Effects of bone marrow mesenchymal stem cell intravenous transplantation combined with autologous bone marrow stem cell mobilization on cardiac function in rats with cardiomyopathy-induced heart failure
Yao Wei1, Wang Feng-zhi2

Abstract
BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) possess the potential in multi-directional differentiation and can differentiate into cardiomyocytes, which had self-discipline jumpiness. There are few reports on intravenous transplantation or autologous mobilization of BMSCs for treating dilated cardiomyopathy-induced heart failure.
OBJECTIVE: To study the effect of BMSC intravenous transplantation combined with bone marrow stem cell autologous mobilization on cardiac function in rats with cardiomyopathy-induced heart failure.
DESIGN, TIME AND SETTING: This control experiment was conducted at the National Physiological Laboratory, Molecule Laboratory, Animal Experimental Center and Central Laboratory of Shanxi Medical University from January 10th, 2007 to January 10 th, 2008.
MATERIALS: Five Wistar rats served as BMSC donor. Fifty rat models of cardiomyopathy-induced heart failure were created by intraperitoneally injected with 15 mg/kg adriamycin for six weeks. Recombinant human granulocyte stimulating factor (GSF) was bought from Qilu Pharmacy Co., Ltd. CD44, CD34 and CD45 were given by Flow Cytometric Analysis Laboratory, Experimental Center, Shanxi Medical University.
METHODS: BMSCs were isolated, purified and cultured in vitro. Surface marker CD45, CDD44 and CD34 were detected with f1ow cytometer. Wistar rat models were randomized into 4 groups. BMSCs and recombinant human GSF (50 μg/kg) were injected into models by tail vein and hypodermoclysis infusion respectively in the combination treatment group (MG group). Recombinant human GSF (50 μg/kg) was subcutaneously injected into models in the bone marrow stem cell autologous mobilization group (G group). BMSCs were injected into rat models by tail vein in the BMSC group. Rat models in the heart failure group were intact.
MAIN OUTCOME MEASURES: ①Peripheral blood leukocyte and mononuclear cell counts and CD34 expression were obtained before treatment and 6 days after treatment. ②At 4 weeks, cardiac function parameters were evaluated by echocardiography and hemodynamic measurement.
RESULTS: Compared with that before treatment, peripheral blood leukocyte and mononuclear cell counts significantly increased in the MG group and G group at day 6 (P < 0.05), but no significant difference was detected in the heart failure group. Cells were positive for CD34 in the MG group and G group, whereas negative for CD34 in the heart failure group. Echocardiography and hemodynamic indexes showed that cardiac function was significantly improved in rat models with dilated cardiomyopathy-induced heart failure in the MG group, G group and BMSC group at week 4, especially in the MG group.
CONCLUSION: BMSCs in combination with BMSC autologous mobilization have an improved effect on cardiac function in rats with heart failure.

Yao W, Wang FZ.Effects of bone marrow mesenchymal stem cell intravenous transplantation combined with autologous bone marrow stem cell mobilization on cardiac function in rats with cardiomyopathy-induced heart failure.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(29):5645-5648 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-29/29k-5645(ps).pdf]

摘要
背景：骨髓间充质细胞具多向分化潜能,可分化为自律性跳动的心肌细胞，而经静脉移植和骨髓动员骨髓间充质细胞治疗扩张型心肌病心力衰竭的报道较少。
目的：观察骨髓间充质细胞静脉移植联合自体骨髓干细胞动员对心肌病心力衰竭大鼠心功能的影响。
设计、时间及地点：对照观察实验，于2007-01-10/2008-01-10在山西医科大学国家重点生理实验室、山西医科大学分子实验室、山西医科大学实验动物中心、山西医科大学中心实验室完成。
材料：Wistar大鼠5只作为骨髓间充质细胞供体。50只以阿霉素腹腔注射6周，15 mg/kg制作大鼠心肌病心力衰竭模型。重组人粒细胞刺激因子购于齐鲁制药有限公司。CD44、CD34、CD45均为山西医科大学实验中心流式细胞仪实验室提供。
方法：分离纯化大鼠骨髓间充质细胞进行体外培养，采用流式细胞仪检测其表面标记CD45、CD44和CD34。造模后随机分成4组：联合治疗组尾静脉注射骨髓间充质细胞和皮下注入重组人粒细胞刺激因子50 μg/kg，自体骨髓干细胞动员组皮下注入重组人粒细胞刺激因子50 μg/kg，骨髓间充质干细胞组为尾静脉注射骨髓间充质细胞，心力衰竭组不给予任何干预。
主要观察指标：①治疗前及治疗后第6天大鼠外周血白细胞计数和单个核细胞数及CD34表达。②造模4周后以彩色超声心动图和血液动力学检查评价各组大鼠心功能参数。
结果：与治疗前相比，联合治疗组、自体骨髓干细胞动员组治疗后第6天外周血白细胞计数和单个核细胞数明显增高（P < 0.05），心力衰竭组则无明显变化。联合治疗组、自体骨髓干细胞动员组CD34阳性，心力衰竭组CD34阴性。联合治疗组、自体骨髓干细胞动员组及骨髓间充质细胞组造模4周后血液动力学指标及心脏超声结果显示扩张型心肌病心力衰竭模型大鼠心功能得到明显改善，以联合治疗组改善效果更好。
结论：骨髓间充质细胞联合自体骨髓干细胞动员对心力衰竭大鼠心功能有明显改善作用。
关键词：骨髓间充质细胞；骨髓干细胞动员；静脉移植；心功能

姚巍，王凤芝.骨髓间充质细胞静脉移植联合自体骨髓干细胞动员对心肌病心力衰竭大鼠心功能的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(29):5645-5648 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-29/29k-5645(ps).pdf]

>>本文导读<<

课题背景：课题为中华医学会心血管病分会委员、中华医学会心血管病分会心衰组委员、山西省心血管病分会主任委员王凤芝教授主持下的系列博士生课题。探讨骨髓间充质细胞静脉移植联合自体骨髓干细胞动员对心肌病心力衰竭大鼠心功能的影响。

临床应用性: 课题采用简单易行的静脉移植和骨髓动员，如平时打针和输液一样。倘若在动物实验中取得理论依据，可作为应用于临床的参考数据。

相关链接:目前骨髓间充质细胞治疗心力衰竭主要在开胸手术和支架置入中应用，费用代价较高，重症心力衰竭患者症状较重很难接受。静脉移植和骨髓动员是较好的治疗手段，但尚缺乏理论依据。国外有少数学者在扩张型心肌病动物模型上先后以心肌细胞、平滑肌细胞、骨骼肌干细胞及骨髓单个核细胞进行自体移植实验，静脉移植和骨髓动员目前研究报道少见。

0 引言

近年来骨髓间充质细胞治疗心梗大鼠的心衰研究已成为国内外研究的热点,目前干细胞移植主要采用胸腔心脏注射、冠脉介入、静脉移植3种方法。由于扩张心肌病大鼠的心力衰竭病理改变是心肌弥漫性损害,介入需要多支冠脉进行,而胸腔心脏注射需要开胸手术，患者及家属则很难接受，故本文采用静脉移植。自体骨髓干细胞动员治疗心肌梗死大鼠的心力衰竭已有报道，本实验将探讨其联合应用对心肌病心力衰竭大鼠的心功能影响。

1 材料和方法

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：于2007-01-10/2008-01-10 山西医科大学国家重点生理实验室、山西医科大学分子实验室、山西医科大学实验动物中心、山西医科大学中心实验室完成。
材料：雄性Wistar大鼠5只，体质量80~ 100 g，山西医科大学实验动物中心。实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。低糖DMEM培养液购于GIBCO公司；胎牛血清FCS购于杭州四季青公司。重组人粒细胞刺激因子购于齐鲁制药有限公司。CD44、CD34、CD45均为山西医科大学实验中心流式细胞仪实验室提供。
方法:
大鼠骨髓间充质细胞的分离、培养和扩增:选雄性Wistar大鼠5只，体质量80~100 g，作为骨髓间充质细胞供体。雄性Wistar大鼠脱颈处死，用75％乙醇浸泡15 min。无菌条件下取出股骨和胫骨，用含体积分数15％FCS的DMEM培养液反复冲洗骨髓腔，得到的细胞悬液接种到培养瓶中，置于37 ℃，体积分数为0.05的CO2孵箱中培养。72 h后首次换液去除未贴壁细胞，以后每2天换液1次。待细胞覆盖到瓶底的80％时，用0.25％的胰酶消化传代。传至2代时，弃去培养液，磷酸盐缓冲液液(PBS)洗涤3次， 2.5 g/ L 胰蛋白酶消化细胞，制成细胞悬液，移植备用。
流式细胞仪检测细胞表面标记:取第2代骨髓间充质细胞，消化离心，用PBS制成2×109 L-1细胞悬液，分装至1.5 mL EP管中，分别加入荧光标记的小鼠抗大鼠单抗CD34-FITC，CD45- FITC，CD44-PE，及其同型对照各组10 μL，混匀，用流式细胞仪检测细胞表面标记CD34， CD45，CD44。
阿霉素诱导心肌病心力衰竭大鼠模型的建立：选用50只Wistar大鼠，阿霉素腹腔注射，每次2.5 mg/kg，1次/周，连续6周，共6次，总剂量15 mg/kg，末次注射完成后，观察2周，对存活的大鼠，由经胸彩色超声心动图测得心功能参数，以左室射血分数(LVEF％)、左室短轴缩短率(LVFS％)较正常参考值下降20%~30%作为心衰模型建立的标准。选取符合标准40只，随机分成4组，心力衰竭组(心衰模型不做任何干预)10只，骨髓间充质细胞组10只(心力衰竭模型植入骨髓间充质细胞)，自体骨髓干细胞动员组(重组人粒细胞刺激因子 50 μg/kg，皮下连续 5 d)及联合治疗组10只（联合治疗）。
外周血白细胞及单个核细胞的测定：联合治疗组、自体骨髓干细胞动员组及心力衰竭组

在治疗前及治疗后第6天剪尾取血，标本即刻用ABX血细胞自动分析仪测量白细胞总数及单个核细胞百分比。
单个核细胞提取及CD34检测：用Ficoll密度梯度离心法直接分离和纯化外周血单个核细胞。加入CD34-FITC荧光标记物，充分振摇4 ℃ 30 min，注入 1.4 mL洗涤液将细胞悬起，离心2 000 r/min×5 min， 4 mL洗涤液洗涤1遍，加固定液400μL。送流式细胞仪检测。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
心脏超声测定：各组大鼠分别于造模成功后2周时行心脏超声检查，选取40只符合心衰标准心肌病心力衰竭大鼠。4周后复查各组心功能。
血液动力学检查：各组大鼠分别于造模成功后4周后在在水合氯醛麻醉下行血液动力学检查，比较心功能指标。
主要观察指标：①治疗前及治疗后第6天大鼠外周血白细胞计数和单个核细胞数及CD34表达。②4周后以彩色超声心动图和血液动力学检查评价各组大鼠心功能参数。
设计、实施、评估者： 实验设计、实施、评估者均为第一、第二作者。
统计学分析：由第一作者和本校统计学教研室统计学博士研究生马菲完成，采用SPSS 10.0统计学软件进行统计学处理，统计量以x(_)±s表示。3组间比较采用方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 骨髓间充质细胞定性 形态学和流式细胞学检测 细胞接种24~48 h后，部分细胞开始贴壁，贴壁生长的维胞呈梭形或多角形。3~5 d后细胞快速增殖，形状亦逐渐变为梭形，2周长满瓶底，此时进行1∶3传代，第2代为梭形成纤维样细胞，流式细胞仪检测第2代骨髓间充质细胞表面表记，结果发现:CD45阳性细胞为(3.1±0.7) %, CD44阳性细胞数达至( 90.8±0.5) %,CD34阳性细胞达到(2.9士0.6) %。
2.2 阿霉素诱导心肌病心力衰竭大鼠的建立 阿霉素诱导心肌病心力衰竭大鼠模型组在注射阿霉素6周死亡2只，末次注射停药2周内死亡2只，共4只死亡，死亡率8%，模型组大鼠精神差，毛色不光滑，活动、进食与对照组相比减少，模型组大鼠有腹水生成，生成率58%。模型组心脏大体标本肉眼观察较正常大鼠明显增大，左心室切面观察心室腔增大，心室壁变薄。超声显示模型组收缩功能较差。
2.3 各组治疗前后外周血白细胞及单个核细胞 见表1。

2.4 治疗6 d后各组外周血CD34表达 通过流式细胞仪检测可以看出联合治疗组，自体骨髓干细胞动员组CD34阳性，有明显第二峰，而心衰组没有第二峰为阴性。联合治疗组CD34阳性率(28.65±0.98)%; 自体骨髓干细胞动员组CD34阳性率(28.67±0.91)%; 心力衰竭组CD34阳性率(1.41±0.77) %。联合治疗组、自体骨髓干细胞动员组与心力衰竭组相比有明显差异性（P < 0.05）。
2.5 各组造模4周后血液动力学比较 见表2。

2.6 各组造模4周后心脏超声比较 见表3。

3 讨论

近年来，扩张型心肌病发病率在国内外呈逐增高趋势，已成为继冠心病、风湿性心脏病、先天性心脏病之后的常见心脏疾病，并且也成为引起恶性心力衰竭的最主要原因之一。重症心力衰竭已成为临床上的难点，传统治疗方法已不能改善其现状，迫切需要一种全新的治疗手段治疗。目前干细胞的研究为治疗提供了新的思路，但多集中在缺血性心脏病和心肌局部病变[1-12]，对于非缺血性心脏病及弥漫性全心疾病如扩张型心脏病则研究较少。目前，国外仅有少数学者在扩张型心肌病动物模型上先后以心肌细胞、平滑肌细胞、骨骼肌干细胞及骨髓单个核细胞进行自体移植研究[13]，但在静脉移植方面则报道更少。本实验拟在探讨骨髓间质细胞静脉移植联合骨髓干细胞自体动员对扩张型心肌病心力衰竭大鼠模型心功能的影响。
目前动物实验己证明骨髓干细胞治疗缺血性心血管疾病的有效性[14-15]。但在非缺血性心脏病及弥漫性全心疾病如扩张型心脏病则研究较少。文献报道将骨髓干细胞移植至心肌梗死模型，心功能得到改善，骨髓干细胞分化为心肌样细胞。骨髓间质细胞具多向分化潜能,近来发现其能分化成细胞甚至为自律性跳动的心肌细胞[16]，而经静脉移植骨髓间充质干细胞治疗心肌病心力衰竭鲜见报道。 本实验通过细胞形态和该细胞流式细胞仪的鉴定，说明作者移植的细胞来自骨髓间质细胞。最近有研究显示，CD34＋也是一种分化表型，并证明在骨髓、外周血、脐血中均存在一种更为原始的CD34＋表型原始造血干细胞，具有强大的自我更新和分化潜能，目前认为它可能是造血干细胞、骨髓间质细胞和骨髓成血管细胞的共同谱系祖先[17]。也有实验数据表明在一定微环境下，骨髓造血干细胞可以转化为心肌细胞并替代损伤的心肌和修复血管内皮细胞[18]。本实验发现自体骨髓干细胞动员组及联合治疗组治疗6 d后外周血白细胞及单个核细胞数明显增多，与未动员心衰组有明显差异性。而且自体骨髓干细胞动员组及联合治疗组可以看见CD34阳性，有明显第二峰，与模型组有明显差异性。这说明骨髓动员治疗动员出原始的CD34＋表型原始造血干细胞。本实验之所以选择动员第5天，是文献报道G-CSF动员骨髓干细胞再内循环中五六天时CD34+达最高峰，到6 d再给药下降, 而第11天则为高峰的1/4[19-20]。本实验中发现自体骨髓干细胞动员组、联合治疗组及骨髓间质细胞组均能明显改善扩张型心肌病心力衰竭模型大鼠的心功能。而联合治疗组则改善的更明显些。这充分说明骨髓间质细胞联合骨髓动员对扩张型心肌病心力衰竭模型有明确的疗效。

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