无论单独应用还是联合应用对改善心肌血运均可起到积极作用；另一方面说明重组人促红细胞生成素在改善心肌血运方面效果要比骨骼肌卫星细胞好，可能原因是重组人促红细胞生成素本身既具有较强的促血管生成作用，因此可以直接诱导新生血管的生成，改善心肌血运，而骨骼肌卫星细胞通过分泌促血管生成的细胞因子来间接发挥改善心肌血运的作用，这样效果就依赖于骨骼肌卫星细胞的移植后存活数量及分泌细胞因子的能力，而心肌梗死后的缺血环境不利于细胞的存活及功能的发挥，因此导致它在改善血运方面效果不如重组人促红细胞生成素；上述结果亦提示重组人促红细胞生成素和骨骼肌卫星细胞联合移植可以起到协同作用，进一步改善心肌血运。Van der Meer等[12]在大鼠急性心肌梗死后注射促红细胞生成素，9周后检测发现心功能改善伴随毛细血管密度的增加，毛细血管心肌细胞比例增加，与本实验观察到的结果相同。促红细胞生成素是一种血管生长因子，它既能促进血管内皮细胞的分裂增殖、上调基质金属蛋白酶2的表达、参与血管发生的早期事件，同时也能促进血管形成，参与血管发生的晚期事件[13]，这些可以解释促红细胞生成素改善血运的作用。
3.3 移植细胞存活状况初步评估 荧光显微镜下细胞计数及异体移植后PCR结果显示，重组人促红细胞生成素可以提高骨骼肌卫星细胞移植后的存活率，分析可能原因：①由于重组人促红细胞生成素具有促新生血管生成的作用,改善梗死区血液供应[14]，因此改善了骨骼肌卫星细胞移植后的存活环境，更加有利于骨骼肌卫星细胞的存活。②既往研究显示重组人促红细胞生成素具有抑制凋亡蛋白酶激活因子的表达和Caspase1，3，8，9激活的作用[15-16]，从而抑制细胞凋亡，因此有可能降低骨骼肌卫星细胞移植后因凋亡减少的数量。③研究表明重组人促红细胞生成素能够明显抑制缺血再灌注诱导的NF-κB和激活蛋白1、TNF-α、白细胞介素6、细胞间黏附分子1生成减少，白细胞介素10生成增加[17]，同时重组人促红细胞生成素可通过PI3K途径激活AP-1而预防缺血再灌注所产生的急性心肌细胞炎症反应[18]，而且促红细胞生成素还可以产生缺血预适应样作用[19-20]。从上述研究结果可以看出重组人促红细胞生成素能够抑制炎症反应，抑制炎症细胞聚集，创造更有利的移植环境，因此可以减少骨骼肌卫星细胞的死亡。目前骨骼肌卫星细胞心肌移植面临诸多亟待解决的问题，其中一大瓶颈问题既移植后存活细胞数目过少，直接影响了移植效果，而本实验观察到重组人促红细胞生成素在一定程度上具有提高骨骼肌卫星细胞存活率的积极作用，值得进一步验证，这将为骨骼肌卫星细胞移植开辟新的空间。
实验中所选用的重组人促红细胞生成素对改善心肌缺血区血供、挽救濒死心肌具有积极作用。同时将骨骼肌卫星细胞与重组人促红细胞生成素联合移植，在减小梗死面积、改善缺血区血运等方面可以观察到协同作用，这与其他研究将骨骼肌卫星细胞与促血管生成因子联合移植的结果相似。但实验观察到单纯的重组人促红细胞生成素亦可提高骨骼肌卫星细胞移植后的存活率，这值得进一步深入分析。

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