1咸宁学院医学院解剖学教研室，湖北省咸宁市 437100；2咸宁学院医学院口腔系，湖北省咸宁市 437100

丁继固，男，1954年生，湖北省崇阳县人，汉族，1977年咸宁医学院毕业，教授，主要从事神经解剖和应用解剖方面的研究。
dingjigu@
hotmail.com

湖北省教育厅重点课题（D200628008）*

中图分类号: R394.2
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)03-00406-05

收稿日期: 2007-06-26
修回日期：2007-11-12
(07-50-6-3543/ZS Q）

Differentiation of mesencephalic neural stem cells from rat embryos induced by interleukin-1 beta in vitro

Ａｂｓｔｒａｃｔ

ＡＩＭ:Effective proliferation in vitro of neural stem cells and a large amount of dopaminergic neuron differentiation are important in the neural stem cell transplantation for Parkinson disease. This article explores the culture methods for the differentiation of mesencephalic neural stem cells from embryonic mice into dopaminergic neurons by interleukin-1β in vitro.
ＭＥＴＨＯＤＳ: Experiments were conducted in the Laboratory of Biology, Experimental Center, Medical College, Wuhan University from April to December 2005. ①The pregnant 12-day rat embryos were provided by the Experimental Animal Center of Medical College of Wuhan University. Certificate number of animal was Kunzi 2005. Animal intervention met the animal ethical standard. ②Meninges of fetal rats were isolated and midbrain was obtained, digested with trypsin, centrifuged and passaged by the mechanical method. Neurosphere cultured for 5-7 days was collected and incubated at (20-30)/cm2. Cells in the interleukin-1β group were incubated in DMEM/F12 medium containing 200 ng/L interleukin-1β and fetal bovine serum of 0.1 volume fraction. Cells in the blank control group were incubated in the DMEM/F12 medium containing fetal bovine serum of 0.1 volume fraction. ③Mononuclear cells differentiated from 80% cells at days 10-12 were determined by the immunocytochemical technique. Positive cell rate of tyroxine hydroxylase was detected by the flow cytometry.
ＲＥＳＵＬＴＳ: ①Immunocytochemistry: Cells in neurospheres expressed nidogen antigen and differentiated into neuro-specific enolase and glial fibrillary acidic protein. Tyroxine hydroxylase was found in the interleukin-1β group, showing large cell body, round and ellipse. Tyroxine hydroxylase was seen in cytoplasm and cluster-shape processes. Tyroxine hydroxylase in the blank control group was different from that in the interleukin-1β group in amount and appearance. ②Positive cell rate of tyroxine hydroxylase was higher in the interleukin-1β group than in the blank control group (P < 0.01).
ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ:Interleukin-1β can promote the differentiation of mesencephalic neural stem cells into dopaminergic neuron with enough amount and mature appearance and function.

Ding JG, Ding WJ, Li G.Differentiation of mesencephalic neural stem cells from rat embryos induced by interleukin-1 beta in vitro.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(3):406-410(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-3/3k-406(ps).pdf]

摘要
目的：在神经干细胞移植治疗帕金森病过程中，有效的神经干细胞体外增殖与多巴胺能神经元的大量定向诱导分化尤为关键。以白细胞介素1β为诱导剂，观察鼠胚胎中脑神经干细胞向多巴胺能神经元的分化。
方法：实验于2005-04/12在武汉大学医学院实验中心结构生物学实验室完成。①动物：清洁级孕12 d昆明鼠胚胎，由武汉大学医学院实验动物中心提供，动物质量合格证号为昆字2005，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法：分离胎鼠脑膜，取中脑组织，胰蛋白酶消化，离心过滤后机械法传代。取传代培养5~7 d的神经球，按（20~30）个/cm2接种，白细胞介素1β组加入含200 ng/L白细胞介素1β、体积分数为0.1胎牛血清的DMEM/F12培养基进行诱导分化，空白对照组单纯加入体积分数为0.1胎牛血清的DMEM/F12培养基予以自然分化。③实验评估：诱导10~12 d，待80%细胞从神经球迁移出来并分化为单细胞时行免疫细胞化学鉴定，流式细胞术检测酪氨酸羟化酶阳性细胞率。
结果：①免疫细胞化学鉴定：神经球细胞表达巢蛋白抗原，能分化为神经元特异性烯醇化酶、胶原纤维酸性蛋白阳性细胞。白细胞介素1β组可见酪氨酸羟化酶阳性细胞，胞体较大，圆形和椭圆形居多，酪氨酸羟化酶位于胞质及突起中，胞核无表达，突起呈酪氨酸羟化酶阳性神经元典型的串珠样形态。空白对照组酪氨酸羟化酶阳性神经元在数量、细胞成熟形态上均未达到白细胞介素1β组水平。②中脑神经干细胞向多巴胺能神经元分化的阳性率：白细胞介素1β组酪氨酸羟化酶阳性细胞率明显高于空白对照组（P < 0.01）。
结论：白细胞介素1β可明显促进中脑神经干细胞分化为数量足够、形态及功能成熟的多巴胺能神经元。
关键词：中脑神经干细胞；多巴胺能神经元；白细胞介素1β；酪氨酸羟化酶

丁继固，丁文杰，李光.白细胞介素１β体外诱导鼠胚胎中脑神经干细胞的分化[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(3):406-410 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-3/3k-406(ps).pdf]

0 引言

在对帕金森病的神经干细胞移植治疗中，移植细胞的数量及多巴胺能神经元的分化比率是必须解决的问题，而有效的神经干细胞体外增殖与多巴胺能神经元的大量定向诱导分化是解决问题的关键所在。此外，诱导方式及诱导剂的选择也相当重要，白细胞介素1β对大鼠中脑多巴胺能神经元有特异性营养作用[1]。本实验主要探讨白细胞介素1β体外诱导鼠胚胎中脑神经干细胞向多巴胺能神经元的分化情况，为在体外获得足够的多巴胺能神经元、帕金森病的转基因移植治疗解决供体问题。

1 材料和方法

设计：分组设计，细胞观察。
单位：咸宁学院医学院解剖学教研室，咸宁学院医学院口腔系。
材料：实验于2005-04/12在武汉大学医学院实验中心结构生物学实验室完成。①动物：取清洁级孕12 d昆明鼠胚胎（由武汉大学医学院实验动物中心提供，动物质量合格证号：昆字2005），实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②试剂与仪器：白细胞介素1β，碱性成纤维生长因子（Pepro-tech公司）；DMEM/F12培养基，特优级胎牛血清（HyClone公司）；B27（GIBCO公司）；胰蛋白酶(Trypsin)，左旋多聚赖氨酸（Sigma公司）。③抗体：鼠抗人nestin IgG，鼠抗人神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体，鼠抗人胶原纤维酸性蛋白单克隆抗体（北京中山生物技术公司）；小鼠抗大鼠酪氨酸羟化酶IgG单克隆一抗，羊抗鼠IgG荧光标记二抗（Sigma公司）。
设计、实施、评估者：设计为第一作者，实施为第三作者，评估为全体作者，均经过系统培训，未使用盲法评估。
方法：
中脑神经干细胞的分离培养：鼠胚胎断髓处死，放入体积分数为0.75的乙醇中浸泡消毒2 min，置超净工作台上，解剖显微镜下分离脑膜，切取中脑组织，用磷酸盐缓冲液洗3次，剪刀剪碎，加入2.5 g/L胰蛋白酶(刚刚覆盖组织即可)，37 ℃水平摇床消化5 min。然后用含体积分数为0.1胎牛血清的培养基中止消化反应，吹打，使细胞混匀，1 000 r/min离心10 min。去上清，用无血清培养基重悬细胞，200目尼网过滤；细胞计数器计数，将细胞以5×108 L-1接种于60 mm培养皿中，添加4% B27和碱性成纤维生长因子20 μg/L。细胞生长约1周左右，不用胰蛋白酶消化，采用机械方法分离传代，离心弃上清液，重悬，计数接种。
中脑神经干细胞的诱导分化：取传代培养5~7 d的神经球，按20~30个/cm2接种于置有预先经PLL包被盖玻片的24孔培养板中，待流式细胞仪检测的细胞直接接种至培养皿。设立两组，白细胞介素1β组加入含 200 ng/L白细胞介素1β、体积分数为0.1胎牛血清的DMEM/F12培养基进行诱导分化，空白对照组单纯加入体积分数为0.1胎牛血清的DMEM/F12培养基予以自然分化。每三四天换液1次，诱导10~12 d，待80%细胞从神经球迁移出来并分化为单细胞时，进行免疫细胞化学鉴定及流式细胞术检测。
免疫细胞化学检测：取出待染细胞，磷酸盐缓冲液漂洗2次，纯甲醇 20 ℃固定20 min，磷酸盐缓冲液漂洗3次，5 min/次。1% Triton X-100透化20 min，磷酸盐缓冲液漂洗3次，37 ℃羊血清孵育20 min以封闭非特异反应，一抗分别为抗巢蛋白IgG、抗神经元特异性烯醇化酶IgG、抗胶原纤维酸性蛋白IgG、抗酪氨酸羟化酶IgG，于4 ℃过夜，次日加入荧光素Texas Red标记的二抗， 37 ℃孵育1 h，磷酸盐缓冲液洗3次，缓冲甘油封固，荧光显微镜下观察。
酪氨酸羟化酶阳性细胞比例流式细胞术检测：收集细胞，纯甲醇-20 ℃固定，磷酸盐缓冲液洗3次。1% Triton X-100透化20 min，磷酸盐缓冲液洗3次，加入抗酪氨酸羟化酶IgG一抗，4 ℃过夜，次日磷酸盐缓冲液洗3次，加入荧光素FITC标记的二抗，37 ℃孵育1 h，磷酸盐缓冲液洗3次，400目尼龙网过滤，制成单细胞悬液，细胞计数，每组细胞总量调整至1×108 L-1~ 1×109 L-1。上机检测，每张免疫荧光染色片随机取6个视野，分别进行DAPI核标记数和酪氨酸羟化酶阳性细胞计数。酪氨酸羟化酶阳性细胞率（%）= 酪氨酸羟化酶阳性细胞数/DAPI阳性数，每次实验各计数染色片6张，重复3次，取平均值。
主要观察指标：①免疫细胞化学鉴定。②中脑神经干细胞向多巴胺能神经元分化的阳性率。
统计学方法：由第二作者采用SPSS 12.0软件包进行t检验处理分析，数据以x(_)±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 中脑神经干细胞的培养及诱导分化情况 小鼠中脑神经干细胞体外分离培养24 h后，可见大部分细胞呈碎渣样死亡；存活细胞培养二三天后，聚集成团，团块细胞界限不清，周围光晕可见(图1)；五六天后长成直径120~180 μm的神经球（neurosphere），团块周边折光性好，但细胞界限仍不清(图2)。
 

神经球经白细胞介素1β诱导后，4 h贴壁，12 h可见球体之间伸出细长突起；2 d左右有细胞沿着长突起向外迁移；随后细胞突起延长增多，细胞与细胞之间以及球体与球体之间形成纤维网络(图3)。诱导分化约10 d大部分神经球已完全分散为单细胞，散在细胞之间有突起连接(图4)。

2.2 免疫细胞化学鉴定 免疫荧光染色显示，神经球细胞表达巢蛋白抗原(图5)，能分化为神经元特异性烯醇化酶(图6)、胶原纤维酸性蛋白阳性细胞(图7)，表明其具有多向分化潜能，是神经干细胞。

白细胞介素1β组可见酪氨酸羟化酶阳性细胞，胞体较大，圆形和椭圆形居多，酪氨酸羟化酶位于胞质及突起中，胞核无表达，突起呈酪氨酸羟化酶阳性神经元典型的串珠样形态(图8)。空白对照组酪氨酸羟化酶阳性神经元的数量明显减少，且细胞形态没有白细胞介素1β组成熟(图9)。
2.3 中脑神经干细胞向多巴胺能神经元分化的阳性率检测 流式细胞术检测结果显示，白细胞介素1β组酪氨酸羟化酶阳性细胞率为（9.54±0.63）%，明显高于空白对照组（3.46±0.77）%，差异有显著性意义(P < 0.01)，见图10。

3 讨论

神经干细胞的发现和研究改变了成年后神经元不可能再生的传统观念[1-2]，它在神经系统退行性变及神经系统损伤的功能恢复方面具有广泛的应用前景[3-4]。神经干细胞广泛存在于哺乳动物成年和胚胎的不同脑区。来自胚胎不同部位的神经干细胞分化有明显的区域特异性，来自中脑和间脑的神经干细胞较端脑和菱脑来源的神经干细胞有更高的酪氨酸羟化酶阳性细胞分化率，中脑和间脑来源的酪氨酸羟化酶抗原阳性细胞的细胞形态也更接近于中脑DA 能神经元[5]。本实验切取鼠胚胎中脑组织，作为体外培养中脑神经干细胞的直接来源，以提高酪氨酸羟化酶阳性细胞分化率。
神经干细胞的分化受细胞自身基因的调控和外来信号的调控[6-7]。目前对神经干细胞向多巴胺能神经元诱导分化有明确作用的因素包括：①细胞因子，如胶质细胞源性神经营养因子、脑源神经营养因子、白细胞介素1、成纤维细胞生长因子8、胰岛素样生长因子1。②低氧环境及各种抗氧化剂。③CAMP、中脑组织、骨髓基质细胞等。其中细胞因子不仅可以影响神经干细胞的生长与分化，而且能够促进成熟神经细胞的存活与成熟，在神经系统的生长发育、功能维持和损伤修复中发挥重要作用。已有实验显示，在治疗一些神经系统疾病时，向动物体内植入已限制性向特定类型神经元分化的神经干细胞，比植入未分化的神经干细胞效果好[8]。
白细胞介素1是一种发现于造血系统的致炎因子，最初发现它对造血细胞的分化有重要影响。后来，发现也存在于早期发育的中枢神经系统中，这使人们开始探讨它对神经系统发育的作用。Carve等人[9-10]陆续证实白细胞介素1(包括α和β作为一种重要诱导剂，参与神经系统多巴胺能神经元的发育，他们发现白细胞介素1单独或与一些细胞因子（如白细胞介素11、白血病抑制因子）等组合，可诱导神经干细胞分化出较为典型的酪氨酸羟化酶阳性神经元(酪氨酸羟化酶是多巴胺合成的关键限速酶)，这些诱导的神经元用于移植治疗帕金森病的6-羟基多巴胺模型大鼠疗效显著。
帕金森病是由于中脑黑质的多巴胺能神经元退行性变所致。神经干细胞移植到脑的受损部位，可以重建神经回路，恢复神经功能[11]。神经干细胞的突出优点是可塑性强，移植到脑组织内可在特定脑区的多种因素作用下发生特殊分化。移植到成年大鼠帕金森病模型病变侧神经干细胞分化的多巴胺能神经比健侧多，预示神经干细胞适合帕金森病的移植治疗[12]。
本实验初始阶段采用无血清基培养中脑神经干细胞，发现了大量的神经球，这说明无血清的培养基有利于神经干细胞的分裂增殖。同时贴壁培养可增加细胞暴露于培养基的面积，有利于神经干细胞获取养分，也为转基因操作提供了方便[13]。神经球表达巢蛋白这种特异性标记物，证实了神经干细胞属性。将神经球移入含血清的培养基中，神经干细胞自然分化为神经元和神经胶质细胞，这说明中脑神经干细胞与其他脑区的神经干细胞一样具有多向分化的潜能。神经干细胞的来源对分化的神经元最终表型有很重要的影响。Potter等[7，14]发现白细胞介素1能诱导中脑来源的神经干细胞分化为多巴胺能神经元，却不能诱导纹状体来源的神经干细胞。表明不同来源的神经干细胞特性并不相同，即神经干细胞的区域特异性，说明中脑来源的神经干细胞易分化为多巴胺能神经元，可能是来自中脑腹侧的神经干细胞本身含有中脑源性转录因子和相关发育信号，能够对区域性的相关分子信号作出快速反应，从而分化为多巴胺能神经元。本实验选择中脑来源的神经干细胞显然有利于诱导，两组均能检测到酪氨酸羟化酶阳性细胞，只是白细胞介素1β组酪氨酸羟化酶阳性细胞数量比空白对照组多。神经干细胞的存活与生长也需要一定的细胞密度支持[15]。本实验发现中脑神经干细胞以5×108 L-1接种为宜。在整个实验中，接种密度为7×107 L-1～1×108 L-1时几乎没有神经细胞存活，接种密度为1×108 L-1～1×109 L-1时存活的神经细胞数目较多。接种密度到5× 108 L-1时，存活率极高，占接种细胞数的40%~60%，且成球率高。本实验发现微量的白细胞介素1β可以明显提高中脑神经干细胞诱导分化出酪氨酸羟化酶阳性神经元的比例，且分化率约为（9.54±0.63）%，是空白对照组3倍多。在多巴胺能神经元的前体细胞发育为成熟的多巴胺能神经元的过程需要一系列的信号分子[16]。研究表明，在环境信号的作用之外，干细胞本身对不同信号的敏感性及不同信号浓度的反应性不同[17]。神经干细胞向多巴胺能神经元分化涉及到诸多信号调控，白细胞介素1只是其中之一。现已发现胶质细胞源性神经营养因子、脑源性神经营养因子也是参与多巴胺能神经元发育分化的外界信号分子[18-19]。除细胞因子外，彭超华 等[20]发现低氧的培养环境也能利于神经干细胞向多巴胺能神经元的分化和存活。白细胞介素1β与其受体结合可兴奋信号通路。白细胞介素1β影响中脑神经干细胞向多巴胺能神经元分化的过程中是否与其对信号分子的作用有关需进一步探讨。
神经干细胞分化是细胞内外多种因素协调控制、相互作用的结果。如何定向诱导神经干细胞向所希望的细胞类型分化是当今神经干细胞研究领域的重点和热点，但是到目前为止，人们在这一领域取得的成果离临床实用性仍有很大的距离。帕金森病的严重危害和临床治疗上的局限性，利用神经干细胞在体外增殖分化得到临床用量的多巴胺能神经元是解决这一问题的有效途径。本实验结果显示，约（9.54±0.63）%的中脑神经干细胞在白细胞介素1β的诱导下分化为多巴胺能神经元，这对治疗帕金森病有一定的临床意义，如何发现更高效率多巴胺能神经元的诱导因子及其组合，还需深入分析。
目前白细胞介素1β促进神经干细胞向酪氨酸羟化酶阳性神经元分化的作用是肯定的，但其具体诱导机制尚知之甚少，白细胞介素1β与其他神经营养因子如何选择最优的诱导剂、最佳的剂量组合，以及如何诱导得到更多的适宜帕金森病移植的多巴胺能神经元仍有待于深入研究。
本实验用白细胞介素1β体外成功地对中脑神经干细胞进行定向诱导，结果说明白细胞介素1β能够提高多巴胺能神经元的分化率，可有效从体外获得足够量、且形态及功能成熟的多巴胺能神经元，为用于移植治疗帕金森病解决了细胞来源问题。

4 参考文献

1 Magnus T,Rao Ma. Neural stem cells in inflammatory CNS diseases: mechanisms and therapy. J Cell Mol Med 2005;9(2):303-319
2 Taupin P. Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system: functionality and potential clinical interest. Med Sci Monit 2005;11(7):RA247-252
3 Emsley JG, Mitchell BD, Magavi SS,et al. The repair of complex neuronal circuitry by transplanted and endogenous precursors. NeuroRx 2004;1(4):452-471
4 Kim HT, Kim IS, Lim SE,et al. Gene and cell replacement via neural stem cells.Yonsei Med J 2004;30（45 Suppl）:32-40
5 Riaz SS, Theofilopoulos S, Jauniaux E, et al. The differentiation potential of human fet al neuronal progenitor cells in vitro. Developmental Brain Research 2004；153 (1):39-51
6 Yu XQ，Ruan HZ，Cai WQ，et al. Disan Junyi Daxue Xuebao 2004；26（1）：18-21
余小强，阮怀珍，蔡文琴，等. PD 大鼠纹状体提取液诱导中脑NSCs分化为DA能神经元的研究[J].第三军医大学学报，2004，26（1）：18-21
7 Moses D, Teper Y, Gantois I, et al. Murine embryonic EGF-responsive ventral mesencephalic neurospheres display distinct regional specification and promote survival of dopaminergic neurons. Exp Neurol 2006；18（1）: 4-8
8 Wang X, Lu Y, Zhang H, et al. Distinct efficacy of pre-differentiated versus intact fetal mesencephalon derived human neural progenitor cells in alleviating rat model of Parkinson's disease. Neuroscience 2004；22（2）：175-183
9 Carvey PM ，Zao DL，Sortwell CE，et al.A clonal line of mesencephalic progenitor cells converted to dopamine neurons by hematopoietic cytokines：a source of cells for transplantation Parkinson′s disease.Exp Neurol 2001；171(1)：98-108
10 Storch A，Paul G，Csete M，et al.Long term proliferation and dopaminergic differentiation of human mesencephalic neural precursor cells.Exp Neurol 2001；17O(2)：317-325
11 Nishino H，Hida H，Takei N，et al.Mesencephaclic Neural stern(Progenitor)cells develop to dopaminergic neurons nore strongly in dopamine-depleted striatum than in intact striatum.Exp Neurol 2000；64（2）：209-214
12 Mei B，Dai JB, Zhang JJ, et al. Zhongguo Kangfu Yixue Zazhi 2003；7(16):2264-2265
梅斌,戴冀斌,章军建,等. 神经干细胞移植对帕金森病鼠纹状体多巴胺含量的影响[J].中国临床康复,2003,7(16):2264-2265
13 Zhu C, Zhang CH, Liu ZH, et al. Zhongguo Kangfu Yixue Zazhi 2006；21（4）：322-324
祝畅，张传汉，刘志恒，等.人胚神经干细胞的长期贴壁培养和和鉴定[J].中国康复医学杂志, 2006，21（4）：322-324
14 Potter ED，Ling ZD，Carvey PM. Cytokine induced conversion of mesencephalic -derived progenitor cells into dopamine neurons.Cell Tissue Res 1999;296(2)：235-246
15 Hulspas R，Tiarks C，Reilly J，et al.In vitro cell density-dependent clonal growth of EGF-responsive murine neural progenit or cells under serum-free conditions.Exp Neuro 1997; 148（2）：147-156
16 Roellink H. Floor plate and motor neuron induction by vhh-1，a vertebrate homologue of hedgehog expressed by the notochord.Cell 1994; 76：761-775
17 Lendahl U.Gene regulation in the formation of the central nervous system.Acta Paediatr Suppl 1997; 422（1）：8-11
18 Roussa E，Krieglstein K. GDNF promotes neuronal differentiation and dopaminergic development of mouse mesencephalic neurospheres.Neurosci Lett 2004; 361（1）：52-55
19 Ju HY. Zhongguo Shiyan Zhenduanxue 2006; 10(2):205-207
鞠海英.胶质细胞源性神经营养因子的生物学研究[J].中国实验诊断学,2006,10(2):205-207
20 Peng CH, Dai JB, Tian YH, et al. Zhongguo Zuzhi Huaxue yu Xibao Huaxue Zazhi 2005；14（4）：448-451
彭超华,戴冀斌,田毅浩,等. 抗坏血酸对IL-1β体外诱导中脑神经干细胞分化为酪氨酸羟化酶阳性神经元作用的实验研究[J].中国组织化学与细胞化学杂志，2005，14（4）：448-451