Autologous bone marrow stromal cells-derived neural stem cell transplantation for treating persistent vegetable state
Dai Yi-wu, Zhao Chun-ping, Luo Yong-chun, Qin Jia-zhen, Li Pei-jian, Liu Zhi-liang, Liang Chun-yang, He Jiang-hong, Shen Chun-sen, Wei Qun

Abstract
BACKGROUND: Previous studies of animal models of brain stem injury have showed that bone marrow stromal cells-derived neural stem cells have a chemotactic effect on brain stem injury following transplantation.
OBJECTIVE: To explore the possibility and clinical effect of bone marrow stromal cells-derived neural stem cell transplantation for treating patients with persistent vegetative state.
DESIGN, TIME AND SETTING: The self-control study was performed at the Department of Neurosurgery, General Hospital of Beijing Military Area Command of Chinese PLA from October 2002 to December 2006.
PARTICIPANTS: Totally 45 patients aged 3.5-56.0 years old, including 28 males and 17 females, with persistent vegetative state were enrolled in this study.
METHODS: After admission, patients received Glasgow Coma Scale, preoperative routine examinations, electroencephalogram and auditory evoked potential. 20 to 30 mL of patients’ bone marrow was collected to harvest bone marrow stromal cells. The cells underwent amplification and pre-differentiation. Bone marrow-derived neural stem cells were collected at a concentration of 109 L-1. Bone marrow-derived neural stem cells were transplanted into particular regions of the brain via open-cranial surgery, stereo-surgery or catheter intervention surgery. Target region included the injured cortex, subventricular region, corpus striatum, discus lentiformis, or middle cerebral artery of affected sides, vertebral artery.
MAIN OUTCOME MEASURES: Three to four months after transplantation, Glasgow Coma Scale, electroencephalogram, and auditory evoked potential were examined and compared with that before transplantation.
RESULTS: After stem cell transplantation, all patients showed a stable life indication. Five patients developed short-term fever, and their body temperature recovered to normal after expectant treatment. Three to four months after transplantation, coma index, electroencephalogram and auditory evoked potential were significantly improved.
CONCLUSION: Bone marrow stromal cells-derived neural stem cell transplantation for treatment of missile-wound cerebral injury and its sequelae can promote tissue and function of the functional recovery of central nerve system.

Dai YW, Zhao CP, Luo YC, Qin JZ, Li PJ, Liu ZL, Liang CY, He JH, Shen CS, Wei Q.Autologous bone marrow stromal cells-derived neural stem cell transplantation for treating persistent vegetable state.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(29):5649-5652 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-29/29k-5649(ps).pdf]

摘要
背景：前期动物脑干损伤模型实验中观察到骨髓基质细胞源神经干细胞移植后对脑干损伤具有趋化作用。
目的：观察骨髓基质细胞源性神经干细胞移植治疗持续性植物状态的可行性及临床效果。
设计、时间及地点：自身对照观察实验，于2002-10/2006-12在解放军北京军区总医院神经外科进行。
对象：选择持续性植物生存患者45例，年龄3.5~56.0岁，男28例，女17例。
方法：患者入院后进行意识指数评分、各项术前常规检查、脑电图、听觉诱发电位检测。取患者自体骨髓20~30 mL，分离出骨髓基质细胞，再经过扩增及预分化处理后，将骨髓源神经干细胞制成109 L-1浓度。经开颅或立体定向及导管介入将骨髓基质源神经干细胞植入脑内特定区域，靶区为损伤脑区皮质、室管膜下区、纹状体区、丘脑底核或患侧大脑中动脉、椎动脉。
主要观察指标：3~4月后检查记录昏迷指数、脑电图、听觉诱发电位，并与治疗前进行对比。
结果：全部患者干细胞移植后，生命指征均平稳。5例有短时发热，经对症处理体温恢复正常。3~4个月后随访复查，患者意识（昏迷）指数、脑电图、听觉诱发电位均明显改善。
结论：骨髓基质细胞源性神经干细胞移植治疗战创伤性脑损伤及其后遗症，具有促进中枢神经系统组织及功能恢复的作用。
关键词：骨髓基质细胞；神经干细胞；移植；持续性植物状态

戴宜武，赵春平，罗永春，秦家振，李培建，刘志良，梁春阳，何江弘，沈春森，魏群.自体骨髓基质细胞源神经干细胞移植治疗持续性植物状态[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(29):5649-5652
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-29/29k-5649(ps).pdf]

>>本文导读<<

课题背景： 国家自然科学基金面上项目，资助金额22万元，基金编号30571916，课题名称为骨髓基质细胞向胆碱能神经元祖细胞分化及自体移植治疗实验研究；军队计划课题：骨髓基质源神经干细胞修复脑战创伤机理及移植方法研究。编号：06BJ017。本文为课题的一部分内容。课题组系统研究了大鼠、兔、猫、犬、猴等各类动物及人类的骨髓基质细胞向神经细胞分化的可行性，以及自体、异体移植的技术方法，建立了相对稳定的骨髓基质细胞体外扩增技术体系和定向分化为神经干细胞的技术方法。

应用要点：文章第一作者戴宜武教授为医学博士，主任医师，研究生导师，军队优秀科技干部津贴获得者。从事神经外科20余年，发表论文30余篇，获军队科技进步二、三等奖4项，中华创伤学会优秀论文奖一项。目前主持“国家自然科学基金课题”、“军队计划课题”等多项科研项目。曾在国内外率先开展“骨髓基质源神经干细胞”移植治疗脑脊髓损伤后遗症、早期植物状态、脑萎缩脑瘫、及早期老年性痴呆等神经系统疾病的治疗，并取得了明显的临床疗效。

同行评价：骨髓基质细胞源神经干细胞移植治疗脑损伤的研究，目前大部分的成果来自于体外实验和动物模型，临床研究较少。本文对进行骨髓基质源神经干细胞移植治疗持续性植物状态的可行性及初步的临床效果观察，发现治疗后患者的病情有一定程度的好转，具有一定的可信性。其在“骨髓基质源神经干细胞的分化及应用”方面的研究工作处于同类研究领先地位。

0 引言

持续性植物状态的概念由Jennett和Plum[1]于1972年首先提出，以描述严重颅脑损伤患者在恢复过程中脱离昏迷，觉醒但无认知的状态。近年来，国内外对于“植物状态”及持续性植物状态的诊断标准渐趋统一，但对持续性植物状态尚缺乏有效的治疗方法。
近年来，由于医疗水平的不断提高，一方面挽救了许多濒临死亡的患者，同时也使其中为数不少的人处于植物状态。据西方一些国家统计，持续性植物状态的发病率多在0.1%~0.3%之间，美国为1.68%。国内尚无此方面的统计资料，但据估计，国内的持续性植物状态患者不会少于10万人。持续性植物状态患者的大量出现，带来了一系列社会和经济问题，已受到社会各界的广泛关注。
骨髓基质源神经干细胞是由骨髓基质细胞分化而来的神经干细胞，具有与胚胎干细胞来源的神经干细胞及神经组织来源的神经干细胞类似的生物学特性。本实验在前期研究的基础上，探索性的将骨髓基质细胞源神经干细胞自体移植用于持续性植物状态的治疗，旨在为神经系统损伤的修复提供新的治疗手段。

1 对象和方法

设计：自身对照观察。
时间及地点：实验于2002-10/2006-12在解放军北京军区总医院神经外科完成。
对象： 经过自体骨髓基质细胞源神经干细胞移植治疗的持续性植物生存患者45例，参考美国神经病学会标准(1993)和中华急诊学学会意识障碍专业组标准确诊，年龄3.5~56岁，男28例，女17例，患者及家属对实验知情同意，并经医院伦理委员会批准。术后随访观察三四个月。
方法：
骨髓采集及骨髓基质细胞的分离：
局麻下行髂前上棘穿刺，骨穿针穿透骨皮质至骨髓腔，用肝素湿化处理的注射器用力抽吸骨髓10 mL。将所获骨髓用DMEM培养液/Hank’s 液倍比稀释后，进行梯度离心（Ficoll-Paque Plus, 1.077 g/mL, Pharmacia）, 2 000 r/min，15 min。去除上层脂肪及部分上清，吸取富含粒细胞的界面层，加DMEM至2 mL，800 r/min离心 5 min，去上清，重复洗涤1次。
骨髓基质细胞的纯化（黏附培养）：
用含体积分数为0.20自体灭活血清，2 mmol/L谷氨酰胺的DMEM/F12培养基将细胞重悬至108 L-1浓度，加入25 mL培养皿内（二三个）。37 ℃，体积分数为0.05的CO2，饱和湿度条件下培养48~72 h后换液，去除非黏附细胞。
骨髓基质细胞的扩增培养：
加上述DMEM/F12 培养基5 mL，碱性成纤维细胞生长因子50 ng，表皮生长因子510 ng，连续培养观察、记录细胞生长情况，每三四天半量换液1次。
骨髓基质细胞的传代培养：
待2周左右，骨髓基质细胞爬满培养板底部时，进行传代培养（常规方法）；3~5 d后，收集扩增之基质细胞，制成109 L-1浓度。部分细胞用于诱导分化，部分继续用于增殖培养。
预分化处理及收集：
用于诱导分化的细胞撤除碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子，每瓶加上述DMEM/F12培养基5 mL、全反式维甲酸0.5 μmol/L（终浓度）、脑源性神经生长因子、胶质源性神经生长因子各50 ng；预分化处理3~5 h，再次收集细胞制成109 L-1浓度，用于移植。
细胞成分鉴定：
预分化处理3~5 h，进行细胞成分鉴定按参考文后文献[2]进行。
骨髓基质源神经干细胞脑内移植术：
①常规开颅，损伤区域皮质/皮质下多点显微注射。 ②立体定向定点植入，靶点选择：室管膜下区、纹状体区、丘脑底核，或伤侧脑室内。③经股动脉插管，患侧大脑中动脉、椎动脉选择注入。
检测指标：意识指数采用Glasgow Coma Scale 计分法(3~15分)，记录移植治疗前和移植治疗后3个月患者的意识指数。

电生理指标：
脑电图根据Hockaaday1965年的分级标准：
基本节律为α节律，接近正常为Ⅰ级，评3分。
θ波为主为Ⅱ级，评2分。
δ波为主为Ⅲ级，评1分。
脑电基本节律消失，近平坦波为Ⅳ级，评0分。

脑干听觉诱发电位评定根据Greenberg标准：
基本正常为Ⅰ级，评3分。
Ⅰ-Ⅴ波清晰可辨但潜伏期延长、波幅下降为Ⅱ级，评2分。
Ⅰ波潜伏期和波幅正常，其余各波部分存在或分化不清的正相波为Ⅲ级，评1分。
波形难以分辨或仅见Ⅰ波存在为Ⅳ级，评0分。

主要观察指标：神经干细胞移植前及移植后3~5月患者意识指数及电生理指标。
设计、实施、评估者：设计为第一作者，实施干预为全部作者，评估为第一、二作者，均经过系统培训。
随访情况：移植术后1、3、5月复查随访。
统计学分析：由第一作者采用SPSS 11.0 统计软件进行数据处理，数据以x(_)±s表示，行方差分析和组间t检验，P < 0.05 为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 参与者数量分析 45例患者全部进入结果分析。
2.2 临床效果及随访 全部患者干细胞移植后，生命指征均平稳。5例术后短时发热，经对症处理体温恢复正常。患者均完成3~5月随访。
移植术后1、3、5月随访，意识指数较移植前均有增加（P < 0.05），见表1。

3 讨论

持续性植物状态的治疗：目前对持续性植物状态尚缺乏行之有效的治疗方法。目前认为药物治疗结合高压氧、理疗、针灸、深部脑刺激、脊髓硬膜外刺激、周围神经刺激等疗法临床上部分病例有一定效果，但盲目性和不确定性仍很大。因此，近年来随着基因技术和干细胞技术的发展，逐渐兴起基因治疗、神经干细胞移植等研究热点。
神经干细胞移植动物模型及临床应用研究：神经干细胞作为组织工程学上的“种子细胞”或基因工程学上的“载体细胞”，在临床上有着广泛的医疗用途。神经干细胞的临床应用范围归纳起来有以下几种可能：用于神经系统退行性变和自体免疫性疾病的治疗[3-5]（Parkinson病、Alzheimer病等）；用于脑中风、创伤性脑、脊髓损伤及其后遗症的修复[6-16]； 作为治疗性基因和药物蛋白(细胞因子)等的运载工具（载体）[17-20], 用于恶性脑、脊髓肿瘤的治疗；用于颅神经和周围神经损伤的修复[21-22]。本组利用骨髓基质源神经干细胞移植治疗持续性植物状态 45例，治疗前后对比意识指数、脑干听觉诱发电位、脑电图等观察指标均有明显改善。进一步证实了神经干细胞的临床应用价值。
神经干细胞发挥治疗作用的可能机制：神经干细胞移植治疗神经系统损伤的作用机制可能是多方面的。一方面，是结构上的修复和神经环路的重建。另一方面，植入的神经干细胞同定居部位神经组织间相互作用，导致一些细胞因子的产生[23]，如多肽类、神经营养因子、白细胞介素类、巨噬细胞集落刺激因子、干细胞因子等 ，这些细胞因子对神经功能的恢复具有促进作用。此外，神经组织损伤后多种细胞因子的产生有助于植入神经干细胞的存活、增殖和向病损部位的迁移。
骨髓基质细胞、神经干细胞的发现、分离培养的成功和临床的初步应用，为神经系统损伤的修复和神经系统退行性病变的有效治疗带来了新的希望，也为研究神经系统发育、分化和遗传性疾病的发病机制提供了理想的“媒体” 和手段。但是也应该清楚的认识到，有关干细胞的研究还处于起步阶段，大部分结果来自于体外实验和动物模型，目前仍有许多悬而未决的问题，还需要要进行大量的基础和临床前期研究。因此在临床应时应持慎重态度，对于志愿者要进行充分的宣教和法律文件的签署。

4 参考文献

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