Influence of human cord blood mononuclear cell transplantation on haematopoiesis and immune function in nude mice
Li Mei-jun1, Li Zhe1, Li Bin1, Wang Liang1, Zhang Shuang1, Su Yu-hong2, Ba Cai-feng2, Min Chang-qing1, Chen Qing-hua2

Abstract:A randomized control animal experiment was performed at the SPF Animal Laboratory of Liaoning Medical University from November 2006 to February 2007. Balb/C nu+ nude mice were radiated with 60Co before transplantation. Fresh human cord blood mononuclear cells were infused into mice in the cord blood transplantation group after irradiation, whereas mice in the control group were infused with saline. Survival rate and survival time in mice of cord blood transplantation group were significantly higher than in the control group. Human CD45+ cell of bone marrow arose in 2 weeks and rapidly increased, and kept a high level in 4-8 weeks, and reached a peak in 8 weeks, then significantly decreased, and could be detected until 12 weeks. Two weeks after transplantation, human specificity Cart-1 genes were found in bone marrow and peripheral blood of mice, and can be detected until 12 weeks. No human DNA was detected in the control group. It is confirmed that cord blood mononuclear cells can be successfully infused into immune deficiency BALB/cnu+ nude mice, which can achieve reconstitution of haematopoiesis and immune system in immune deficiency mice.

Li MJ, Li Z, Li B, Wang L, Zhang S, Su YH, Ba CF, Min CQ, Chen QH.Influence of human cord blood mononuclear cell transplantation on haematopoiesis and immune function in nude mice.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(29):5668-5670(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-29/29k-5668(ps).pdf]

摘要：随机对照动物实验，于2006-11/2007-02在辽宁医学院SPF级动物实验室完成。应用60Co对Balb/C nu+裸鼠进行移植前放射。照射后脐血移植组输入新鲜人脐血单个核细胞，对照组输入生理盐水。结果移植组小鼠存活率及存活时间均明显高于对照组。骨髓中人CD45+细胞2周时就已出现，随后迅速上升，4~8周维持较高水平，8周时达最高，8周后明显下降，至12周时仍可检测出。脐血移植后2周，在小鼠的骨髓、外周血中出现了人类特异性Cart-1基因，并继续存在至12周。对照组未检测到人DNA。证实人脐血干细胞移植能在免疫缺陷BALB/cnu+裸鼠体内成功植入，使免疫缺陷小鼠获得造血和免疫重建。
关键词：脐血；造血干细胞；裸鼠；移植

李梅君，李哲，李斌，王亮，张爽， 苏玉虹，巴彩凤，闵长青，陈清华.人脐血单个核细胞移植对裸鼠造血及免疫功能的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(29):5668-5770
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-29/29k-5668(ps).pdf]

0 引言

自从1988年，Gluckman等[1]报告了世界上首例HLA相合同胞的脐血干细胞移植成功。脐血作为一种新的干细胞来源，日益引起人们的重视，应用前景广阔。目前国内外学者对脐血进行了大量的实验和临床研究。本文采用Balb/C nu+裸鼠，建立脐血干细胞移植的小鼠模型，初步探讨人脐血的造血干/祖细胞在小鼠体内的增殖、分化情况。

1 材料和方法

设计：随机对照动物实验。
单位：辽宁医学院附属第一医院，辽宁医学院。
材料：实验于2006-11/2007-02在辽宁医学院SPF级动物实验室完成。脐血来自自愿捐献的健康足月分娩产妇，排除了HIV、HBV、HCV、CMV和梅毒感染。
设计、实施、评估者：实验的设计、实施及评估由全体作者完成，均接受过培训。
方法：
单个核细胞的制备：自胎儿娩出后断脐，穿刺脐静脉，使脐血进入特制采血袋中，以CPD抗凝待用。采集后4 h内用羟乙基淀粉(HES)沉降法(脐血与羟乙基淀粉按4~6∶1体积混合，待红细胞自然沉降后，放出下层红细胞，经常速离心10 min后，去除上清，得富含单个核细胞的细胞悬液)。分离单个核细胞，行单个核细胞计数。
裸鼠：采用7~8周龄Balb/C nu+裸鼠(中国医大实验动物中心提供)，雌雄不限，体质量18~ 23 g，随机分为2组，脐血移植组17只，对照组5只，于SPF实验室饲养。饲料经60Co照射，饮用水及垫料均经高压消毒无菌处理。对小鼠的所有操作均在无菌层流条件下进行。实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。

移植前放射及移植[2]：脐血移植4 h前，小鼠置于无菌透气的塑料盒中，外罩无菌消毒巾，采用60Co进行移植前放射，照射剂量率为84.08 cGy/min，校正因子1.072，照射时间8.88 min，照射源距小鼠距离为60 cm，照射总剂量800 cGy。放射后4h内由小鼠尾静脉注入新鲜脐血单个核细胞1.0×107~2.0×107(0.1~0.2 mL)，对照组输入等体积生理盐水。
PCR法人特异性基因植入分析：采用酚-氯仿法及快速盐析法抽提小鼠外周血及骨髓DNA。Cart-1基因引物的正义链为5’-AAG GAT ACC ACA ATA AGC TGC- 3’,反义链为5’-GGT TTG TGG AGA CTG GCA C- 3’[3]，扩增片段长156 bp，仅位于Cart-1基因3’-末端翻译序列，与鼠无同源性。反应体系(50 μL)：10×缓冲液5 μL，25 mmol/L MgCl2 3 μL，Taq DNA聚合酶2.5 U，dNTP 0.2 mmol/L，引物各0.25 μmol/L，DNA 0.2 μg，反应参数：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，54 ℃退火45 s，72℃延伸45 s，循环30次，72 ℃补齐延伸5 min，扩增产物以2%琼脂糖凝胶，8 V/cm,电泳40 min，紫外透射仪下分析结果。
流式细胞仪检测小鼠体内人CD45细胞：用摘除眼球法获取小鼠外周血。生理盐水冲出小鼠胫骨、股骨骨髓细胞。FITC标记的鼠抗人CD45抗体与小鼠骨髓细胞悬液及外周血避光孵育，溶血、PBS洗涤后，1%多聚甲醛固定，上机检测，cel-lquest软件分析。
主要观察指标：移植前后小鼠白细胞计数及人特异性CD45细胞检测。
统计学方法：本实验计量资料符合正态分布，采用t检验, 其中差异性采用Excel和SPSS 10.0软件分析。以 P < 0.05为差异显著性意义。

2 结果

2.1 裸鼠照射后一般状况 照射后裸鼠皮肤苍白，精神及饮食欠佳。实验组小鼠于辐照后9~14 d出现散在出血点，14~15 d消失，皮肤颜色渐变红润，精神及饮食逐渐恢复。粪成形，未出现腹泻及皮疹。实验组死亡2只，死亡原因为感染和体内出血，对照组照射后3周以内均死亡，死亡率100%，死亡原因为感染和体内出血。
2.2 裸鼠外周血白细胞计数 放射前小鼠白细胞计数为(6.95~7.34)×109 L-1。实验组及对照组小鼠放射后外周血白细胞数均急剧下降，于放射后10 d左右降至最低，分别为（1.34±0.09）×109 L-1、（0.59±0.12）×109 L-1，15 d以后开始回升。对照组小鼠白细胞回升缓慢，升至2.28×109 L-1后不再回升，直至死亡；实验组回升迅速，至移植后25 d左右已接近放射前水平。
2.3 小鼠体内人特异性CD 45细胞检测 收集移植后各时间段处死的实验组小鼠的骨髓及外周血，用FCM检测人CD45。结果显示：骨髓中的人CD45+细胞2周时就已出现，为0.30%，随后迅速上升，4~8周维持较高水平，8周时最高达7.31%，8周后明显下降，至12周时仍可检测出，最高为5.40%，见图1。

小鼠外周血中的人CD45+细胞2周时已出现，为0.03%，随后迅速上升，6~8周维持较高水平，最高峰值为达1.96%，8周后开始下降，至12周时仍可检测出，最高为1.24%，见图2。

2.4 人类特异性基因鉴定 脐血移植后2周，在小鼠的骨髓、外周血中出现了人类特异性Cart-1基因，并继续存在至12周。对照组未检测到人DNA。

3 讨论

相对于骨髓及成人外周血，脐血具有如下特点：造血干细胞含量丰富，干细胞的增殖与分化能力强[4]。近年来，对控制干细胞自我更新及定向分化的基因研究发现，脐血细胞的造血潜能强于成人骨髓及外周血[5]。
本实验选用的是BALB/cnu+裸鼠，由于其nu基因突变，导致先天性胸腺缺如和T淋巴细胞缺如，致死量放射线照射又可破坏其体内残留的T细胞及B细胞，而致体液免疫和细胞免疫均缺陷，而使所输入的人的脐血干细胞能顺利植入，不被排斥。与SCID小鼠相比，Balb/C nu+裸鼠具有经济、便于饲养及实验等优点。
实验组小鼠的外周血白细胞在致死量射线照射两周后开始迅速回升，25 d左右后恢复照射前水平；实验组小鼠骨髓和外周血中人特异性CD45细胞在2周时就已出现，至12周时仍可检测出；脐血移植后2周，在小鼠的骨髓、外周血中出现了人类特异性Cart-1基因，并继续存在至12周。对照组未检测到上述改变。
本实验证实了尾静脉注入1.0×107~2.0×107个新鲜脐血单个核细胞，能使裸鼠从致死量射线照射造成的重度骨髓抑制中恢复，使其存活率和存活时间均显著高于对照组。通过PCR方法及流式细胞仪检测，均证实了人的脐血已在小鼠体内植入成活，持续至少84 d，在整个移植过程中未出现皮疹和腹泻等移植物抗宿主病相关症状和移植相关死亡。上述实验证明人类脐血干细胞已在小鼠体内移植成功，说明脐血移植可在BALB/cnu+裸鼠中获得植入。

4 参考文献

1 Gluckman E,Broxmeyer HE,Auerbach AD,et al.Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi's anemia by means of um-bilical-cord blood from a HLA-identical sibling. N Engl J Med 1989；321:1174
2 Liu HY，Lan JC，Chen Q，et al.Zhongguo Shuxue Zazhi 2001；14（3）：133-135
刘红雨，兰炯采，陈强，等. 新鲜及冻存的人脐血移植于裸鼠的实验研究[J].中国输血杂志，2001,14(3):133-135
3 Hogan CJ,Shpall EJ,McNulty O,et al. Engraftment and development of
human CD34+-enriched cells from umbilical cord blood in NOD/LtSt-scid/scid mice. Blood 1997；90:85-96
4 Broxmeyer HE,Kurtzberg J,Gluckman E,et al. Umbilical cord blood hematopoietic stem and repopulating cells in human clinical transplantation. Blood Cells 1991; 17:313-329
5 Vaziri H,Dragowska W,Allospp RC,et al. Evidence for a mitotic clock in human hematopoietic stem cells: loss of telomeric DNA with age.Proc Natl Acad Sci USA 1994;91:9875-9860