1泸州医学院组织胚胎学教研室，四川省泸州市 646000；2青海医学院，青海省西宁市 810001

韩济南★，男，1978年生，吉林省长春市人，汉族，泸州医学院在读硕士，主要从事干细胞培养与应用研究。
hanjinan5080@yahoo.com.cn

通讯作者：吴绍华，教授，硕士生导师，泸州医学院组织胚胎学教研室，四川省泸州市 646000

中图分类号: R394.2
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)03-00429-04

收稿日期: 2007-09-14
修回日期：2007-10-28
(07-50-9-5055/GW Q)

Biological properties of human mesenchymal stem cells by the whole bone marrow culture method in vitro

Ａｂｓｔｒａｃｔ

ＡＩＭ: At the present stage, most researchers usually use animals as cultured materials to observe the growth characteristics of bone marrow mesenchymal stem cells. But the cultivation of human bone marrow mesenchymal stem cells is few. In this experiment, we cultured human bone marrow mesenchymal stem cells and established a stable cultural method.
ＭＥＴＨＯＤＳ:We performed the experiments at the Central Laboratory of Luzhou Medical College from March to September 2007. The Laboratory is province's key Laboratory. ①Aborted fetuses were six month and above provided by Luzhou Maternity Hospitals. Puerperants and their family members signed an informed consent. The experimental procedures were approved by the hospital ethics committee. ②We applied the whole bone marrow culture method to culture bone marrow mesenchymal stem cells and purified the cells through differential adherent time. ③Morphology and biological characteristics of bone marrow mesenchymal stem cells were observed under an inverted phase contrast microscope. Cell activity was indirectly detected by MTT method.
ＲＥＳＵＬＴＳ: After 4-hour culture, mesenchymal stem cells had begun to adhere, the cell body into the circular-shaped or triangular irregular; In 2-4 days, bone marrow mesenchymal stem cells extended 2-3 short processes to the two ends; Cell morphology graded at this time of the spindle, a fibroblast-like growth, and accumulated colony. With the growth of cells, adherent cells were gradually showed backbone, vortex growth, cell neurite growth, enlargement, and issued a fine of more branches, intertwined processes could be inter-network. At day 7, cell were seen adherent 70% to 80% the wall of the culture flask; Cell were close and tight, and mesenchymal stem cells became monolayer. Haematoxylin-eosin showed that more longer spindle cells appeared, with a protruding branch, larger cell body, a larger nuclear was elliptical, to assume pale; many nucleoli were found, and cytoplasm was salmon pink. ②Mesenchymal stem cell surface marker CD44 immunohistochemical detection showed that the cell membrane appeared brown positive reaction. ③MTT assay showed that there was no significant difference in absorbance in 2, 3, 4, 5, 6 passages of cells in the 490 nm wavelength by enzyme-labeled instrument, but the absorbance was higher than 7 or 8 passage of cells.
ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ:We successfully cultivated human fetal mesenchymal stem cells by the whole bone marrow culture method, and found that the 3-6 passages of cells had high purity and good activity.

Han JN, Xu FC, Hou YQ, Wu SH.Biological properties of human mesenchymal stem cells by the whole bone marrow culture method in vitro.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(3):429-432(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-3/3k-429(ps).pdf]

摘要
目的：现阶段多以动物为材料培养观察骨髓间充质干细胞的生长特性，对人骨髓间充质干细胞培养和生长特性的研究相对较少。为此实验培养人骨髓间充质干细胞，拟建立稳定的培养方法。
方法：实验于2007-03/09在泸州医学院中心实验室省级重点实验室完成。①实验材料：6个月以上流产胎儿由泸州地区妇产医院提供，产妇及家属对实验知情同意，并经医院伦理委员会批准。②实验方法：应用全骨髓培养法培养人骨髓间充质干细胞，采用差速贴壁对细胞进行纯化。③实验评估：倒置相差显微镜下观察骨髓间充质干细胞形态及生物学特点，应用MTT法间接测定骨髓间充质干细胞活性。
结果：①培养4 h,见骨髓间充质干细胞已开始贴壁，胞体由圆形变为不规则形或三角型，培养第2~4 天，见间充质干细胞胞体向两端伸出二三个粗短突起，此时细胞形态渐变为梭型，呈成纤维细胞样生长，并聚集成集落；随着细胞的生长，贴壁细胞逐渐表现为脊梁状、旋涡状生长，细胞突起增长、增粗，并可发出更细的分支，突起间可相互交织成网。培养7 d时，见细胞铺满瓶壁面积的70%~80%，细胞排列紧密，此时骨髓间充质干细胞铺成单层。苏木精－伊红染色见细胞多为长梭型，有突起及分支，胞体较大，核一个，较大，呈椭圆，着色浅，可见多个的核仁，胞质浅红色。②骨髓间充质干细胞表面标志CD44免疫组织化学检测，可见胞膜出现棕黄色阳性反应。③MTT法分别检测结果显示，2~6代细胞于酶标仪490 nm波长处 吸光度值无明显差异，但均高于七八代细胞。
结论：利用全骨髓培养法成功地培养出人胎儿骨髓间充质干干细胞，且第3~6代细胞纯度高、活性好。
关键词：体外培养；骨髓间充质干细胞；纯度；活性

韩济南，徐富翠，侯艳秋，吴绍华.体外全骨髓法培养人骨髓间充质干细胞的生物学性状[J].中国组织工程研究与临床康复，2008,12 (3):429-432 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-3/3k-429(ps).pdf]

0 引言

骨髓间充质干细胞是存在于骨髓腔内的一种干细胞，具有强大的增殖能力和可被诱导为其它细胞的潜能。骨髓间充质干细胞最初由Friedenstein等在1968年发现并报道，骨髓含中有一类易于贴附于塑料培养板表面的成纤维样细胞并且能克隆性生长的细胞即骨髓间充质干细胞。以后的研究中陆续发现，不同的诱导条件可使其向成骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、神经细胞、上皮细胞转化[1-3]，被认为是一种理想的组织工程种子细胞[4]。骨髓间充质干细胞的基础研究表明：骨髓间充质干细胞能分泌干细胞生长因子、白血病抑制因子及碱性成纤维细胞生长因子等多种细胞活性因子[5-8]，可作为其它细胞培养的饲养层细胞。同时骨髓间充质干细胞还可调节机体对同种移植的排斥反应[9-13]。骨髓间充质干细胞这些特性使其具有广阔的研究前景和临床应用价值。现阶段人们对骨髓间充质干细胞的研究通常以动物材料居多，对人的骨髓间充质干细胞的培养和生长特性的研究相对较少。

1 材料和方法

设计：单一样本观察。
单位：泸州医学院组织学与胚胎学教研室。
材料：实验于2007-03/09在泸州医学院中心实验室省级重点实验室完成。孕6个月以上流产胎儿由泸州地区妇产医院提供，产妇及家属对实验知情同意，实验经医院伦理委员会批准。主要试剂：DMEM(GIBCO)，胎牛血清（成都哈里生物公司），胰蛋白酶（Sigma公司），CD44单克隆抗体（北京中杉公司），SABC法即用型二抗试剂盒（武汉博士得生物公司）。
设计、实施、评估者：实验设计由第二作者完成，实施为第一及第三作者，评估为通讯作者完成，采用盲法评估。均经过相关实验内容培训。
方法：
取流产4 h内胎儿双侧股骨，置于已加缓冲液的无菌培养皿内去除贴附在骨表面的肌肉，无菌冲洗后剪断两骨垢，用吸取DMEM的注射器冲洗骨髓腔入离心管中，反复吹打后 1 000 r/s离心8 min，去上清，加入含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，调整细胞浓度为 6×108 L-1接种，培养4 h后，换液去除悬浮的血细胞等未贴壁细胞。将细胞置于37 ℃恒温、5%CO2的孵箱内，每隔3 d换液。
细胞传代：细胞铺满培养瓶底70%~80%时传代，传代前24 h细胞换液。吸除废液，PBS冲洗，加含有EDTA的胰酶消化2 min,加 Hank’s终止消化，吹打使细胞重悬，离心，按1∶2的比例传代，4 h换液去除未贴壁细胞使骨髓间充质干细胞进一步纯化，置37 ℃孵箱，以后每3 d换液。
MTT法间接测定每代骨髓间充质干细胞活性：用加血清的DMEM将骨髓间充质干细胞浓度调整为5×107 L-1细胞，并接种在96孔板，每孔200 mL。CO2孵箱孵育3 d，每孔加20 mL 5 g/L的MTT，37 ℃孵育4 h，吸除培养基每孔加150 mL的二甲基亚砜10 min，置酶标仪上选择490 nm波长测吸光度值。
细胞表面标志物CD44免疫组织化学染色：

取出爬片用PBS洗涤2次后，用4%多聚甲醛固定30 min，PBS再洗涤后，加入H2O2封闭以消除内源性过氧化物酶，PBS再洗涤后，山羊血清封闭，室温20 min，滴加一抗CD44。置4 ℃过夜，PBS洗涤，滴加二抗，置湿盒45 min，ABC复合物，37 ℃湿盒孵育l h，PBS洗涤，DAB溶液显色，脱水透明，中性树胶封固，普通光镜观察。
倒置相差显微镜观察骨髓间充质干细胞形态及生物学特点，并拍照记录；苏木精-伊红染色。
主要观察指标：① 倒置显微镜下细胞生长情况及细胞形态。②细胞活性检测。⑧显微镜观察细胞苏木精-伊红染色。④细胞表面标志物CD44免疫组织化学染色。

2 结果

2.1 骨髓间充质干细胞生长状况 骨髓细胞培养4 h,见间充质细胞已开始贴壁，胞体由圆形变为不规则形或三角型，而圆形血细胞此时仍呈悬浮状态，更换培养液，多数不贴壁的血细胞被筛选掉。培养第2~4 d，见间充质细胞胞体向两端伸出二三个粗短突起，此时细胞形态渐变为梭型，呈成纤维细胞样生长，并聚集成集落；随着细胞的生长，贴壁细胞逐渐表现为脊梁状、旋涡状生长，细胞突起增长、增粗，并可发出更细的分支，突起间可相互交织成网。培养7 d时，见细胞铺满瓶壁面积的70%~80%，细胞排列紧密，此时骨髓间充质干细胞铺成单层，但可见少量圆形细胞贴附在骨髓间充质干细胞细胞层上，见图1。细胞培养7 d后进行第1次传代，应用差速贴壁法，4 h换液，去掉悬浮的死亡或未贴壁细胞，然后3 d换液。传代细胞培养 5 d后铺满瓶壁面积的70%~80%，可见骨髓间充质干细胞层均为长梭形细胞，已不见圆形细胞，见图2。常规细胞传代方法，当细胞传至第7代时，细胞生长缓慢，较长时间培养细胞也不能铺满培养瓶底。倒置显微镜下观察细胞，见细胞排列杂乱，细胞轮廓增强，色泽变暗，胞膜不光滑，胞质内有暗的颗粒样结构，细胞突起边缘可见脱落，出现细胞老化现象。

2.2 细胞的苏木精-伊红染色及免疫组织化学染色 苏木精-伊红染色见细胞多为长梭型，有突起及分支，胞体较大，核一个较大，呈椭圆，着色浅，可见多个的核仁通常为2~4个，胞质浅红色，见图3。骨髓间充质干细胞表面标志CD44免疫组织化学检测，可见胞膜出现棕黄色阳性反应，见图4。

2.3 细胞活力的检测 MTT法分别检测2、3、4、5、6、7、8代细胞活力，结果显示2、3、4、5、6代细胞于酶标仪490 nm波长处 吸光度值无明显差异，但均高于七八代细胞，见图5。

3 讨论

3.1 取材及培养方法的选择 人体的不同年龄阶段间充质细胞数量及活性会有一定的差别，并且随着年龄的增加或体质的衰弱,细胞的数量逐渐减少[14]。骨髓间充质干细胞在骨髓内的含量是比较少的,在每105~106 细胞里有1个。本实验材料选择流产的胎儿，以获得更多的骨髓间充质干细胞。骨髓间充质干细胞的分离培养方法通常分为二种：一种是保留造血干细胞的方法，另一种是去除造血干细胞的方法[15]。后一种方法又称为离心法。本实验采取第一种方法，又称为全骨髓培养法[16]。同离心法相比较全骨髓培养法具有操作方法简便，实验步骤少，减少污染机会。同时避免离心对细胞造成损伤，节省经费等优点。

3.2 细胞纯度 对骨髓间充质干细胞体外诱导及作为饲养层细胞都对细胞的纯度有较高的要求。骨髓内含有多种细胞，包括血细胞、造血干细胞、血管内皮细胞等。实验中应用骨髓间充质干细胞能较早的贴壁特点可去除悬浮大部分杂细胞，在第1次传代时不能贴壁生长的血细胞被筛选掉，造血干细胞和血管内皮细胞在缺乏生长因子的条件下不能长期存在而自行死亡或退变[17]。因此在第2代后可获得较高纯度的骨髓间充质干细胞。
3.3 骨髓间充质干细胞的鉴定 骨髓间充质干细胞缺少特异性表面标志物，对其鉴定只能结合其形态和贴壁特点。实验过程中发现培养细胞呈典型的成纤维细胞样改变，且贴壁时间快。苏木精－伊红染色观察细胞呈长梭形并有分支的典型骨髓间充质干细胞形态特点；Shahdadfar等[18]研究得出骨髓间充质干细胞细胞膜表达CD13、CD44、CD90、CD105表面蛋白，而本实验选择骨髓间充质干细胞表面标志物CD44作细胞免疫组织化学染色间充质呈阳性反应。综合以上结果可以得出所培养细胞为骨髓间充质干细胞。
3.4 细胞活力 影响体外培养细胞活性是多方面的，包括取材及培养时间等。通常体外培养的细胞有一个自然衰老的过程。而针对骨髓间充质干细胞的各种实验要求其具有较好的活性。材料来源的种属不同可影响体外培养细胞的活性，文献报道小鼠的骨髓间充质干细胞当培养至5代细胞即出现老化现象[19]，与鼠相比较人胎儿的骨髓间充质干细胞 体外培养能较长时间保持高活性。细胞体外培养过程传至第7代镜下观察细胞出现老化现象；为进一步检测细胞活性，采用MTT法检测每代细胞内线粒体脱氢酶，可间接地反映出该代细胞的活性。同时在实验过程中发现原代骨髓间充质干细胞贴壁时间及生长速度较传代细胞慢，推测可能是所选取实验材料不是在活体的情况下取材，缺血缺氧的环境下对间充质细胞产生损伤，当原代培养骨髓间充质干细胞时需要一个自我修复的过程。另一个因素为骨髓腔内含有大量的血细胞会影响骨髓间充质干细胞的贴壁。
本实验成功地对人的骨髓间充质干细胞进行了培养，并从取材、分离、纯化、培养等方面进行了阐述，为对人的骨髓间充质干细胞进一步研究奠定基础，提供了理论依据。通过本实验得出；在骨髓间充质干细胞第3，4，5，6时细胞纯度及活性最高。

4 参考文献

1 Bianco P,Gehron RP. Marrow stromal stem cell.Clin Invest 2000；105(12)：1663-1668
2 Paunescu V, Deak E, Herman D,et al. In vitro differentiation of human mesenchymal stem cells to epithelial lineage. J Cell Mol Med 2007; 11(3): 502-508
3 Muraglia A, Cancedda R, Quarto R. Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model.J Cell Sci 2000;113 ( Pt 7):1161-1166
4 Liu W,Cui L,Cao Y. Bone reconstruction with bone marrow stromal cells.Methods Enzymol 2006；420:362-380
5 Azizi SA,Stokes D,Augelli BJ,et al. Engraftment and migration of human bone marrow stromal cells implanted in the brains of albino rats--similarities to astrocyte grafts. Proc Natl Acad Science USA 1998;95（7）:3908-3913
6 Dormady SP,Bashayan O,Dougherty R,et al. Immortalized multipotential mesenchymal cells and the hematopoietic microenvironment..J hematother Stem Cell Res 2001;10(1):115-119
7 Kincade PW,Lee G,Pietrangeli CE. Cells and molecules that regulate B lymphopoiesis in bone marrow. Annu Rev Lmmunol 1989;7:111-143
8 Liu Y，Zhang X， Chen XH，et al. Chongqing Yixue 2005；34（9）：1321-1323
刘耀，张曦，陈幸华，等.骨髓基质细胞与人脐血基质细胞表达造血生长因子的实验研究[J].重庆医学，2005，34（9）:1321-1323
9 Le Blanc K, Rasmusson I, Sundberg B，et al. Treatment of severe acute graft-versus-host disease with third party haploidentical mesenchymal stem cells. Lancet 2004;363（9419）:1439-1441
10 Aggarwal S, Pittenger MF. Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses. Blood 2005;105（4）:1815-1822
11 Di Niccola M, Carlo-Stella C, Magni M，et al. Human bone marrow stromal cells suppress T-lymphocyte proliferation induced by cellular or nonspecific mitogenic stimuli. Blood 2002;99（10）:3838-3843
12 Krampera M, Glennie S, Dyson J et al. Bone marrow mesenchymal stem cells inhibit the response of naive and memory antigen-specific T cells to their cognate peptide. Blood 2003;101（9）:3722-3729.
13 Koc ON, Gerson SL, Cooper BW，et al. Rapid hematopoietic recovery after coinfusion of autologous-blood stem cells and culture-expanded marrow mesenchymal stem cells in advanced breast cancer patients receiving high-dose chemotherapy. J Clin Oncol 2000;18（2）:307-316
14 Colter DC, Class R, DiGirolamo CM ，et al.Rapid expansion of recycling stem cells in cultures of plastic-adherent cells from human bone marrow.Proc Natl Acad Sci 2000；97（7）：3 213-3 218
15 Wei XF，Liu KY.Inhibitory effects of human bone marrow mesenchymal stem cells and cord blood mononuclear cells on mixed lymphocyte response and PHA induction transformation.Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi 2004；12(3)：261-264
16 Martin I,Shastri VP,Padera RF,et al.Selecitve differentiatikon of marmmalian bone marrow stromal cells cultured on three-dimension-al polymer foams. J Bionmed Mater Res 2001；55(2)：229-235
17 Feng LL，Wang JC，Li ZZ.Zhonghua Xiandai Zhongxiyi Zazhi 2004；2（5）：399-400
冯琳琳，王金成，李志洲.骨髓基质细胞的培养与保存方法 [J].中华现代中西医杂志，2004，2(5)：399-400
18 Shahdadfar A,Fronsdal K,Haug T,et al.In vitro expansion of human mesenchymal stem cells:choice of serum is a determinant of cell proliferation,differentiation, gene expression,and transcriptome stability.Stem Cells 2005;23(9)：1357-1366
19 Qu Y，Li Y，Liu HM.Beihua Daxue Xuebao 2004；5（2）：124-126
曲芸，李燕，刘惠民.大鼠骨髓基质细胞培养的实验研究[J].北华大学学报，2004，5(2):124-126