背景：血管内皮生长因子能促进内皮细胞分裂增殖及血运重建，诱导血管生成，近年来以血管内皮生长因子为基础的基因治疗已逐步试用于临床。但质粒载体转染率低、腺病毒载体对机体的免疫原性及存在潜在感染危险等问题尚需探讨。
目的：拟构建带有绿色荧光蛋白标记并携带hVEGF165基因的无致病性重组腺相关病毒，鉴定并测定病毒滴度及活性。
设计、时间和地点：开放性实验，于2007-03/09在陕西省疾病预防控制中心病毒室完成。
材料：病毒包装细胞AAV-293、病毒滴度检测细胞AAV-HT1080购自Stratagene公司；E coli DH5α菌株由陕西省疾病预防控制中心保存；AAV helper-free system腺相关病毒包装系统中pAAV-IRES-hrGFP质粒包含绿色荧光报告基因，购自Stratagene公司；重组携带hVEGF165基因的质粒pUC18-hVEGF165由西安交通大学第二医院骨科时志斌博士构建。
方法：从含有hVEGF165基因的pUC18-hVEGF165质粒中扩增出hVEGF165片段，插入腺相关病毒骨架质粒pAAV- IRES-hrGFP，构建重组骨架质粒pAAV- hVEGF165-IRES-hrGFP。将此重组质粒和腺相关病毒包装质粒pAAV-RC、辅助质粒pAAV-Helper磷酸钙法共转染AAV-293细胞，通过同源重组产生重组腺相关病毒rAAV-hVEGF165-GFP。荧光显微镜下监测病毒包装效率，裂解AAV-293细胞收获重组病毒并进行浓缩纯化。应用该重组病毒感染AAV-HT1080细胞，荧光计数法测定病毒滴度，并通过病毒基因组外源基因hVEGF165扩增鉴定重组病毒的包装是否成功。应用该重组病毒感染AAV-HT1080细胞。
主要观察指标：荧光显微镜下监测病毒包装效率。荧光计数法测定病毒滴度，并通过病毒基因组外源基因hVEGF165扩增鉴定重组病毒的包装是否成功。
结果：扩增产物经DNA 测序确定为hVEGF165 cDNA片段，重组骨架质粒pAAV-hVEGF165-IRES-hrGFP经双酶切鉴定正确。病毒包装效率达95%以上，收获纯化病毒滴度达5.5×1011 vg/mL。提取重组病毒基因组成功扩增出外源目的基因片段hVEGF165，证实重组病毒rAAV- VEGF165- GFP包装成功。
结论：成功构建带有绿色荧光蛋白标记并携带hVEGF165基因的无致病性重组腺相关病毒rAAV-VEGF165-GFP，收获的病毒具有较高滴度和感染活性。
关键词：血管内皮生长因子；腺相关病毒；绿色荧光蛋白
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