Inhibitory effects of bone marrow mesenchymal stem cells combined with leflunomide on the proliferation of mouse lymphocytes
Qiu Ying-ying1, Li Jing1, Yin Yu-jun1, Tang Yu1, You Hai-yan1, Zhu Wei2, Jiao Zhi-jun1

Abstract
BACKGROUND: Leflunomide is a new immunodepressant. Its active product A771726 can inhibit the activities of dihydroorate dehydrogenase and the proliferation of activated lymphocytes in vitro.
OBJECTIVE: To investigate the inhibitory effects of bone mesenchymal stem cells (BMSCs) combined with leflunomide (LEF) on lymphocyte proliferation in mice in vitro.
DESIGN, TIME AND SETTING: The randomized control cytology immunoregulation experiment was performed at the Central Laboratory, Affiliated Hospital of Jiangsu University from June to November 2007.
MATERIALS: Forty-two BALB/c female mice aged 5-6 weeks were used in this study. Eighteen of them were used to prepare BMSCs. At the third passage, BMSCs were used in this study. Twenty-four of them were used to prepare splenic lymphocytes. LEF activated metabolic product A771726 was presented by Doctor Xiao from Cinkate, USA. Non-specific mitogen ConA and lipopolysaccharide were obtained from Sigma, USA.
METHODS：T and B lymphocyte suspension was divided into BMSCs group, LEF group, BMSCs+LEF group. The concentration of BMSCs was 2×108 L-1. Number of BMSCs: number of lymphocytes = 1: 30. The final concentration of LEF was 15 mg/L. In addition, 5 mg/L non-specific mitogen ConA and 25 mg/L lipopolysaccharide were used in each group.
MAIN OUTCOME MEASURES: MTT was used to detect the inhibitory rate of T and B lymphocyte proliferation. Activation of T and B lymphocytes was measured by surface markers. Flow cytometry was applied to determine the apoptosis rate of T lymphocytes. Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) was employed to examine interferonγ, interleukin 10 and interleukin 4 mRNA expression of T lymphocytes.
RESULTS: Compared with the positive control, the inhibitory rate of T lymphocyte proliferation was significantly increased in the BMSCs group, LEF group, BMSCs+LEF group (P < 0.05), and the changes was greater in the BMSCs+LEF group compared with that in the BMSCs group and LEF group (P < 0.05). The inhibitory rate of B lymphocyte proliferation was similar to above-mentioned results. Compared with the positive control, CD3+CD69+ and CD3+CD28+ expression of T lymphocytes and CD19+CD69+，CD19+CD86+ expression of B lymphocytes were similar in each group. The apoptosis rates of T lymphocytes in the BMSCs group and BMSCs+LEF group significantly reduced (P < 0.05). Compared with the positive control, BMSCs combined with LEF promoted the mRNA expression of interferonγand inhibited interleukin 10 levels of T lymphocytes (P < 0.05), but had no effects on interleukin-4 mRNA expression. Changes in interferon γ and interleukin 10 were significantly greater compared with the BMSCs group and LEF group (P < 0.05).
CONCLUSION: BMSCs combined with LEF in vitro show some collaboratively inhibitory effects on the proliferation of T and B-lymphocytes, interleukin-10 mRNA expression and apoptosis of T lymphocytes, but promote the mRNA expression of interferonγ, and had no effects on activation of T and B lymphocytes or mRNA expression of interleukin-4.

Qiu YY, Li J, Yin YJ, Tang Y, You HY, Zhu W, Jiao ZJ.Inhibitory effects of bone marrow mesenchymal stem cells combined with leflunomide on the proliferation of mouse lymphocytes.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(29):5658-5662 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-29/29k-5658(ps).pdf]

摘要
背景：来氟米特是一种新型的免疫抑制剂，其活性产物A771726在体外能抑制增生分裂细胞的二氢乳清酸脱氢酶和酩氨酸激酶的活性，抑制活化淋巴细胞的增殖。
目的：观察骨髓间充质干细胞在体外联合来氟米特对小鼠淋巴细胞增殖的抑制效应。
设计、时间及地点：随机对照，细胞学免疫调控实验，于2007-06/11在江苏大学附属医院中心实验室完成。
材料：清洁级5~6周龄BALB/c雌性小鼠42只，18只分离制备骨髓间充质干细胞，传至第3代用于实验；24只用于制备脾淋巴细胞。来氟米特活性代谢产物A771726由美国欣凯公司肖飞博士惠赠。非特异性有丝分裂原ConA、脂多糖为sigma公司产品。
方法：将制备的T、B淋巴细胞悬液分为骨髓间充质干细胞组、来氟米特组、骨髓间充质干细胞+来氟米特组，其中骨髓间充质干细胞浓度为2×108 L-1，骨髓间充质干细胞数∶淋巴细胞数＝1∶30，来氟米特终浓度为15 mg/L，此外各组加入5 mg/L非特异性有丝分裂原ConA或25 mg/L脂多糖。
主要观察指标：MTT法检测T、B淋巴细胞增殖抑制率。通过表面标志检测T、B淋巴细胞活化情况。流式细胞仪测定T淋巴细胞凋亡程度。RT-PCR法检测T淋巴细胞干扰素γ、白细胞介素10、白细胞介素4 mRNA表达水平。
结果：与阳性对照比较，骨髓间充质干细胞组、来氟米特组、骨髓间充质干细胞+来氟米特组T淋巴细胞体外增殖抑制率均明显提高（P < 0.05），且后者变化幅度大于前两组（P < 0.05）；各组B淋巴细胞增殖抑制情况与上述结果相似。与阳性对照比较，各组T淋巴细胞CD3+CD69+、CD3+CD28+的表达以及B淋巴细胞CD19+CD69+、CD19+CD86+的表达均基本相似；骨髓间充质干细胞组、骨髓间充质干细胞+来氟米特组T淋巴细胞凋亡率明显下降（P < 0.05）。与阳性对照比较，骨髓间充质干细胞+来氟米特组可使T淋巴细胞干扰素γmRNA提高、白细胞介素10 mRNA降低（P < 0.05），白细胞介素4 mRNA表达无变化，且其前2项指标变化幅度明显大于骨髓间充质干细胞组、来氟米特组（P < 0.05）。
结论：骨髓间充质干细胞与来氟米特体外联合，能抑制T淋巴细胞凋亡，可协同抑制T、B淋巴细胞增殖、白细胞介素10 mRNA表达，协同促进干扰素γmRNA的表达，对T、B淋巴细胞活化、白细胞介素4 mRNA表达无影响。
关键词：骨髓间充质干细胞；来氟米特；淋巴细胞；免疫调节

裘影影，李晶，殷玉俊，汤郁，尤海燕，朱伟，焦志军.骨髓间充质干细胞联合来氟米特对小鼠淋巴细胞增殖的抑制[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(29):5658-5662 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-29/29k-5658(ps).pdf]

>>本文导读<<

课题背景：课题受江苏省社会发展项目基金资助，编号BS2005043，课题名称“MSC治疗系统性红斑狼疮的免免疫调节机制研究”。经过初步研究，发现骨髓间充质干细胞对BALB/c小鼠、狼疮鼠模型（NZB/NZW F1代）和系统性红斑狼疮患者T淋巴细胞、B淋巴细胞和树突状细胞均有免疫调节作用，骨髓间充质干细胞与某些免疫抑制剂先后使用或同时使用，可能使二者起到协同的作用。

应用要点：骨髓间充质干细胞对小鼠淋巴细胞的抑制效应已有报告，但课题组认为单独使用骨髓间充质干细胞治疗自身免疫病（例如系统性红斑狼疮）取得成功的可能性要小于骨髓间充质干细胞与免疫抑制剂（例如来氟米特、环磷酰胺等）联合。所以，实验首先采用骨髓间充质干细胞与来氟米特联合，观察其对BALB/c小鼠的免疫抑制效应，结果发现二者可以协同抑制小鼠T、B淋巴细胞增殖。

偏倚或不足：虽然骨髓间充质干细胞与来氟米特联合使用，可能使免疫抑制效应增强，但二者的作用机制有所不同，用相同指标分析二者的协同作用有较大的局限性。如何设计更为合理的实验方案是一个难点，值得进一步探讨。

0 引言

骨髓间充质干细胞除具有多向分化潜能及支持造血功能外，一些体外实验和动物模型证实其能够成功地移植入具有免疫能力的同种异基因或异种宿主体内，并对机体产生免疫调节作用[1-2]。体外骨髓间充质干细胞可抑制T、B、NK细胞的功能[3-7]，已发现骨髓间充质干细胞通过分泌特殊的细胞因子、吲哚胺2，3-二氧化酶抑制途径或细胞间的直接接触等[8-10]，来影响T淋巴细胞的免疫功能，但其中的作用途径和机制尚不清楚。
来氟米特是一种新型免疫抑制剂，口服后95%以上在胃肠道和肝脏内分解代谢，形成活性产物A771726。它最初用于类风湿性关节炎的治疗，现已用于治疗系统性红斑狼疮，均取得较好效果[11]。来氟米特与其他免疫抑制剂相比，具有抑制嘧啶合成、抑制蛋白酪氨酸激酶活性等多环节的优点[12-13]。
Kim等[14]在体外证实骨髓间充质干细胞可以抑制混合淋巴细胞反应中T淋巴细胞增殖，当骨髓间充质干细胞与T淋巴细胞的数量比为1∶1时，对T淋巴细胞增殖活性的抑制率约为65%。Corcione等[15]报道，当骨髓间充质干细胞与B淋巴细胞的数量比为1∶2时，骨髓间充质干细胞对B淋巴细胞增殖活性的抑制率约为50%。实验试图通过观察骨髓间充质干细胞联合来氟米特对异体淋巴细胞增殖、活化、凋亡、细胞因子表达的影响，探讨在体外二者联合对淋巴细胞的协同免疫调控作用。

1 材料和方法

设计：随机对照，细胞学免疫调控实验。
时间及地点：于2007-06/11在江苏大学附属医院中心实验室完成。
材料：清洁级5~6周龄BALB/c雌性小鼠42只，体质量（18.0±1.5）g，购自扬州大学比较医学中心，许可证号：SCXK（苏）2002-0009，18只用于制备骨髓间充质干细胞，24只用于制备脾淋巴细胞，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。来氟米特活性代谢产物A771726由美国欣凯公司肖飞博士惠赠。
实验方法：
小鼠骨髓间充质干细胞的分离和培养：直接贴壁筛选法分离培养骨髓间充质干细胞。BALB/c小鼠摘除单侧眼球失血致死后，无菌分离小鼠后肢的股骨及胫骨，以完全培养液（含10%FBS的低糖-DMEM、100 U/mL链霉素和 100 U/mL青霉素）冲出骨髓，接种于25 cm2培养瓶，37 ℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度条件下培养48 h后，弃除悬浮细胞，加入新鲜培养液继续培养，每隔二三天半量换液1次。贴壁细胞为梭形或多边形成纤维细胞样形态，并呈明显的克隆样生长，至80%~90%融合时，以含0.02% EDTA的0.25%胰蛋白酶消化1.0~2.0 min，传代培养，传代细胞接种密度为4×104 /cm2，取传至第3代的细胞用于实验。
骨髓间充质干细胞表面标记流式细胞仪检测：取第3代（P3）骨髓间充质干细胞，分别与抗小鼠CD34、CD45、CD105单克隆抗体及相应的同型对照抗体共孵育20 min，PBS洗涤后，经流式细胞仪检测。
小鼠淋巴细胞的制备：BALB/c小鼠摘除单侧眼球失血致死后，无菌取出脾脏，研磨过尼龙网，分散的淋巴细胞透过尼龙网进入EZ-Sep? Mouse 1X 淋巴细胞分离液中，800 g离心30 min，吸出淋巴细胞层，用培养液洗涤2次后收集淋巴细胞，浓度调整至6×109 L-1。

骨髓间充质干细胞联合来氟米特对T淋巴细胞体外增殖的影响：将P3代骨髓间充质干细胞调整浓度至2×108 L-1，按100 μL/孔加入96孔培养板中，待细胞完全贴壁后经直线加速器20 Gy照射后吸弃上清。将制备的T淋巴细胞悬液按100 μL/孔加入96孔培养板中，分为骨髓间充质干细胞组、来氟米特组、骨髓间充质干细胞+来氟米特组，均加入5 mg/L非特异性有丝分裂原ConA，来氟米特终浓度为15 mg/L，骨髓间充质干细胞数：淋巴细胞数＝1∶30；以淋巴细胞+ConA作为阳性对照组，单纯淋巴细胞作为阴性对照组。每组3个复孔，体系中不足量以培养液补足。培养板置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度条件下培养72 h，在培养结束前4 h向各孔中加入5 g/L MTT， 20 μL/孔，培养结束后，250 g离心10 min，弃上清，向各孔中加入DMSO，150 μL/孔，室温静置10 min，待结晶沉淀完全融解后，以紫外可见光扫描酶标仪检测A570值。增殖抑制率（%）＝（1－实验组A570/阳性对照组A570）×100%。
骨髓间充质干细胞联合来氟米特对B淋巴细胞体外增殖的影响：具体方法、分组同T淋巴细胞体外增殖实验，仅以终浓度为25 mg/L的脂多糖替换ConA。
骨髓间充质干细胞联合来氟米特对T淋巴细胞CD69、CD28表达的影响：将T淋巴细胞按1 mL/孔加入经直线加速器20 Gy预处理的24孔培养板中，每孔含骨髓间充质干细胞2×105个，来氟米特终浓度为15 mg/L，并同时加入 5 mg/L ConA。分组同T淋巴细胞体外增殖实验，各组分别培养24 h、72 h。收集培养24 h的各组T淋巴细胞，与抗CD3、CD69抗体及相应的同型对照抗体反应；收集培养72 h的各组T淋巴细胞，与抗CD3、CD28抗体及相应的同型对照抗体反应，应用流式细胞仪检测，用cellQuest软件分析CD3+CD69+、CD3+CD28+表达的情况。
骨髓间充质干细胞联合来氟米特对B淋巴细胞CD69、CD86表达的影响：分组同T淋巴细胞CD69及CD28表达检测实验，仅以终浓度为25 mg/L的脂多糖替换ConA。收集培养24 h的各组B淋巴细胞，与抗CD19、CD69抗体反应；收集培养72 h的各组B淋巴细胞，与抗CD19、CD86抗体反应，应用流式细胞仪检测，用cellQuest软件分析CD19+CD69+、CD19+CD86+表达的情况。
骨髓间充质干细胞联合来氟米特对活化的T淋巴细胞早期凋亡的影响：分组及方法同T淋巴细胞CD69、CD28表达检测实验，收集培养24 h的各组T淋巴细胞，按ANNEXIN V-FITC凋亡试剂盒说明书严格操作，流式细胞仪检测各组T淋巴细胞的凋亡程度。
骨髓间充质干细胞联合来氟米特对由ConA诱导的T淋巴细胞干扰素γ、白细胞介素10、白细胞介素4 mRNA表达的影响：分组及方法同T淋巴细胞CD69、CD28表达检测实验，收集各组培养72 h的T淋巴细胞，用Trizol抽提RNA，并反转录获得cDNA模板。取cDNA为模板，按试剂盒要求建立PCR反应体系(总体积 20 μL)，在Roche Lightcycler PCR仪上进行扩增。
设计、实施、评估者：设计为第一、二、七作者，实施为第一、三、四、五、六作者，评估为第二作者，均经过系统培训，未使用盲法评估。
统计学分析：由第一作者采用SPSS 10.0软件进行处理，数据以x(_)±s表示，百分率数据经平方根反正弦转换，不同组间比较行两因素两水平协因方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定 BALB/c小鼠骨髓间充质干细胞培养3~4 d可见单个分散存在或几个细胞聚集的克隆，贴壁的细胞增殖迅速。7~10 d达80%融合，P3代细胞形态高度均一，呈长梭形。流式细胞仪检测P3代BALB/c小鼠骨髓间充质干细胞，CD105阳性率为（97.77±1.99）%，CD34、CD45均呈阴性，传3代以后的骨髓间充质干细胞纯度达到95%以上。
2.2 骨髓间充质干细胞联合来氟米特对T淋巴细胞体外增殖的影响 见图1。

2.3 骨髓间充质干细胞联合来氟米特对B淋巴细胞体外增殖的影响 见图2。

2.4 骨髓间充质干细胞联合来氟米特对淋巴细胞表面标志的影响 与阳性对照组比较，骨髓间充质干细胞组、来氟米特组、骨髓间充质干细胞+来氟米特组T淋巴细胞CD3+CD69+、CD3+CD28+的表达以及B淋巴细胞CD19+CD69+、CD19+CD86+的表达均基本相似（P > 0.05），见表1。

2.5 骨髓间充质干细胞联合来氟米特对由ConA诱导的T淋巴细胞早期凋亡的影响 阳性对照组、骨髓间充质干细胞组、来氟米特组、骨髓间充质干细胞+来氟米特组的T淋巴细胞凋亡率分别为（12.22±2.61）%，（5.41±2.56）%，（14.76±2.05）%，（7.72±1.53）%。与阳性对照组比较，骨髓间充质干细胞组、骨髓间充质干细胞+来氟米特组T淋巴细胞凋亡率均明显下降（P < 0.05），来氟米特组无明显变化（P > 0.05），见图3。

2.6 骨髓间充质干细胞联合来氟米特对由ConA诱导的T淋巴细胞干扰素γ、白细胞介素10、白细胞介素4 mRNA表达的影响

干扰素γ：
骨髓间充质干细胞组、来氟米特组、骨髓间充质干细胞+来氟米特组T淋巴细胞干扰素γ mRNA的相对表达量分别为2.456±0.276，2.848±0.460，6.180±0.928。
与阳性对照组比较，骨髓间充质干细胞组、来氟米特组、骨髓间充质干细胞+来氟米特组T淋巴细胞干扰素γ mRNA的相对表达量均明显提高（P < 0.05），且后者提高幅度明显大于前两组（P < 0.05）。

白细胞介素10：
骨髓间充质干细胞组、来氟米特组、骨髓间充质干细胞+来氟米特组T淋巴细胞白细胞介素10 mRNA的相对表达量分别为0.777±0.065，0.713±0.148，0.198±0.079。
与阳性对照组比较，骨髓间充质干细胞组、来氟米特组、骨髓间充质干细胞+来氟米特组T淋巴细胞白细胞介素10 mRNA的相对表达量均明显下降（P < 0.05），且后者降低幅度明显大于前两组（P < 0.05）。

白细胞介素4：
骨髓间充质干细胞组、来氟米特组、骨髓间充质干细胞+来氟米特组T淋巴细胞白细胞介素4 mRNA的相对表达量分别为0.876±0.172，7.573±1.293，0.979±0.412。
与阳性对照组比较，骨髓间充质干细胞组、骨髓间充质干细胞+来氟米特组的白细胞介素4 mRNA相对表达量无明显变化（P > 0.05）；来氟米特组则明显升高（P < 0.05）。

3 讨论

本实验中，在分别以ConA、脂多糖为抗原刺激因素的条件下，骨髓间充质干细胞与淋巴细胞的数量比等于1:30时，骨髓间充质干细胞对T、B淋巴细胞增殖活性的抑制率分别为30.14%、27.91%，但在骨髓间充质干细胞与淋巴细胞的数量比值不变的条件下，骨髓间充质干细胞联合来氟米特对T、B淋巴细胞的增殖抑制率分别高达70.82%、59.95%，因此认为骨髓间充质干细胞与来氟米特联合可以协同抑制T、B淋巴细胞的增殖，可以在骨髓间充质干细胞数量较少的条件下而达到较高的对T、B淋巴细胞增殖的抑制率。
实验发现BALB/c小鼠的骨髓间充质干细胞和来氟米特对分别由ConA、脂多糖诱导的T、B细胞的早期活化指标CD69以及T、B细胞的晚期活化指标CD28、CD86均无明显的影响，因此认为骨髓间充质干细胞抑制T、B细胞增殖的作用与T、B细胞表面标记CD69/CD28、CD69/CD86的表达可能无相关性。有学者认为骨髓间充质干细胞对T细胞的抗增殖作用与使活化的T细胞停留在细胞周期G1期，导致活化T细胞的分化无能有关；骨髓间充质干细胞对B细胞增殖的抑制作用与使B细胞停留在细胞周期的G0/G1期、下调B细胞CXCR4、CXCR5、CCR7的表达有关[14-16]。
在骨髓间充质干细胞对由ConA诱导的T淋巴细胞早期凋亡的实验中，发现骨髓间充质干细胞可以抑制T淋巴细胞的早期凋亡，而小剂量的来氟米特对T淋巴细胞早期凋亡无明显影响，两者联合应用总的效应是使T淋巴细胞的早期凋亡下降。目前骨髓间充质干细胞抑制T淋巴细胞凋亡的机制不明。最近Benvenuto等[17]认为骨髓间充质干细胞可以通过下调T细胞表面的Fas受体和配体、抑制有关细胞死亡的内源性蛋白的途径，减少T细胞的活化诱导的细胞死亡和减少由Fas受体介导的与凋亡相关的CD95表达，来抑制T淋巴细胞的凋亡。而Xu等[18]认为骨髓间充质干细胞可以通过分泌白细胞介素6的途径来抑制淋巴细胞的凋亡。
本实验中单独骨髓间充质干细胞处理组和骨髓间充质干细胞联合来氟米特组对由ConA诱导的T淋巴细胞白细胞介素4 mRNA的表达均无明显影响。而单独骨髓间充质干细胞处理组和单独来氟米特处理组对由ConA诱导的T淋巴细胞白细胞介素10 mRNA的表达均有抑制作用、对干扰素γ mRNA的表达均有促进作用，二者联用可以协同抑制白细胞介素10 mRNA的表达，协同促进干扰素γ mRNA的表达。可能使T细胞向Th1细胞方向偏移，这可能有利于Th2细胞占优势的自身免疫性疾病。Aggarwal等[19]将人骨髓间充质干细胞与Th1细胞共培养，发现骨髓间充质干细胞可以降低Th1细胞分泌干扰素γ。而李慧等[20]将BALB/c小鼠骨髓间充质干细胞与BALB/c小鼠CD3+T淋巴细胞共培养时则发现T细胞内干扰素γ增加。有学者[21]报道骨髓间充质干细胞可以促进经PHA诱导的外周血CD4+T细胞分泌白细胞介素10。而Rasmusson等[22]则发现在混合淋巴细胞反应中，骨髓间充质干细胞促进白细胞介素10的分泌，而在加入PHA的T细胞中，骨髓间充质干细胞对白细胞介素10水平无影响。因此推断骨髓间充质干细胞联合来氟米特对干扰素γ、白细胞介素10的影响可能与T细胞来源及其接受不同的刺激源有关。
总之，骨髓间充质干细胞联合来氟米特可以协同抑制T、B淋巴细胞的增殖及白细胞介素10的表达、协同促进干扰素γ的表达，对T、B淋巴细胞的活化、T淋巴细胞白细胞介素4 mRNA的表达无明显影响，但确切的免疫机制还有待进一步分析。

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