Immune tolerance of transplants induced by the combination of methoxy polyethylene glycol and anti-OX40L monoclonal antibody
Feng Sa-ran, Huang Yi-hong, Du Bing, Pan Xiu-ying, Xu Kai-lin

Abstract
BACKGROUND: Methoxy-polyethylene glycol (mPEG) can have a stereospecific blockade, which can shield surface antigen of T lymphocytes. OX40 and its ligand OX40L is a pair of important costimulator. To block the signal pathway can induce T cells in an inexcitable incapacitation, resulting in immune tolerance.
OBJECTIVE: To investigate the effect of combined usage of methoxy-polyethylene glycol-succinimidyl-propionic acid ester (mPEG-SPA) and anti-OX40L monoclonal antibody (McAb) on proliferation, phenotypes of T lymphocytes and secretion of cytokines in vitro to obtain an ideal immune tolerance.
DESIGN, TIME AND SETTING: The in vitro control experiment was performed at the Department of Hematology, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College from December 2006 to June 2007.
MATERIALS: Totally 12 clean inbred line C57BL/6(H-2b) male and BALB/c(H-2d) female adult mice each were selected. Prepared splenic lymphocytes were used as responder cells and stimulator cells. mPEG-SPA and rat anti-mouse OX40L monoclonal antibody were respectively purchased from Kaizheng, China and eBioscience, USA.
METHODS: Responder cells were regulated to a density of 4×109 L-1, and modified by 3, 6, 12, 15, 18 g/L mPEG-SPA for 1 hour. Blank control cells were treated with an equal volume of phosphate buffer saline. In addition, responder cells were given 15 g/L mPEG-SPA for 1, 24, 48, 96 and 120 hours. Expression of CD3+ T cells was detected by flow cytometer. In one-way mixed lymphocyte culture, cells in the cell control group received stimulator cells and responder cells. Cells in the anti-OX40L McAb group underwent 10 mg/L anti-OX40L McAb. Cells in the mPEG-SPA group were subjected to 15 g/L mPEG-SPA. Cells in the combination group were treated with anti-OX40L McAb and mPEG-SPA.
MAIN OUTCOME MEASURES: CD3 expression; Outcome of mPEG-SPA screening splenic lymphocytes; Proliferation and phenotype of lymphocytes; Cytokine content in supernatant.
RESULTS: After modification of mPEG-SPA, expression of CD3+ T cells significantly reduced compared with the blank control group, especially cells treated with 15, 18 g/L mPEG-SPA (P < 0.01). No significant difference in expression of CD3+ T cells was detected after treatment of 15 g/L mPEG-SPA at different time points (P > 0.05). Compared with the cell control group, the inhibitory rate of lymphocyte proliferation significantly increased in the anti-OX40L McAb group, mPEG-SPA group and combination group, especially in the combination group (P < 0.05). CD4+CD25+/CD8+CD25+ ratio did not significantly change in the anti-OX40L McAb group and mPEG-SPA group (P > 0.05), but decreased in the combination group (P < 0.05). Interferon-γ contents were significantly lower in the anti-OX40L McAb group, mPEG-SPA group and combination group than in the cell control group, and the significant reduction was detected in the combination group (P < 0.05). Interleukin-4 levels were significantly higher in the combination group than in the cell control group (P < 0.05).
CONCLUSION: mPEG can significantly camouflage surface antigen of T lymphocytes, and the effect of camouflage is durable. The combined use of mPEG-SPA and anti-OX40L McAb can block T-cell activation antigen and co-stimulatory pathway, regulate the differentiation of T cells and induce the immune shift of Th0 cells towards Th2 cells.

Feng SR, Huang YH, Du B, Pan XY, Xu KL.Immune tolerance of transplants induced by the combination of methoxy polyethylene glycol and anti-OX40L monoclonal antibody.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(29):5663-5667
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-29/29k-5663(ps).pdf]

摘要
背景：甲氧基聚乙二醇可在淋巴细胞表面形成空间位阻而遮蔽T细胞表面抗原；OX40及其配体OX40L是一对重要的协同刺激信号分子，阻断该信号通路可使T细胞处于无反应性的失能状态，诱导免疫耐受。
目的：为获得更为理想的免疫耐受状态，检测甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺丙酸酸酯（methoxy-polyethylene glycol-succinimidyl-propionic acid ester，mPEG-SPA）化学修饰联合抗OX40L单抗对移植物T淋巴细胞增殖、表型及分泌细胞因子的影响。
设计、时间及地点：对比观察移植物免疫耐受体外实验，于2006-12/2007-06在徐州医学院附属医院血液病研究室完成。
材料：清洁级近交系C57BL/6(H-2b)雄性和BALB/c(H-2d)雌性成年小鼠各12只，制备的脾淋巴细胞分别作为反应细胞和刺激细胞。mPEG-SPA为北京凯正公司产品，大鼠抗小鼠OX40L单抗为eBioscience公司产品。
方法：将反应细胞密度调整为4×109 L-1，分别加入3，6，12，15，18 g/L mPEG-SPA修饰1 h，以加入相同体积的磷酸盐缓冲液作空白对照；另向反应细胞中加入15g/L mPEG-SPA分别修饰1 h，24 h，48 h，96 h，120 h，流式细胞仪检测脾淋巴细胞表面CD3分子的表达。单向混合淋巴细胞培养分4组：细胞对照组，单纯加入刺激细胞+反应细胞；抗OX40L单抗组，向两种细胞中加入10 mg/L抗OX40L单抗；mPEG-SPA组，向两种细胞中加入15 g/L mPEG-SPA；联合组，向两种细胞中加入抗OX40L单抗和mPEG-SPA。
主要观察指标：CD3分子的表达水平，其反映mPEG-SPA遮蔽脾淋巴细胞的效果。淋巴细胞增殖情况与表型分析。培养上清细胞因子含量。
结果：①不同浓度mPEG-SPA修饰后淋巴细胞表面CD3分子的表达均明显低于空白对照，且15，18 g/L mPEG-SPA降低幅度尤为明显（P < 0.05）；15 g/L mPEG-SPA修饰不同时间后CD3分子的表达无变化（F =1.715，P > 0.05）。与细胞对照组比较，抗OX40L单抗组、mPEG-SPA组、联合组对淋巴细胞的增殖抑制率均明显升高，联合组抑制效果最强（P < 0.01）；抗OX40L单抗组、mPEG-SPA组T细胞表型CD4+CD25+/CD8+CD25+比值无明显变化（P > 0.05），联合组明显降低（P < 0.05）。抗OX40L单抗组、mPEG-SPA组、联合组γ-干扰素含量均明显低于细胞对照组，且联合组降低幅度更为显著（P < 0.05）；联合组白细胞介素4含量明显高于细胞对照组（P < 0.05）。
结论：甲氧基聚乙二醇衍生物可明显遮蔽淋巴细胞表面抗原，且对抗原的遮蔽作用较持久；其与抗OX40L单抗联合应用能够阻断T细胞激活的抗原和共刺激双信号通路，抑制T细胞的增殖活性，使Th0类细胞向Th2类细胞偏离。
关键词：甲氧基聚乙二醇；化学修饰；抗原；OX40/OX40L；免疫耐受

冯洒然，黄一虹，杜冰，潘秀英，徐开林.甲氧基聚乙二醇衍生物与抗OX40L单抗双诱导移植物免疫耐受[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(29):5663-5667
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-29/29k-5663(ps).pdf]

>>本文导读<<

课题背景：课题受江苏省高校“青蓝工程”优秀青年骨干教师资助项目（sjs200512）资助，基于化学修饰异基因供体移植物遮蔽淋巴细胞表面抗原阻断T细胞活化的研究尚处于早期阶段，课题选用不同浓度修饰剂及修饰后不同时间点CD3分子的表达水平，以探讨最佳修饰效果及对遮蔽抗原的持久性。课题组认为阻断OX40/OX40L共刺激信号抑制T细胞的活化是一条独特的新途径，通过对移植物化学修饰及与抗OX40L单抗联合应用阻断T细胞活化的双信号通路，发现二者联用对抑制T细胞的活化、增殖、细胞因子分泌有协同和互补作用，并使Th0细胞向Th2方向偏移从而诱导移植物免疫耐受。

重要的概念：细胞表面物理化学修饰：使用化学材料聚乙二醇、海藻酸钠、壳聚糖、多聚赖氨酸等，发挥化学、物理、生物学科交叉的优势，在移植物细胞表面进行物理化学反应，修饰和改造细胞表面抗原分子，有望为克服移植排斥反应开辟新的途径。

同行评价：对血细胞进行表面化学修饰以遮蔽表面抗原阻断免疫反应的研究已见报告，也用于干细胞移植的移植物抗宿主病防治。实验结果证实mPEG-SPA联合抗OX40L单抗进行淋巴细胞修饰效果优于单独使用，是很有价值的发现，将二者联合应用阻断T细胞活化的双信号途径将诱导更为理想的免疫耐受状态。

0 引言

异基因造血干细胞移植是目前治疗白血病、淋巴瘤等恶性血液病最有效的方法之一，但其主要并发症移植物抗宿主病严重影响了患者的生存率。诱导移植物产生针对受者的免疫耐受是彻底克服移植物抗宿主病的理想措施，该领域已成为移植免疫学研究最富挑战性的课题之一[1]。甲氧基聚乙二醇作为一种化学修饰剂，已被广泛地用来修饰蛋白、酶、药物及制备通用血型等[2-3]，并可在淋巴细胞表面形成空间位阻而遮蔽T细胞表面抗原，从而起到部分去除T细胞的作用[4-5]。
对移植物进行化学修饰，无论在国内或国外都属于较前期的研究。甲氧基聚乙二醇是经FDA批准直接用于人体的化学辅料，具有无毒、无免疫原性、不在体内蓄积、不影响被修饰物的生物学功能等优点[6-7]。甲氧基聚乙二醇可与淋巴细胞表面蛋白质类抗原通过共价键有效地结合，在其表面形成一个柔性的亲水性甲氧基聚乙二醇外壳，有效地遮蔽抗原位点，从而阻断特异性免疫反应的发生[4]。mPEG-SPA是甲氧基聚乙二醇的衍生物，Mr为5 000，其主链中不含有酯键，稳定性较高。
OX40(CD134)是TNF受体超家族成员之一，主要存在于活化CD4+T细胞上，其配体OX40L(CD134L)存在于活化的抗原呈递细胞上，如B淋巴细胞、树突状细胞、巨噬细胞等，活化T细胞亦有少量表达。OX40/OX40L是CD28/B7之外的另一对重要的协同刺激信号分子，主要作用在效应T细胞的晚期应答阶段，能协同增强CD28/B7对CD4+T细胞的应答[8]。阻断OX40/OX40L共刺激信号通路，使T细胞处于无反应性的失能状态，可诱导免疫耐受[9]。为获得更为理想的免疫耐受状态，本实验应用H-2异基因小鼠单向混合淋巴细胞培养体系，体外检测甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺丙酸酸酯(methoxy-polyethylene glycol- succinimidyl-
propionic acid ester，mPEG-SPA）联合抗OX40L单克隆抗体（单抗）对移植物T淋巴细胞增殖以及表型和分泌细胞因子的影响，以期为动物体内实验及临床应用提供实验依据。

1 材料和方法

设计：对比观察移植物免疫耐受体外实验。

时间及地点：于2006-12/2007-06在徐州医学院附属医院血液病研究室完成。
材料：BALB/c(H-2d)雌性成年小鼠12只，C57BL/6(H-2b)雄性成年小鼠12只，均为清洁级近交系小鼠，10周龄，体质量18~20 g，购自徐州医学院动物饲养中心，动物质量合格证号：SCXK（苏2003-0003），实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。mPEG-SPA（北京凯正公司）；淋巴细胞分离液（天津灏洋生物公司）；MTT(Fluca公司)；大鼠抗小鼠OX40L单抗(eBioscience公司)；白细胞介素4、白细胞介素10、γ-干扰素ELISA试剂盒（深圳晶美公司）；PE标记小鼠抗CD3、CD4、CD8单抗、FITC标记小鼠抗CD25单抗（美国BD公司）。
方法：
脾单个核细胞悬液的制备：将供、受体小鼠分别颈椎脱臼处死，体积分数为0.75的乙醇浸泡10 min，在超净工作台内无菌取出小鼠脾置于200目金属过滤网上，匀浆器芯轻轻研磨，用RPMI 1640反复冲洗，分别取网下过滤液体加至含小鼠淋巴细胞分离液的离心管中，1 500 r/min离心15 min，可见离心管中分为4层，取乳白色单个核细胞层，获得单个核细胞，用PBS洗涤2次，分别用含体积分数为0.1小牛血清的RPMI 1640调整细胞浓度为2×1010 L-1，锥虫蓝染色后，细胞存活率>95%，作为C57BL/6和BALB/c小鼠脾淋巴细胞备用。
不同浓度mPEG-SPA修饰脾淋巴细胞后CD3分子的表达：CD3分子的表达水平反映了mPEG-SPA遮蔽脾淋巴细胞的效果。将C57BL/6小鼠脾淋巴细胞用RPMI 1640调成4×109 L-1，在pH 8.0条件下，每4×106个细胞分别加入 30 g/L的mPEG-SPA 100，200，400，500，600 μL，使终浓度分别为3，6，12，15，18 g/L，空白对照加入相同体积的PBS(pH8.0)，4 ℃孵育1 h后，PBS洗涤2次。流式细胞仪检测脾淋巴细胞表面CD3分子的表达。
相同浓度mPEG-SPA修饰脾淋巴细胞后不同时间点CD3分子的表达：用15 g/L的mPEG-SPA在pH 8.0、4 ℃条件下修饰C57BL/6小鼠脾淋巴细胞后，置于24孔培养板(1×106/孔)，在37℃、体积分数为0.05的CO2条件下培养，隔天半量换液，分别在培养1 h，24 h，48 h，72 h，96 h，120 h用流式细胞仪检测脾淋巴细胞表面CD3分子的表达。
单向混合淋巴细胞培养：以C57BL/6小鼠脾淋巴细胞作为反应细胞；以BALB/c小鼠脾淋巴细胞作为刺激细胞，加入终浓度25 mg/L丝裂霉素，在37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱孵育30 min后，洗涤2次，除去残余的丝裂霉素。反应细胞与刺激细胞均接种于24孔细胞培养板中，1×106/孔，行单向混合淋巴细胞培养，设立4组：细胞对照组，单纯加入刺激细胞+反应细胞；抗OX40L单抗组，向两种细胞中加入10 mg/L抗OX40L单抗进行孵育；mPEG-SPA组，向两种细胞中加入15 g/L mPEG-SPA予以修饰；联合组，向两种细胞中加入抗OX40L单抗和mPEG-SPA。每组设6个复孔，每孔加培养液至1 mL，在37 ℃、体积分数为0.05的CO2条件下培养，隔天半量换液，重复2次。
mPEG-SPA与抗OX40L单抗对T细胞增殖活性的影响：各组单向混合淋巴细胞培养体系在37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养6 d，终止培养前4 h加入MTT 15 μL/孔。培养终止后离心弃上清液，加入二甲基亚砜(DMSO)100 μL/孔，振荡10 min左右，置酶标仪按MTT比色法测定波长为492 nm吸光度(A)值，计算增殖抑制率，抑制率(%)=(1－实验组A值)/对照组A值，反映T细胞的增殖活性。
mPEG-SPA与抗OX40L单抗对T细胞表型的影响：取单向混合淋巴细胞培养48 h后的细胞悬液各100 μL，每管加入FITC和PE标记的单抗作双荧光染色，用流式细胞仪检测激活T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+T细胞表达CD25+细胞的水平，计算CD4+CD25+/CD8+CD25+比值。
mPEG-SPA与抗OX40L单抗对T细胞分泌细胞因子的影响：取单向混合淋巴细胞培养24 h后的上清，置于-20℃冻存，用ELISA法检测各组培养上清中γ-干扰素、白细胞介素4、白细胞介素10的浓度，具体操作按酶联免疫吸附（ELISA法）试剂盒说明书的步骤进行。
主要观察指标：①不同浓度mPEG-SPA修饰后脾淋巴细胞CD3分子的表达。②相同浓度mPEG-SPA修饰后不同时间点脾淋巴细胞CD3分子的表达。③mPEG-SPA与抗OX40L单抗对T细胞增殖活性的影响。④mPEG-SPA与抗OX40L单抗对T细胞表型的影响。⑤mPEG-SPA与抗OX40L单抗对T细胞分泌细胞因子的影响。
设计、实施、评估者：实验设计为第一、二作者，实施为第一、三作者，评估为第二、四、五作者，以上人员均经过正规培训，未使用盲法评估。
统计学分析：由第一作者采用GraphPad Prism 4.0进行统计处理，数据均以x(_)±s表示，采用单因素方差分析，多组间两两比较用q检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 不同浓度mPEG-SPA修饰后脾淋巴细胞CD3分子的表达 空白对照脾淋巴细胞表面CD3分子表达率为（54.34±3.06）%，3.0，6.0，12.0，15.0，18.0 g/L mPEG-SPA修饰后淋巴细胞表面CD3分子表达率分别为（26.32± 3.23）%，（20.76±1.86）%，（18.02±1.32）%，（7.73± 0.87）%，（12.63±1.78）%。与空白对照比较，3，6，12，15，18 g/L mPEG-SPA修饰后淋巴细胞表面CD3分子的表达均明显降低（P < 0.01），且15，18 g/L mPEG-SPA降低幅度更为明显（P < 0.05），此两种浓度间比较差异无显著性意义（P > 0.05）。
2.2 相同浓度mPEG-SPA修饰后不同时间点脾淋巴细胞CD3分子的表达 15 g/L mPEG-SPA修饰1 h，24 h，48 h，72 h，96 h，120 h，脾淋巴细胞表面CD3分子的表达无明显变化（F=1.715，P > 0.05），即mPEG-SPA对小鼠脾淋巴细胞表面CD3分子的遮蔽作用并不随培养时间的延长而发生改变。
2.3 mPEG-SPA与抗OX40L单抗对T细胞增殖活性的影响 倒置光学显微镜下培养第3天各组淋巴细胞均明显增殖，形成许多细胞集落，组间无明显差异。第6天与细胞对照组相比，抗OX40L单抗组、mPEG-SPA组、联合组所形成的细胞集落减小。用MTT法检测各组淋巴细胞增殖情况，细胞对照组OD值为0.176±0.018，抗OX40L单抗组、mPEG-SPA组、联合组OD值分别为0.090±0.053，0.093±0.009，0.069±0.005，其增殖抑制率分别为48.86%，47.16%，60.80%，与细胞对照组比较差异有显著性意义 (P < 0.05)，且联合组抑制效果尤为显著(P < 0.01)。说明抗OX40L单抗与mPEG-SPA联合对淋巴细胞增殖抑制作用最强。
2.4 mPEG-SPA与抗OX40L单抗对T细胞表型的影响 与细胞对照组比较，抗OX40L单抗组、mPEG-SPA组、联合组T细胞表型CD4+、CD8+、CD4+CD25+、CD8+CD25+表达均明显降低(P < 0.05)，且联合组降低幅度更为显著 (P < 0.05)；抗OX40L单抗组、mPEG-SPA组CD4+CD25+/CD8+CD25+比值无明显变化(P > 0.05)，联合组明显降低(P < 0.05)，见表1。

2.5 mPEG-SPA与抗OX40L单抗对T细胞分泌细胞因子的影响 与细胞对照组比较，抗OX40L单抗组、mPEG-SPA组、联合组γ-干扰素含量均明显降低（P < 0.05），且联合组降低幅度更为显著（P < 0.05）；OX40L单抗组、mPEG-SPA组白细胞介素4含量无明显变化（P > 0.05），联合组白细胞介素4含量明显升高（P < 0.05）；各组白细胞介素10含量基本相似（P > 0.05）。见表2。

3 讨论

研究发现[4-5，10]，经甲氧基聚乙二醇处理后，T细胞表面的CD分子与抗原呈递细胞表面的CD分子含量明显降低，切断了T细胞与抗原呈递细胞之间相互黏附作用，阻断了T细胞活化的途径。本实验结果表明，mPEG-SPA能明显降低CD3分子的表达水平，遮蔽淋巴细胞表面抗原，从而起到部分去除T细胞的作用，并在4 ℃、pH值8.0、反应时间为60 min条件下，以浓度15，18 g/L修饰效果最佳，其遮蔽效果可达77%以上，且遮蔽作用未随培养时间的延长而发生明显改变，说明mPEG-SPA可以共价键牢固地结合在淋巴细胞表面，因而对抗原的遮蔽作用较持久。因T细胞的活化首先需T细胞受体/CD3复合物识别特异性抗原，故当CD3分子被封闭后，移植物中免疫细胞不能识别宿主细胞上HLA抗原，供者T细胞活化受抑制，增殖能力下降，就可能降低免疫排斥反应，抑制移植物抗宿主病的发生。但由于不是将T细胞表面完全封闭，这种遮蔽作用尚不完全，T细胞活化受多种因素的影响，为了更深入地抑制T细胞对受者组织抗原的反应，需要寻找新的途径和方法以期诱导更为理想的免疫耐受状态。
根据T细胞活化的双信号理论，T细胞有效激活依赖于抗原肽-MHC分子复合物与TCR结合提供的第一信号和共刺激信号，没有抗原信号，T细胞无法激活；只有抗原信号而缺乏共刺激信号，T细胞即使接触抗原也不被活化，而处于无反应性的失能状态，从而导致特异性T细胞产生免疫耐受。OX40/OX40L(CD134/CD134L)通路是T细胞活化的共刺激信号之一，阻断这一信号可能会在免疫耐受诱导中发挥重要作用[11-13]。OX40是效应T细胞活化过程中起重要作用的共刺激分子，主要表达于活化的CD4+ T细胞表
面，CD8+ T细胞表面亦表达[14-15]。OX40/OX40L主要在免疫应答的后期起维持和调节共刺激信号的作用，对T细胞的活化、增殖、细胞因子分泌起重要作用，能打破外周免疫耐受，延长T细胞的存活时间[16-19]。本实验用抗OX40L单抗阻断OX40/OX40L通路可同时降低CD4+、CD8+T细胞及CD4+CD25+和CD8+CD25+的表达，抑制了T细胞的活化，同时Th1类细胞因子γ-干扰素的分泌水平明显降低。已知Thl类细胞因子参与免疫激活过程，介导细胞免疫应答，促进移植物抗宿主病发生，而Th2类细胞因子与免疫耐受的形成有关，减少移植物抗宿主病致病因子的产 生[20]。虽然单用抗OX40L单抗能抑制供者T细胞的活化及Th1类细胞因子分泌，可能减轻移植物抗宿主反应，但Th2类细胞因子IL-4、IL-10的分泌水平升高不明显，说明其诱导免疫耐受效果不理想。而通过mPEG-SPA和抗OX40L单抗二者联合应用，发现具有明显的协同抑制增殖效应，且能够调节细胞激活后的免疫反应方向，使CD4+CD25+和CD8+CD25+ T细胞亚群所占百分率下降，前者下降更明显，CD4+/CD8+比值及CD4+CD25+/CD8+CD25+比值降低。从细胞因子的检测结果看，mPEG-SPA联合抗OX40L单抗降低了Th1类细胞因子γ-干扰素的分泌，提示mPEG-SPA联合抗OX40L单抗可同时作用于CD4+和CD8+ T细胞，且以CD4+ T细胞为主，并作用在CD4+ T细胞激活的晚期阶段，而Th2型细胞因子IL-4的分泌增加，也进一步说明了mPEG-SPA和抗OX40L单抗二者的联合应用，使Th细胞向Th2方向偏移，使得受者抗原激活后的供者CD4+T细胞免疫反应更多地向免疫耐受方向发展。
通过对移植物进行化学修饰遮蔽淋巴细胞表面抗原，及体外应用抗OX40L单抗阻断OX40/OX40L共刺激途径的双调节，诱导了供鼠T细胞对同种异体抗原的低反应状态，将为临床异基因造血干细胞移植重度移植物抗宿主病的预防提供了一条新途径。

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