Autologous bone marrow stem cell transplantation in treatment of 60 cases of lower limb ischemia
Lü Xiao-xia1, Yin Zhi2, Jin Xing1, Wu Xue-jun1, Hou Xiang-qian1, Song Ying-bo3, Li Jian-feng1

Abstract
BACKGROUND: Bone marrow derived or peripheral blood derived stem cells have been proved though animal model to participate in the vasculogenesis of infarcted area and thus to improve limb blood supply.
OBJECTIVE: To evaluate the efficacy of autologous transplantation of bone marrow stem cells (BMSCs) for treating chronic ischemia of the lower limbs.
DESIGN, TIME AND SETTING: The self-consistency validation plus non-randomized control, double-blind study was performed at the Department of Vascular Surgery and Central Laboratory in Shandong Provincial Hospital Affiliated to Shandong University from September 2004 to September 2007.
PARTICIPANTS: Totally 60 aged patients with chronic ischemia of the lower limb, who had no chance of surgery or interventional treatment and were willing to receive autologous BMSC transplantation, were enrolled, including 36 males and 24 females, with a mean age of 65 years ranged from 33 to 83 years.
METHODS: Autologous BMSCs were isolated by density gradient centrifugation with stem cell extract liquid to prepare stem cell suspension, and were intramuscularly injected into the suffered limbs. The range and position of puncture depend on the area of lymphedema.
MAIN OUTCOME MEASURES: The clinical outcomes of patients were assessed by pain symptom, walking ability, skin ulcer, ankle-brachial index and foot gangrene score of the lower limbs 6 months following treatment.
RESULTS: Six months after treatment, the symptoms of pain, paresis, and coldness were alleviated, resulting in an improvement rate of 78.33%. The rest pain was relieved completely or partially in 47 patients, the distance of intermittent claudication was increased from less than 50 m to more than 100 m in 5 patients, and the ulcers of 10 patients healed up or reduced in size. Moreover, the ankle brachial index in 11 patients increased by more than 0.1. As for the four patients with toes gangrene, one got rid of the rest pain and other symptoms, and had a good wound healing after resecting the gangrenous toes; two got rid of the pain, sleep was improved and the gangrenous tissue began to exfoliate; another one was subjected to a below-knee amputation.
CONCLUSION: Autologous BMSC transplantation has definite effects on pain, coldness and paresis of patients, and can promote wound healing.

Lü XX, Yin Z, Jin X, Wu XJ, Hou XQ, Song YB, Li JF.Autologous bone marrow stem cell transplantation in treatment of 60 cases of lower limb ischemia.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(29):5653-5657
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-29/29k-5653(ps).pdf]

摘要
背景：动物实验已经证实，来源于骨髓或外周血干细胞能够在血管损伤部位分化形成新生血管，进而改善肢体血液供应。
目的：观察自体骨髓干细胞移植治疗慢性下肢缺血的临床疗效。
设计、时间及地点：自身对照加非随机对照的双盲试验，于2004-09/2007-09在山东大学附属省立医院血管外科及科研中心完成。
对象：受试对象为下肢血管缺血性病变失去外科手术或介入治疗适应症，并愿意接受自体干细胞移植的患者60例，男36例，女24例，年龄33~83岁，平均65岁。
方法：实验采用干细胞分离液，利用梯度密度法分离患者自体骨髓干细胞，制备干细胞悬液。根据缺血范围选取缺血肢体肌肉多点穿刺注射。
主要观察指标：以治疗后6个月患者下肢疼痛症状、行走能力、皮肤溃疡、踝肱指数、足坏疽评分的变化来评价临床疗效。
结果：治疗后6个月，患肢疼痛、麻木感和冷感觉改善率为78.33%，47例患者静息痛消失或明显减轻，5例患者跛行距离由不足50 m提高到大于100 m，10例伴有溃疡的患者，溃疡愈合或面积逐渐减小。11例踝肱指数增加大于0.1，4例足趾坏疽患者中1例症状明显缓解，静息痛消失，行坏疽足趾切除，愈合良好；2 例疼痛消失，睡眠改善，坏疽组织有脱落迹象；1例于膝下截肢。
结论：自体骨髓干细胞移植对肢体疼痛、冷感、麻木疗效确切，对创面愈合有促进作用。
关键词：自体骨髓干细胞移植；下肢严重缺血；治疗性血管生成

吕晓霞，尹至，金星，吴学君，侯向前，宋颖博，李建峰.自体骨髓干细胞移植治疗下肢缺血性疾病60例[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(29):5653-5657 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-29/29k-5653(ps).pdf]

>>本文导读<<

作者介绍：文章通讯作者吴学君为医学博士，副教授，山东大学硕士生导师，山东大学附属省立医院血管外科副主任。主持了山东省中青年科学家基金研究项目，参与了国家教委博士基金等课题，主要从事血栓的演变和血管壁重塑的应用基础实验研究，提出了血栓后遗症的防治措施，是本项课题的组织实施者。

偏倚或不足：①因本治疗方法有一定的创伤性，不方便对患者进行安慰剂性质的对照试验，因此对照组的设定是按照注射干细胞悬液的浓度不同来划分而成的。每个患者的骨髓增生状况不同，细胞提取数量不同，因此在配置注射液用细胞悬液时，单个核细胞细胞浓度不同。将 60例患者根据注射细胞浓度分为高浓度组（总量≥1×107）45例和低浓度组（<1×107个）15例，此2组患者进行对照。但由于每个患者细胞浓度可能因骨髓情况产生样本偏倚，也还由于2组的人数不同，在统计时不能完全利用数据的全部信息。②在治疗前，所有患者均经下肢血管彩色多普勒、CT血管成像和（或）动脉造影检查，以明确血管病变的情况。干细胞移植后最好能够复查血管造影情况，但因检查有创且放射剂量较大等原因，治疗后患者不愿再次接受影响学复诊，是本次试验的一个不足。

课题背景：使用自体骨髓干细胞移植治疗血管损伤引起的缺血性疾病是2002年提出的新的治疗理念，自体骨髓干细胞移植国内外目前均处在经循证医学验证的初级阶段，其细胞的提取方法及细胞生物学方面的研究，以及达到最好效果所需的细胞数量，注射部位和治疗时机、治疗次数，都缺少大样本的循证医学验证。本文对此提供了有用的临床记录和数据资料。

0 引言

60岁以上人群中慢性下肢动脉缺血的发生率为17％~20％，截肢率高达5％。治疗方法有血管搭桥手术，以球囊扩张及支架置入等。治疗性血管生成是近年来发展的一项新技术[1]，2002年8月，国际上首次报道了应用骨髓单个核细胞移植治疗下肢缺血[2]。
随着干细胞生物学特性研究的进一步深入及其分离技术的发展，用干细胞移植治疗下肢缺血性疾病使很多患者受益。研究表明，成体干细胞具有多分化潜能，可分化为血管内皮细胞,进一步分化形成新生毛细血管,自体干细胞移植正是利用这一原理，将干细胞移植到缺血的肢体肌肉中，使其分化、形成新生毛细血管，改善和恢复下肢血流，达到治疗下肢缺血的目的。
机体在缺血时会代偿生成新生血管,这种新生有两种方式:血管生成和血管形成。前者是指通过血管内皮细胞迁移、增殖,在原有的血管上以出芽的方式生长出新的血管；后者是指在原来没有血管系统的情况下,通过血管内皮祖细胞和造血干细胞的分化和相互作用产生新的血管[3]。传统观念认为血管生成仅存在于胚胎发育时期。已有大量实验证实内皮祖细胞存在并参与了出生后新血管形成[4]。造影显示侧枝动脉明显增多[5]。
1997年Asahara等[6]发现循环血中存在能分化形成新生血管的内皮祖细胞,证实血管发生同样参与出生后的血管新生。“治疗性血管形成” 的概念，倡导补充内皮祖细胞数量来达到更好的血管新生效果,治疗缺血性疾病。研究表明, 有些病理情况下,比如在Ⅱ型糖尿病，内皮祖细胞增殖潜能、黏附和成血管能力均降低[7]。骨髓中具有内皮祖细胞和间充质干细胞,一定条件下间充质干细胞可以定向分化成血管内皮细胞和平滑肌细胞。在使用干细胞治疗心肌缺血的研究中，已证实骨髓干细胞可促进心肌内新生血管生成[8-10],这些研究为干细胞移植治疗下肢缺血提供了基础。动物实验已经证实来源于骨髓或外周血的干细胞能够在血管损伤部位分化形成新生血管，进而改善肢体血供。
本课题组依据干细胞具有高度增殖并分化为体内各种细胞的潜能，移植后能够提供各种成血管细胞因子,促进血管生成的原理，应用自体骨髓干细胞移植技术治疗60例慢性下肢缺血疾病患者。

1 对象和方法

设计：自身对照试验加非随机分组的双盲对照试验。
时间及地点：实验于2004-09/2007-09在山东大学附属省立医院血管外科及科研中心完成。
对象：下肢血管缺血性病变失去外科手术或介入治疗适应证并愿意接受干细胞移植的患者60例，男性36例，女性24例，年龄在33~ 83岁之间，平均年龄65岁。其中下肢动脉硬化闭塞症38例，血栓闭塞性脉管炎9例，糖尿病足13例。全部患者均有足部和（或）下肢发凉、麻木、疼痛、间歇性跛行。另有不同程度的合并症，包括静息痛，溃疡，坏疽，感染，高血压，冠心病，糖尿病等。患者合并症情况见表1。

辅助检查：60例患者均经下肢血管彩色多普勒、CT血管成像和（或）动脉造影检查，股浅动脉、股深动脉狭窄或者闭塞50例，腘动脉狭窄或者闭塞43例，60例均有不同程度的胫前动脉、胫后动脉或腓动脉狭窄或者闭塞。见图1。

方法：将患者的病情进行临床评分，并在患者接受自体干细胞移植术后的观察期内对病情多次进行再评分，以治疗后评分的变化来评价疗效。
病情评估：参考国内学者所提出的下肢缺血严重程度分级[11]，将所有患者根据冷感、麻木感、疼痛程度、间歇性跛行距离、溃疡情况、有无感染、及踝肱指数等指标所获得的分数之和作为评价病情的标准[12]，并以治疗后评分的变化来评价疗效。评分标准见表2。
移植方法：术前骨髓评估：移植前进行骨髓像评估，术前先抽取0.1 mL做骨髓涂片以排除血液病，本组发现2例骨髓增殖减低，应用粒、单核细胞集落刺激因子，4 d后复查明显好转。

单个核细胞的获得：患者取俯卧位，接好床旁心电血压监护设备。常规消毒，铺洞巾。用1%的利多卡因分别在双侧的髂后上棘部位作局部麻醉。穿刺的深度因患者的胖瘦而异，但总的来说，合适深度应为骨穿针被髂骨所固定，抽取骨髓时，先抽取1 mL肝素盐水再抽取9 mL的骨髓血，见图2。使用多侧孔骨髓穿刺针，多点多方向抽取，这样可以抽取更多的骨髓细胞。抽取自体骨髓300~400 mL，贴壁注入无菌骨髓保养袋中，混匀。在体外经过人间充质干细胞分离液处理，离心后，提取单个核细胞层，根据所需体积稀释成单个核细胞悬液，见图3。

干细胞鉴定：
对分离的骨髓干细胞进行鉴定，结果：①在DMEM培养基中贴壁生长，见图4。②对所获得的细胞进行表面标志，流式细胞仪分析具有:HMSC独特的表型特征,即CD29、CD44阳性和CD34、CD45阴性。表达的细胞比率分别为CD29、94.3%、CD44、94.3%和CD34、1.7%、CD45、0.9%。

干细胞移植：患者均为第一次接受干细胞移植。首先进行硬膜外麻醉，然后根据缺血范围选取缺血肢体肌群做肌肉注射。注射前用记号笔标记穿刺点，于缺血部位主要血管走行区域纵向线型排列，上下每两点之间间隔约1 cm，两排之间间隔1.5~2 cm，一般至少须6列以上，见图5。注射量为0.5 mL/穿刺点，患者所需注射液总体积为注射针数×0.5 mL/针，注射深度依胖瘦不同为皮下1~2 cm。术后观察患者一般情况，7~10 d予出院。

主要观察指标：患者接受治疗后的评分。
随访情况：术后住院7 d左右，术后2周、1月、3月、6月门诊随访。
统计学分析：治疗前后病情的评估与统计学分析由山东大学附属省立医院血管外科医生完成。应用自身配对资料的t检验，比较60例患者移植前与移植后缺血情况临床评分的差异。

2 结果

2.1 干细胞移植情况 骨髓抽取过程中，除1例出现乏力外，其余均无异常感觉，乏力者第2天好转。干细胞移植过程顺利，分离的单个核细胞计数为（0.038~ 8.6）×108。
2.2 术后7 d内患者临床表现

术后第1天患者均反映患肢不适感好转。
出院时47例（78.33%）患者静息痛消失或明显减轻，麻木感和冷感减轻。
5例患者跛行距离由不足50 m提高到大于100 m，10例伴有溃疡的患者，溃疡愈合或面积逐渐减小。
11例踝肱指数增加大于0.1，其他患者踝肱指数变化不明显，1例症状无明显改善。
4例足趾坏疽患者中，1例症状明显缓解，静息痛消失，行坏疽足趾切除，愈合良好。2 例疼痛消失，睡眠改善，坏疽组织有脱落迹象，未进一步处理。
1例于膝下截肢。

2.2 术后病情反复情况

11例于术后1月症状出现反复。
4例表现为跛行距离恢复至术前水平。
3例术后有静息痛再次出现。
3例表现为晚间患肢麻木、怕冷，但无明显疼痛。
1例患者于术后2月行膝下截肢手术，术中发现残端血运丰富，术后创面愈合良好。

2.3 应用自身配对资料的t检验，比较60例患者移植前与移植后缺血情况临床评分

术前所有患者缺血情况临床评分的平均值为11±3.97。
术后7 d 所有患者临床评分的平均值为7.14±3.07。
术后2周所有患者临床评分的平均值为5.71±2.43。
术后1个月所有患者临床评分的平均值为6.43±4.03。
术后3个月所有患者临床评分的平均值为5.17±1.72。
术后5~6个月所有患者临床评分的平均值为5.75±1.70。
移植后最低临床评分低于手术前临床评分（P < 0.05），差异有统计学意义。

2.4 术后不良反应及并发症 除1例于术后3月出现浅静脉曲张外，未发现明显不良反应及并发症。
2.5 可能影响结果的因素分析 此外由于每个患者的骨髓情况不同，细胞提取情况不同，因此在配置注射液时单个和细胞浓度不同。将 60例患者根据注射细胞浓度分为高浓度组（总量≥1×107）45例和低浓度组（<1×107个）15发例，采取患者和评估人员双盲的评估方法，将两组间移植前后评分的差值进行比较，发现高浓度组移植前后临床评分差值大于低浓度组差值（P < 0.05），差异有统计学意义。但由于浓度由患者骨髓提取的情况所决定，因此可能因骨髓情况产生样本偏倚，并且由于2组的人数不同，在统计时不能完全利用数据的全部信息。

3 讨论

本组资料发现，自体骨髓干细胞移植治疗动脉缺血在短期内是有效的，治疗后3~5 d各项指标均有一个明显的改善，所有患者术后7 d时的临床评分均明显下降， 1月后有所反复，3~4月后各项指标趋于稳定。作者认为治疗后第1天既表现出的肢体疼痛缓解和冷感减轻可能是移植的干细胞对局部组织的早期反应所致，因为治疗后早期不可能有真正的毛细血管新生。一般干细胞的分化、增殖、最后形成新生血管大约需要4周左右时间，所以1月后的疗效评定才具有临床意义。
一般来讲，为保证截肢创面愈合，截肢平面常选择在坏疽部位的近侧关节上方，即若踝关节处皮肤坏疽，截肢平面应选择在膝上。但是应用自体骨髓干细胞移植的方法治疗后的截肢者的截肢平面均较常规预测的截肢平面为低[13],使大多数患者达到了降低截肢平面或避免截肢的目的。本组截肢病例，行膝下截肢且残端血运丰富，术后创面愈合良好，这可能与干细胞移植治疗有关。本组1例患者术后3月出现浅静脉曲张、增多，可能与干细胞移植治疗致血管新生有关，但亦可能干细胞移植治疗后组织血供增加，静脉充盈，使原来未显示的曲张浅静脉得以显露，尽管患者否认浅静脉曲张病史。浅静脉曲张患者的出现，使得我们应当更严密、更长期的观察干细胞移植的并发症。
自体干细胞移植治疗动脉缺血在理论上是成立的，大量的基础实验和临床研究表明，干细胞移植治疗动脉缺血性疾病包括肢体缺血的疗效是肯定的[14-18]，不仅肢体缺血性疾病，对于一般意义上的全身由于脉管炎症引起的缺血都有明确疗效[19-20]。但对于能够应用传统的手术或介入手段解决病变的患者，仍不应作为首选。
综合本临床观察结果提示，自体骨髓干细胞移植对肢体疼痛、冷感、麻木、疗效确切，踝肱指数增加，对糖尿病足溃疡愈合及截趾创面愈合有促进作用，能降低截肢平面，减少截肢（趾）率、再截肢率。另外还具有创伤小，适用于合并心脑血管疾病的无法接受常规手术或介入治疗的高龄患者。另外自体移植，不存在排异问题。操作简单、设备要求不高，易于推广。
尽管自体骨髓干细胞移植仍处于探索阶段，但在早期的实验及临床治疗中已经显现出其优越性，且未发现明显副作用。相信随着研究的深入，自体骨髓干细胞移植将会有进一步的发展，将为重症下肢动脉缺血性疾病治疗开辟新的天地。

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