人羊膜上皮细胞有向心肌样细胞分化的特性*★

张路，方宁，陈代雄，刘祖林，万卫红，刘金伟，章涛

遵义医学院附属第一医院，贵州省细胞工程重点实验室，贵州省遵义市 563003

张路★，女，1982年生，山东省烟台市人，汉族，2007年遵义医学院毕业，硕士，主要从事成体干细胞生物学方面的研究。
linda_zhang_667@hotmail.com

通讯作者：陈代雄，硕士，教授，遵义医学院附属第一医院，贵州省细胞工程重点实验室，贵州省遵义市 563003
cellgene@163.
com

中图分类号: R394.2
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)03-00401-05

Differentiation of human amniotic epithelial cells into cardiomyocyte-like cell

Ａｂｓｔｒａｃｔ

ＡＩＭ: To investigate the plasticity of human amniotic epithelial cells into cardiomyocyte-like cells through the experiment of induced differentiation in vitro.
ＭＥＴＨＯＤＳ: Experiments were conducted at the Key Laboratory of Cell Engineering of Guizhou Province from September 2005 to December 2006. ①Six placenta samples through cesarean delivery were collected aseptically with the informed consents of parturients and the experiment was approved by the Ethics Committee of the Affiliated Hospital of Zunyi Medical College. ②Human amnion was peeled from placenta by mechanism method. After being rinsed with D-Hank's solution, the tissue was cut into pieces with eye scissors and digested with 0.2 g/L ethylenediamine tetraacetic acid and 0.5 g/L trypsin. The digested mixture was centrifugated, digested, filtrated, and the fetal bovine serum was added into filter liquor to terminate digestion. Repeated the digestion procedure for twice and combined three digested cell suspension liquid. After being centrifuged, the cell deposition was resuspended and cultured in L-DMEM medium at density of 1.25×108 L-1. The culture medium was replaced at day 3 and the cells were digested with ethylenediamine tetraacetic acid plus trypsin when 80%~90% confluence was reached. After terminating of digestion, the mixture was centrifuged and the supernatant was discarded. Cell deposition was resuspended with culture medium and subcultivated at the density of 1×107 L-1. ③Phenotype of human amniotic epithelial cells was analyzed by flow cytometry. 10 μmol/L 5-azacytidine and 1 mmol/L ascorbic acid 2-phosphate were used to induce the 2nd generation of human amniotic epithelial cells. The expressions of desmin and α-actinin on induced cell were evaluated by immunofluorescent staining，and the levels of cardiac-specific transcription factors Nkx2.5, GATA-4 mRNA and alpha-myosin heavy chain mRNA were assayed by reverse transcription polymerase chain reaction.
ＲＥＳＵＬＴＳ: ①Immunohistochemical properties of human amniotic epithelial cells: Cytokeratin 19 was expressed in human amniotic epithelial cells, while vimentin was negative and CD44 was nearly absent. ②The expression of α-actinin and desmin in human amniotic epithelial cells: The differentiated human amniotic epithelial cells were positive for myocyte-specific markers of desmin and α-actinin. ③The expression of Nkx2.5, GATA-4 and α-MHC mRNA in human amniotic epithelial cells: Cardiac-specific transcription factors of Nkx2.5 and GATA-4 mRNA were expressed in the differentiated human amniotic epithelial cells, while cardiac specific contractile protein of α- myosin heavy chain mRNA was absent.
ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ:Human amniotic epithelial cells acquired from trypsin digesting and separating possess the potential to differentiate into cardiomyocyte-like cells in vitro and human amniotic epithelial cells may be a candidate cells for cellular cardiomyoplasty.

Zhang L, Fang N, Chen DX, Liu ZL, Wan WH, Liu JW, Zhang T.Differentiation of human amniotic epithelial cells into cardiomyocyte-like cells.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(3):401-405(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-3/3k-401(ps).pdf]

摘要
目的：通过体外诱导分化实验，评价人羊膜上皮细胞向心肌样细胞分化的能力。
方法：实验于2005-09/2006-12在贵州省细胞工程重点实验室完成。①对象：经产妇知情同意，无菌采集健康足月剖宫产胎盘6份，实验经医院医学伦理委员会批准。②实验方法：采用机械法将羊膜从胎盘组织上剥离，D-Hank’s液冲洗后剪成碎片，加入含有0.2 g/L乙二胺四乙酸的0.5 g/L胰蛋白酶溶液，离心、消化、过滤，收集滤液，加入胎牛血清终止消化，重复消化2次。合并3次消化所得的细胞悬液，离心后将细胞沉淀悬浮于L-DMEM培养基中，按1.25×108 L-1密度接种，常规培养3 d后更换培养基，待细胞达80%~90%融合后用胰蛋白酶+乙二胺四乙酸联合消化，终止后离心弃上清，细胞沉淀用培养基重新悬浮，按1×107 L-1密度传代。③实验评估：用流式细胞仪鉴定人羊膜上皮细胞表型；使用10 μmol/L 5-氮杂胞苷和1 mmol/L抗坏血酸磷酸盐诱导第2代人羊膜上皮细胞，免疫荧光染色法检测诱导后细胞中特异蛋白结蛋白和 α-辅肌动蛋白的表达，RT-PCR检测心肌特异性转录因子Nkx2.5、GATA-4和心肌特异性收缩蛋白α-肌球蛋白重链mRNA的表达。
结果：①人羊膜上皮细胞的免疫组化特征：人羊膜上皮细胞几乎不表达CD44，不表达波形蛋白，表达角蛋白19。②人羊膜上皮细胞α-辅肌动蛋白和结蛋白的表达：人羊膜上皮细胞经诱导分化后，表达肌系细胞标志α-辅肌动蛋白和结蛋白。③人羊膜上皮细胞Nkx2.5、GATA-4和α-肌球蛋白重链mRNA的表达：人羊膜上皮细胞经诱导分化后，表达心肌特异性转录因子Nkx2.5 mRNA和GATA-4 mRNA，心肌特异的可收缩蛋白α-肌球蛋白重链mRNA未见表达。
结论：通过胰蛋白酶消化法分离获得的人羊膜上皮细胞具有向心肌样细胞分化的特性，可能成为细胞心肌成形术的候选供体细胞。
关键词：人羊膜上皮细胞；心肌样细胞；诱导分化

张路，方宁，陈代雄，刘祖林，万卫红，刘金伟，章涛.人羊膜上皮细胞有向心肌样细胞分化的特性[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(3):401-405 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-3/3k-401(ps).pdf]

细胞心肌成形术是指将外源细胞移植入受损心肌组织并分化为新的心肌细胞，以恢复心脏功能，可能成为治疗心肌细胞受损较为理想的方法[1-2]。细胞心肌成形术其供体细胞的来源主要有胚胎干细胞、骨髓干细胞和成体肌细胞等。近年来有研究证明，人羊膜上皮细胞具有部分胚胎干细胞特性[3-4]，可分化为3个胚层不同类型的细胞[5-7]，提示人羊膜上皮细胞在组织工程和细胞替代治疗领域具有广阔的应用前景，目前国内尚未见人羊膜上皮细胞分化为心肌细胞的报道。本实验利用足月分娩胎盘羊膜分离人羊膜上皮细胞，通过体外诱导分化观察其向心肌细胞分化的特性。

1 材料和方法

设计：细胞观察实验。
单位：遵义医学院附属第一医院，贵州省细胞工程重点实验室。
材料：实验于2005-09/2006-12在贵州省细胞工程重点实验室完成。经产妇知情同意，无菌采集健康足月剖宫产胎盘6份，实验经医院医学伦理委员会批准。LG-DMEM培养基，胎牛血清（GIBCO公司）；胰蛋白酶（Amreseo公司）；5-氮杂胞苷，抗坏血酸磷酸盐，鼠抗人波形蛋白抗体，鼠抗人α-辅肌动蛋白单抗，兔抗人结蛋白抗体（Sigma公司）；荧光标记小鼠抗人单抗CD44-FITC，羊抗鼠IgG-FITC（BD公司）；鼠抗人CK19抗体（Gene Tech公司）；羊抗兔Ig-Texas Red（Oxford Biotechnology公司）；TRIzol○R Reagent（Invitrogen公司）；mRNA Selective PCR Ver.1.1（TaKaRa公司）；引物交TaKaRa公司合成。
设计、实施、评估者：实验设计、评估为第二作者，实验实施为其余作者，均经过系统正规训练，未使用盲法评估。
方法：
人羊膜上皮细胞的分离和培养：采用机械法将羊膜从胎盘组织上剥离，用D-Hank’s液冲洗数次，以清除残留血迹。将羊膜剪成碎片，加入含有0.2 g/L乙二胺四乙酸的0.5 g/L胰蛋白酶溶液，于37 ℃、200 r/min离心消化 10 min，弃上清；重新加入消化液，于37 ℃旋转消化30 min，300目钢网过滤，收集滤液，加入胎牛血清终止消化。重复消化2次。合并3次消化所得的细胞悬液，1 500 r/min离心 10 min，细胞沉淀重新悬浮于L-DMEM培养基中（含体积分数为0.1的胎牛血清、2 mmol/L的L-谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、55 μmol/L的2-巯基乙醇、1 mmol/L丙酮酸钠、10 μg/L表皮生长因子、100 U/mL青霉素和100 g/L链霉素），以1.25×108 L-1密度接种于6孔培养板，于37 ℃、体积分数为0.05的CO2环境下培养，3 d更换新的培养基。待人羊膜上皮细胞达80%~90%融合后，用2.5 g/L胰蛋白酶+0.2 g/L乙二胺四乙酸溶液于37 ℃联合消化2~5 min，加入培养基终止胰蛋白酶作用，1 000 r/min离心5 min，弃上清，细胞沉淀用培养基重新悬浮后，以1×107 L-1密度传代。
人羊膜上皮细胞的免疫荧光染色鉴定：将原代细胞接种于预置盖玻片的24孔板中，制备细胞爬片。待细胞达80%~90%融合时，取出细胞爬片，用免疫荧光染色法检测其角蛋白19的表达。将细胞爬片用磷酸盐缓冲液振荡洗涤两三次，40 g/L多聚甲醛室温固定10 min，磷

酸盐缓冲液冲洗3次，用0.3%Triton-X100室温下作用15~20 min，磷酸盐缓冲液冲洗。用磷酸盐缓冲液配制1%BSA于室温下封闭30 min，磷酸盐缓冲液冲洗3次，5 min/次，加入鼠抗人角蛋白19抗体与鼠抗人波形蛋白抗体（一抗），37 ℃孵育30 min，磷酸盐缓冲液冲洗3次，5 min/次。加入FITC标记的羊抗鼠IgG（二抗）， 37 ℃孵育30 min，磷酸盐缓冲液冲洗3次，5 min/次。90%甘油封固，荧光显微镜下观察。阴性对照组以磷酸盐缓冲液代替一抗。
人羊膜上皮细胞的流式细胞仪分析：将新鲜分离的人羊膜上皮细胞浓度均调至 1×109 L-1，取细胞悬液200 μL，加入荧光标记单抗CD44-FITC 3 μL混匀，室温避光孵育20 min，1 000 r/min离心5 min，弃上清，重新悬浮细胞；每管加入2 mL 含0.1%叠氮钠的磷酸盐缓冲液，混匀，1 000 r/min离心5 min，弃上清，再悬浮细胞。每管加入10 g/L的多聚甲醛200 μL，混匀，用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD44的表达，每一样品采集细胞数≥20 000个，用Cellquest软件采集和分析。同型对照抗体为荧光素标记的小鼠IgG。
人羊膜上皮细胞的诱导分化：传至第二、三代的人羊膜上皮细胞于传代后24 h用终浓度为10 μmol/L的5-氮杂胞苷诱导培养基孵育24 h，磷酸盐缓冲液冲洗细胞2次。加入含1 mmol/L抗坏血酸磷酸盐和体积分数为0.05胎牛血清的L-DMEM培养基继续培养，于诱导后 12 d进行RT-PCR检测。
免疫荧光法鉴定：上述细胞爬片于诱导后2，4周取出，用免疫荧光染色法观察其α-辅肌动蛋白和结蛋白的表达。除一抗分别为鼠抗人α-辅肌动蛋白单抗和抗结蛋白单抗外，荧光素标记的二抗以及实验步骤均与人羊膜上皮细胞免疫荧光染色鉴定相同。
RT-PCR：用Trizol试剂提取诱导前后细胞总RNA，参照说明书进行一步法RT-PCR。GATA-4（475 bp）引物序列为F：5’-AGA CAT CGC ACT GAC TGA GAA C-3’和R：5’-GAC GGG TCA CTA TCT GTG CAA C-3’，50 ℃ 15 min（反转录反应）；85 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共25个循环。Nkx2.5 （233 bp）引物序列为F：5’- CTT CAA GCC AGA GGC CTA CG-3’和R：5’-CCG CCT CTG TCT TCT TCA GC-3’，50 ℃ 15 min（反转录反应）；85 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共30个循环。α-肌球蛋白重链（413 bp）引物序列为F：5’-GTC ATT GCT GAA ACC GAG AAT G-3’和R：5’-GC AAA GT A CTG GAT GAC ACG CT-3’，50 ℃ 15 min（发转录反应）；85 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共30个循环。内参为GAPDH（312 bp）引物序列为F：5’- AGC CAC ATC GCT CAG ACA CC -3’和R：5’-GTA CTC AGC GGC CAG CAT CG-3’， 50 ℃ 15 min（反转录反应）；85 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共25个循环。
主要观察指标：①人羊膜上皮细胞的免疫组化特征。②人羊膜上皮细胞α-辅肌动蛋白和结蛋白的表达。③人羊膜上皮细胞Nkx2.5、GATA-4和α-肌球蛋白重链mRNA的表达。

2.1 人羊膜上皮细胞的生长特点经胰蛋白酶消化，每份羊膜平均可获得5.01×107个人羊膜上皮细胞，细胞活性 > 90%。原代培养3 d后，有少量细胞贴壁；第4天以后，贴壁细胞数量逐渐增多，形态多为卵圆形和三角形；至第9天细胞呈铺路石样紧密排列，达90%以上融合（图1）。传代后人羊膜上皮细胞较原代易于贴壁，增殖速度加快，第四、五天细胞可达90%融合。6代以后的人羊膜上皮细胞增殖速度减缓，胞体变大，呈扁平样。

2.2 人羊膜上皮细胞的免疫组化特征流式细胞仪分析和免疫荧光染色结果显示，新鲜分离的人羊膜上皮细胞几乎不表达CD44（图2），不表达波形蛋白，表达角蛋白19（图3）。

2.3 人羊膜上皮细胞α-辅肌动蛋白和结蛋白的表达免疫荧光染色结果显示，人羊膜上皮细胞诱导分化后2，4 周均表达α-辅肌动蛋白和结蛋白（图4），而未添加5-氮杂胞苷和抗坏血酸磷酸盐的非诱导组均不表达。

2.4 人羊膜上皮细胞Nkx2.5、GATA-4和α-肌球蛋白重链 mRNA的表达 RT-PCR检测结果显示，人羊膜上皮细胞在诱导前后均表达心肌特异性转录因子Nkx2.5 mRNA(图5)，而GATA-4 mRNA仅在诱导后才有表达(图6)，心肌特异的可收缩蛋白α-肌球蛋白重链mRNA在诱导前后均未见表达。

人羊膜细胞为异质性细胞群，主要有人羊膜上皮细胞和人羊膜间充质细胞，这两类细胞尚无可供分选的特征性生物标志[8-9]。目前分离人羊膜上皮细胞的主要方法是通过胰蛋白酶消化法。本实验使用胰蛋白酶消化羊膜所分离的人羊膜上皮细胞数可达5×107/份，表达细胞角蛋白19，但不表达CD44和波形蛋白，与文献报道一致[10]，说明胰蛋白酶消化法可获得较高丰度和纯度的人羊膜上皮细胞，而且几乎没有人羊膜间充质细胞的混杂。

表皮生长因子对人羊膜上皮细胞的生长增殖是必需的[11]。本实验观察到，在表皮生长因子的作用下，原代或传代的人羊膜上皮细胞均快速增殖，并形成铺路石样的上皮细胞层；而未添加表皮生长因子的原代人羊膜上皮细胞则增殖缓慢，且随培养时间延长细胞胞体增大，核浆比减小，成为扁平的巨形细胞。Miki等[3]提出，在人羊膜上皮细胞的原代培养中，细胞分3层，即上层悬浮细胞、底层贴壁细胞和黏附在贴壁细胞上的中间层细胞，其中的中间层细胞包含有较多数量且具有干细胞特性的细胞。本实验也观察到在人羊膜上皮细胞的原代生长过程中，一些成簇或单个的细胞黏附在底层的贴壁细胞上。因此在消化传代细胞时，应注意收获黏附在底层贴壁细胞上的细胞，以保证后续诱导分化的有效性。
结蛋白是肌组织特异中间丝，是最早表达于未分化的肌母细胞中的肌源性蛋白，是新生或成熟平滑肌、心肌、骨骼肌细胞中间丝构成的主要成分之一[12-13]，它作为心肌细胞分化的一种早期的标志已经得到公认。α-辅肌动蛋白散在表达于胞浆中，逐渐地集中形成Z带，连接成熟的肌纤维，形成肌小节，而肌小节形成通常是肌细胞成熟的标志[14-15]。本实验细胞免疫荧光染色结果显示，人羊膜上皮细胞经5-氮杂胞苷和坏血酸盐诱导后表达结蛋白和α-辅肌动蛋白。这说明诱导后的人羊膜上皮细胞已向肌系细胞分化。但是α-辅肌动蛋白均匀分布在胞浆中，未见清晰的肌小节形成，说明这些细胞尚处于心肌细胞分化的早期，尚未分化为成熟的心肌细胞。RT-PCR结果进一步显示，人羊膜上皮细胞经诱导分化后表达Nkx2.5 mRNA和GATA-4 mRNA的表达，但是未检测到心肌特异性可收缩蛋白基因α-MHC的表达。这一结果表明，人羊膜上皮细胞在本实验条件已向心肌样细胞分化，但尚无决定心肌细胞自发收缩的基因（如α-MHC）的表达。这也说明，心肌细胞分化过程中基因的差异表达具有严格的时空顺序。值得提出的是，在未经诱导的人羊膜上皮细胞中也检测到心肌特异性转录因子Nkx2.5的表达，说明人羊膜上皮细胞本身具有心肌细胞的某些特性，这也许可以视为人羊膜上皮细胞作为细胞心肌成形术供体细胞的特质优势。
关于5-氮杂胞苷和抗坏血酸盐诱导人羊膜上皮细胞向心肌样细胞分化的分子机制尚不清楚。有学者认为，5-氮杂胞苷是胞嘧啶核苷的一个类似物，可引起DNA中某些胞嘧啶的低甲基化或去甲基化，从而直接或间接地激活特异性基因的表达[16-19]。抗坏血酸是许多生物学反应中的重要辅助因子，有研究表明，其在胚胎干细胞向心肌细胞分化的过程中具有明显的促进作用[20]。
综上所述，通过胰蛋白酶消化法分离的人羊膜上皮细胞在本实验条件下具有向心肌样细胞分化的特性，可能成为细胞心肌成形术候选供体细胞，其在受损心肌部位的原位分化能力及功能评价尚待通过体内实验深入探讨。

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