1连云港市第一医院东方医院暨连云港市涉外医院骨科，江苏省连云港市 222042； 2兰州大学第二医院骨科研究所，甘肃省兰州市 730030

冯万文★，男，1968年生，山东省济宁市人，汉族，2006年兰州大学临床医学院毕业,硕士，主治医师，主要从事创伤骨科、关节外科和组织工程的研究。
wwfeng1968@
sohu.com

中图分类号: R394.2
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)03-00442-05

收稿日期：2007-07-02
修回日期：2007-11-20
(07-50-7-3660/M Q)

Characteristics of co-culture of autogenic bone marrow mesenchymal stem cells with chondrocytes as seed cells and in vivo chondrogenic activity

Ａｂｓｔｒａｃｔ

ＡＩＭ: Tissue engineering technique brings a new approach to repair articular cartilage defects. There was no ideal seed cell for cartilage tissue engineering. We investigate the feasibility of articular cartilage defects repaired with co-cultures of autogenic bone marrow mesenchymal stem cells with chondrocytes as seed cells, and evaluate repaired outcomes.
ＭＥＴＨＯＤＳ:Experiments were performed at the Laboratory of Tissue Engineering and Institute of Orthopaedics of Lanzhou University and Laboratory of Orthopaedics of Lianyungang Dongfang Hospital from March 2005 to February 2006. ①Two-passaged bone marrow mesenchymal stem cells and chondrocytes (3×108 L-1) were collected and then co-cultured at a ratio of 2 to 1 as seed cells. Extracellular matrix and proliferation of co-cultures were observed. Proliferative curve of the seed cells was drawn. ②3×108 L-1 co-cultured cells were incubated with allogenic demineralized bone matrix in 24-well plate for 2, 4 and 6 days. Adhesive rate of co-cultures into allogenic demineralized bone matrix were detected. ③Totally 54 pigmented rabbits were made into models of articular cartilage defects in the knee joints. They were divided into experimental, demineralized bone matrix control and blank control groups, with 18 in each group. Rabbits in the experimental group were implanted with allogenic demineralized bone matrix and co-cultured cells; rabbits in the demineralized bone matrix control group were implanted with demineralized bone matrix only; rabbits in the blank control group did not receive any intervention. Repaired tissues were evaluated with macroscopic views, histological scores and immunohistochemical stains at weeks 6 and 12 after transplantation.
ＲＥＳＵＬＴＳ:Fifty-four pigmented rabbits were involved in the result analysis. ①Co-cultured chondrocytes was rich in extracellular matrix and proliferated promptly. Adhesive rate of co-cultures into allogenic demineralized bone matrix were （46.50±1.40）%，（93.25±2.89）% and（88.34±0.76）% at 2, 4 and 6 days after co-culture respectively. ②In the experimental group, repaired tissues represented hyaline-like, smoothness and flat. Chondrocytes in the zones of integrating with peripheral native cartilages were more mature, repaired tissues integratinged with subchondral bones firmly. Repaired tissues were fibers and no repair in the demineralized bone matrix control group and the blank control group. ③Histological scores were higher in the experimental group than the demineralized bone matrix control group and the blank control group (P < 0.01). There was no significant difference between the demineralized bone matrix control group and the blank control group (P > 0.05). ④Immunohistochemical stains showed that cells repaired tissues were hyaline cartilage-like cells, arranged columnnedly，riched in type Ⅱcollagen matrix and integrated satisfactorily with native adjacent cartilages and subchondral bones in the experimental group.
ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ:Co-cultures of autogenic bone marrow mesenchymal stem cells with chondrocytes can promote proliferation of chondrocytes and production of chondral matrix. Co-cultures as seeding cells can save a number of chondrocytes, shorten culturing periods and reduce subcultured times. Co-cultures as seeding cells embedded into demineralized bone matrix can repair articular cartilage defects effectively.

Feng WW, Lai ZJ, Li XM, Chang LW, Xu YL, Zhang L, Wang XH, He XH, Xia YY, Dang YX, Wu M, Sun ZY, Jin BY, Li XD.Characteristics of co-culture of autogenic bone marrow mesenchymal stem cells with chondrocytes as seed cells and in vivo chondrogenic activity.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(3):442-446(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-3/3k-442(ps).pdf]

摘要
目的：组织工程技术为解决关节软骨缺损修复这一难题提供了新的思路，但至今尚无一种细胞能完全满足软骨组织工程对种子细胞的要求。探讨以自体骨髓间充质干细胞与软骨细胞共培养为种子细胞修复关节软骨缺损的可行性，并评价修复效果。
方法：实验于2005-03/2006-02在兰州大学骨科研究所组织工程实验室和连云港市东方医院骨科实验室完成。①取浓度为3×108 L-1的第2代骨髓间充质干细胞和软骨细胞，按2:1比例混匀共培养作为种子细胞，观察细胞的增殖和基质合成，绘制细胞生长曲线。②将细胞终浓度为3×108 L-1的共培养细胞加入含有同种异体脱钙骨基质的24孔培养板中进行接种培养2，4，6 d，计算共培养细胞与脱钙骨基质的黏附率。③取54只青紫兰兔制备全层关节软骨缺损模型，随机分为实验组、脱钙骨基质对照组、空白对照组，每组18只。实验组于软骨缺损处植入同种异体脱钙骨基质与共培养细胞；脱钙骨基质对照组植入脱钙骨基质；空白对照组不作任何植入。移植术后6，12周取出膝关节对修复组织进行大体、组织学评分和免疫组织化学观测。
结果：54只青紫兰兔均进入结果分析。①共培养的软骨细胞基质合成丰富，细胞增殖加快。脱钙骨基质与骨髓间充质干细胞和软骨细胞共培养第2，4，6天的黏附率分别为（46.50±1.40）%，（93.25±2.89）%和（88.34±0.76）%。②大体观察结果：实验组缺损修复组织呈软骨样，表面光滑平坦，与周围软骨整合的软骨细胞更为成熟，修复组织与软骨下骨结合牢固。脱钙骨基质对照组、空白对照组的修复组织呈纤维组织和无修复。③组织学评分：实验组优于脱钙骨基质对照组、空白对照组，差异具有显著性意义（P﹤0.01），脱钙骨基质对照组与空白对照组比较差异无显著性意义（P﹥0.05）。④免疫组织化学染色显示实验组修复组织的细胞为透明软骨样细胞，柱状排列，Ⅱ型胶原染色阳性，与周围软骨及软骨下骨整合良好。

结论：自体骨髓间充质干细胞与软骨细胞共培养作为种子细胞，骨髓间充质干细胞能增强软骨细胞的增殖，促进软骨细胞基质合成，缩短软骨细胞培养时间和减少传代次数，可节省大量的软骨细胞，与脱钙骨基质复合后能有效修复关节软骨缺损。
关键词：骨髓间充质干细胞；软骨细胞；共培养；种子细胞；脱钙骨基质；关节软骨修复

冯万文，莱浙军，李小民， 常伶文，徐毓林，张 丽，王晓红，何向红，夏亚一，党跃修，吴萌，孙正义，靳白玉，李向东.骨髓间充质干细胞和软骨细胞共培养种子细胞特征及体内成软骨活性[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(3):442-446
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-3/3k-442(ps).pdf]

0 引言

关节软骨缺损自身不能有效修复，组织工程技术为解决这一难题提供了新思路，但软骨细胞来源不足严重制约了其应用[1]。以自体软骨细胞作为种子细胞，取材部位受限，软骨细胞增殖能力低，传代培养容易引起老化和去分化[2]，而成体骨髓中骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）含量少，随传代次数的增多，成软骨潜能明显降低，Rubio等[3]研究证实BMSCs多次传代培养有致瘤倾向。本实验应用自体骨髓间充质干细胞和软骨细胞共培养为种子细胞，复合同种异体脱钙骨基质（demineralized bone matrix，DBM）修复兔膝关节软骨全层缺损，并对修复组织进行评价，为优化和扩大种子细胞源提供实验依据。

1 材料和方法

设计：实验按随机分组设计，对比观察动物实验。
单位：兰州大学骨科研究所组织工程实验室和连云港市东方医院骨科实验室。
材料：实验于2005-03/2006-02在兰州大学骨科研究所组织工程实验室和连云港市东方医院骨科实验室完成。选择清洁级6~12个月龄的青紫蓝兔54只，体质量1.5~2.0 kg，雌雄不限（实验动物合格证号：14-2004），由卫生部兰州生物制品研究所提供。
DMEM培养基（美国Gibco），胎牛血清（FBS）（杭州四季青生物公司），CO2孵育箱（恒温培养箱，日本Sony公司），胶原酶（Sigma公司），相差显微镜（日本BH-2型Olympus显微镜），扫描电子显微镜（JSM-680LA型，日本电子公司），Ⅱ型胶原免疫试剂盒（武汉博士德生物公司）。
设计、实施、评估者：实验设计为第一作者，实验资料收集和实施为全部作者，评估为第一作者，采用盲法评估，评估者经过正规培训。
方法：
BMSCs与软骨细胞共培养：分别吸取实验室培养的细胞浓度为3×108 L-1第2代BMSCs和软骨细胞，按2∶1的体积比例混匀作为共培养组，取同代相同浓度的软骨细胞作为单独软骨细胞培养组，取低浓度软骨细胞 1×108 L-1（与共培养组中软骨细胞终浓度相同）作为低浓度单独软骨细胞培养组，用含15%FBS的DMEM培养基在37 ℃饱和湿度条件下的二氧化碳孵育箱中分别进行共培养和单独培养，相差显微镜下观察细胞的增殖和基质合成，对共培养细胞爬片进行番红-O染色，并绘制3组培养细胞的生长曲线；向3组消化培养液中加入显色剂1,9-二甲基亚甲蓝混匀，测定3组培养细胞消化培养液中糖胺多糖(glycosaminoglycan,GAG)吸光度值,根据GAG标准曲线，测定各组细胞消化培养液的硫酸GAG的浓度。
共培养细胞在不同时间段与同种异体DBM体外黏附率的测定：将细胞终浓度为3×108 L-1的共培养细胞加入含有同种异体DBM的24孔培养板中进行接种培养，分2，4，6 d三个时间段，电镜观察共培养细胞与同种异体DBM的黏附，计数各时间段8个培养孔黏附的细胞数取平均值，计算共培养细胞与DBM的黏附率。
动物模型制备与实验分组：取青紫蓝兔膝关节内侧弧形切口，向外翻开髌骨暴露膝关节，于股骨滑车关节面上用φ4 mm钻头钻孔，深度3.0~4.0 mm穿透软骨下骨，有阻力感见新鲜血液溢出，造成全层关节软骨缺损模型。54只兔随机分为实验组、对照组和空白对照组，每组18只。实验组于软骨缺损处植入共培养细胞-DBM；对照组植入DBM；空白对照组不作任何植入。每组移植术后6，12周分别处死9只动物，取出膝关节对修复组织进行大体、组织学评分和免疫组织化学观测。
主要观察指标：①共培养细胞形态观察。②共培养细胞生长曲线。③糖胺多糖含量。④同种异体脱钙骨基质与共培养细胞的黏附率。⑤实验动物修复组织的大体观察。组织学评分和免疫组织化学观测。
统计学方法：由本文作者应用SPSS 12.0软件包对所有数据进行统计学处理，各组间差异采用单因素方差分析，P < 0.05认为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 实验动物数量分析 参加实验的54只动物无脱落，均纳入结果分析。
2.2 共培养细胞形态观察 共培养细胞24 h后逐渐贴壁，软骨细胞呈椭圆形或三角形，大部分居混合细胞的中央，表面光滑，细胞体积变大，胞浆增多，细胞数量多增殖旺盛，细胞外基质合成丰富被番红-O均匀染色; BMSCs体积无明显增大，散在于共培养细胞中，表面呈成纤维细胞样染色阴性，所占比例逐渐降低。共培养5~ 7 d，软骨细胞与BMSCs的比例维持在1∶2以上（图1）。

2.3 共培养细胞的生长曲线 BMSCs和软骨细胞共培养，细胞6~8 h即可完成贴壁，24 h后增殖迅速，约5 d增殖达平台期，细胞平均倍增时间3 d；单独软骨细胞培养组细胞平均倍增时间为7 d；低浓度单独软骨细胞培养组与共培养组中软骨细胞浓度相同，而细胞平均倍增时间约为8 d；3组细胞的生长曲线（图2）。

2.4 GAG含量测定 共培养组消化培养液中GAG含量明显高于单独软骨细胞培养组和低浓度单独软骨细胞培养组[（81.00±3.52）mg/L，（61.67±6.71）mg/L，（20.33±2.50）mg/L，P < 0.01], 单独软骨细胞培养组消化培养液中GAG含量高于低浓度单独软骨细胞培养组（P < 0.01）。
2.5 同种异体DBM与共培养细胞的黏附率 共培养细胞与DBM接种培养时，细胞呈梭形开始贴附在DBM材料表面，逐渐向孔内延伸；培养至第2天，可见有更多的细胞贴附于网架上，向四周伸出伪足，部分细胞间伪足相互接触合呈糊状,分泌的细胞外基质包绕于细胞周围，黏附率为(46.50±1.40)%；第4天黏附率最高,为(93.25±2.89)%，细胞伸出伪足钻入DBM孔隙中，大量的细胞交织成网或互相叠加并紧密黏附于DBM上（图3），与共培养后第6天[（88.34±0.76）%]比较差异无显著性，继续培养黏附率有下降趋势。

2.6 大体标本观察 术后所有动物切口愈合良好，关节液清亮，关节腔无粘连、滑膜增生、关节游离体及骨赘形成。实验组：术后6周缺损区已由半透明、淡红色组织填充，边界模糊，表面光滑；12周与周围软骨及软骨下骨结合牢固，色泽相近，表面平整（图4）。对照组：6周缺损区修复组织为乳白色，表面不光整，部分仍呈空洞；12周为纤维性修复。空白对照组：6周缺损区无修复；12周软骨缺损周围呈虫蚀样改变。

2.7 组织学观察 实验组：术后6周修复组织细胞较多，以圆形透明软骨样细胞为主，有软骨陷窝，表层有梭形成纤维样细胞，与周围软骨结合，基底部较多新生骨形成；12周修复组织为透明软骨样，厚度接近正常，与周围软骨结合好，深层软骨钙化，与底层骨结合紧密，基质着色正常，未见DBM残留（图5）。对照组：6周缺损组织细胞较少，细胞层次排列差；12周修复组织菲薄，呈纤维样，与周围软骨未结合，基底部有少量新生骨组织。空白对照组：6~12周缺损区无修复组织。参照Pineda等的评分标准[4]，各组动物组织学评分结果：术后6周和12周实验组评分均优于对照组、空白对照组（P﹤0.01），对照组、空白对照组间差异无显著性意义（P﹥0.05）。

2.8 免疫组织化学观察 术后16 周时实验组修复组织中细胞呈圆形或椭圆形，形体大柱状排列，与周围软骨及软骨下骨整合良好，细胞质和细胞外间质中Ⅱ型胶原染色阳性，出现棕黄色颗粒（图6）；对照组、空白对照组修复组织未出现黄染的阳性区域。

3 讨论

细胞生物学和生物材料技术的发展，应用组织工程技术修复软骨缺损成为可能，而安全高效的种子细胞源是应用这一技术的前提和关键，但是至今尚无一种细胞能完全满足软骨组织工程对种子细胞的要 求[1,5]。近年广泛应用的诱导方法是利用各种生长因子诱导BMSCs成软骨分化，但生长因子用量大，成本高，并可能引起机体的不良反应，并且诱导后的细胞在动物皮下很难形成成熟的软骨组织，有研究表明软骨细胞可以作为BMSCs良好的诱导因素，为向软骨定向分化提供所需的诱导因子或微环境，并能促进BMSCs在体内非软骨环境中形成成熟的软骨组织[6]。本文通过BMSCs与软骨细胞体外共培养发现，共培养的软骨细胞比同代软骨细胞单独培养的体积大，软骨细胞功能活跃，增殖速度加快，有大量成熟的软骨陷窝形成和基质合成，说明BMSCs能促进软骨细胞的增殖和表型维持，同时BMSCs比例下降,表明软骨细胞微环境能诱导BMSCs向软骨细胞方向分化。Tsuchiya等[7]用人BMSCs与牛软骨细胞按不同比例混合进行共培养也发现，软骨细胞的增殖速度和细胞外基质的合成与BMSCs的比例呈正相关。因此，共培养使软骨细胞快速增殖，这就减少了软骨细胞的用量,且不必应用任何生长因子的诱导，也避免了为获取足够量的软骨细胞反复传代培养而引起的软骨细胞老化和去分化[2，8]，因此BMSCs和软骨细胞共培养对优化和扩大种子细胞源可能是一种实用的策略。
单独BMSCs在非软骨环境下并不能构建出软骨组织，而用20%以上的少量软骨细胞与BMSCs共培养可构建出成熟的工程化软骨，并且在软骨湿重、GAG含量和软骨特异性基质表达等方面都优于相同数量的软骨细胞构建的软骨，比用单独软骨细胞构建软骨组织可减少60%~80%的软骨细胞量,为解决软骨细胞来源不足提供了切实可行的途径[8-9]。研究表明BMSCs和软骨细胞共培养期间转化生长因子β3、骨形态形成蛋白2和胰岛素样生长因子 1等生长因子表达增加5.4~11.6倍不等，增强的活性因子介导软骨细胞旁分泌或自分泌，可能是促进软骨细胞增殖和表型维持的主要因素之一，Goldberg等[10]应用含血清和转化生长因子β的培养基分别培养软骨细胞进行比较，结果也显示转化生长因子β能使去分化的软骨细胞重新分化和维持的表型，但具体的信号传导及其途径尚不清楚。
应用BMSCs和软骨细胞共培养与DBM复合移植修复关节软骨缺损，修复组织内细胞形态类似于透明软骨细胞，细胞周围有软骨陷窝形成，免疫组织化学结果显示为Ⅱ型胶原纤维，证实了修复组织为透明样软骨，尤其是实验发现共培养复合物中的BMSCs分化为骨细胞直接与周围的软骨下骨进行骨与骨的整合，比单独培养的软骨细胞与软骨下骨结合更加牢固，但修复组织与周围正常软骨仍有差别，主要表现为细胞数量多且排列紊乱，术后12周细胞数量减少并出现柱状排列趋势，更接近正常软骨组织，可能是术后不限制关节活动，修复组织在局部应力作用下发生改建所致[11]。DBM对照组软骨缺损基底部也有新骨形成，是由于载体材料DBM的存在使髓腔或松质骨中的间充质干细胞驻留在损伤区底部，进而分化成少量骨组织[12-13]。
本文应用的同种异体DBM是经冷冻、脱脂脱钙、去蛋白处理得到的产物，抗原性消除或大大降低，且保留了诱导软骨形成的生长因子和胶原等基质，利于细胞增殖和分化。DBM为多孔海绵样结构，可提供宽大空间容纳大量的种子细胞，利于细胞黏附、细胞外基质沉淀、营养和氧气的进入以及代谢产物的排出[14]。本实验发现同种异体DBM与共培养细胞接种后，两种细胞能保持共培养前的形态，共培养后4 d黏附率达90%左右，表明DBM与种子细胞相容，而继续培养黏附率有下降趋势，可能是因为黏附于DBM的共培养细胞已达饱和而发生接触抑制现象，或增殖旺盛的共培养细胞及其产生的细胞外基质占据了过多的DBM空隙结构，从而影响了共培养细胞的营养获取和代谢物的排出等[15]，这也是应用共培养4 d的细胞-DBM复合物植入软骨缺损的实验依据之一。DBM植入缺损部位后第4周开始吸收，完全吸收需8~12周，而软骨形成需6~8周，因此DBM吸收和软骨形成几乎同步。同种异体DBM制备方法相对简便可大量获取，低温下可长期保存建立DBM骨库备用。因此，脱钙骨基质是一种理想的软骨组织工程支架材料。
BMSCs和软骨细胞共培养，两种细胞相互促进增殖和分化，作为种子细胞可减少软骨细胞增殖传代次数并节省软骨细胞数量，与DBM复合能有效修复关节软骨缺损，为优化种子细胞源提供了实验依据，但是共培养的两种细胞间相互作用的机制及其调节机制尚不清楚，并且本实验的动物模型是在正常关节面上造成缺损区进行的修复，有别于临床上常见的大面积不规则缺损，因此对这些问题需要进一步研究和改进。

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