低温保存神经干细胞复苏后移植对脊髓损伤大鼠轴突再生的影响：逆行示踪标记观察**★

低温保存神经干细胞复苏后移植对脊髓损伤大鼠轴突再生的影响：逆行示踪标记观察**★

杨永利，刘宏志，李佐文

杨永利★，男，1968年生，辽宁省调兵山市人，汉族，2006年中国医科大学毕业，硕士，副主任医师，主要从事脊髓损伤的基础与临床研究。
wyf_doctor@
163.com

教育部高校博士点专项科研基金项目（200601590
19）*;辽宁省自然科学基金资助项目（20052096）*

中图分类号: R651.2
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)03-00447-04

Effects of cryopreserved neural stem cell transplantation on rat axonal regeneration after spinal cord injury: Retrograde tracing observation

Ａｂｓｔｒａｃｔ

ＡＩＭ: There are some reports about the treatment of spinal cord injury with neural stem cells (NSCs) transplantation, but the ideas about the transplantation time and patterns and detection indexes are still different. In this study, the effects of cryopreserved NSC transplantation on the axonal regeneration after the spinal cord injury in rats were observed.
ＭＥＴＨＯＤＳ: The experiment was carried out in the experimental animal center of China Medical University from June 2005 to June 2006. ①Thirty-six adult Wistar rats, either male or female and 250-300 g, were provided by the experimental animal department of China Medical University. Neural stem cells were isolated from 10 neonate rats and cultured. All treatments for animals were accorded with the animal ethical criteria. ②NSCs at logarithmic phase were cryopreserved at -70 ℃ for 2 weeks and labeled with 5-bromodeoxyuridine (Brdu) after rewarming. After the models of spinal cord injury were established, the NSCs were transplanted into the injured site immediately. Thirty-six rats were randomly divided into NSC transplantation group, DMEM solution group, and control group. ③NSC survival and migration were detected by immunohistochemistry, and the reconstruction of spinal cord were detected by horseradish peroxidase (HRP) staining.
ＲＥＳＵＬＴＳ:Of the 36 spinal injured model rats, 4 died of overdose of anesthesia, and 5 died of infection, but all were supplemented. Brdu-labeled positive NSCs were detected in the injured spinal cord after transplantation on the 7th day, and increased on the 14th day, then gradually decreased since the 28th day till disappeared. The number of HRP positive cells in transplantation group was significantly higher than DMEM solution.
ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ:Cryopreserved NSCs can survive in the injured site after transplantation and promote the reconstruction of axoplasm pathway of injured spinal cord.

Yang YL, Liu HZ, Li ZW.Effects of cryopreserved neural stem cell transplantation on rat axonal regeneration after spinal cord injury: Retrograde tracing observation.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(3):447-450(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-3/3k-447(ps).pdf]

摘要
目的：关于神经干细胞移植治疗脊髓损伤的研究已有一些报道，对细胞移植的时间、方式以及检测的指标各有不同观点。实验观察了低温保存的神经干细胞复苏后移植对大鼠脊髓损伤后轴突再生的影响。
方法：实验于2005-06/2006-06在中国医科大学实验动物中心完成。①实验材料：选取Wistar成年大鼠36只，雌雄不限，体质量250~300 g，由中国医科大学实验动物部提供。新生大鼠10只，用作神经干细胞的分离与培养。实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：将获得的神经干细胞在处于对数生长期阶段-70 ℃冻存2周，复温后用5-溴脱氧尿嘧啶核苷法标记。制备大鼠脊髓损伤模型，伤后立即进行移植干预，实验分为3组：神经干细胞移植组、DMEM培养液填充组、空白对照组。③实验评估：应用免疫组织化学法观察移植细胞存活及迁移情况，行辣根过氧化物酶逆行示踪法观察脊髓损伤处轴浆运输的重建。
结果：36只脊髓横断损伤模型因麻醉过量死亡4只，感染死亡5只，予补足。复苏的神经干细胞经Brdu核标记后移植到脊髓损伤区，在损伤脊髓区域可检测到标记的阳性细胞。第7天可见，第14天增多，第28天逐渐减少并消失。辣根示踪技术显示神经干细胞移植组较DMEM培养液填充组阳性细胞明显增多，组间差异有统计学意义。
结论：低温保存的神经干细胞移植到脊髓损伤区域后可存活，并参与脊髓损伤处轴浆通路的结构重建。
关键词：脊髓损伤；神经干细胞；标记；轴突再生；低温保存

杨永利，刘宏志，李佐文.低温保存神经干细胞复苏后移植对脊髓损伤大鼠轴突再生的影响：逆行示踪标记观察[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(3):447-450 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-3/3k-447(ps).pdf]

细胞移植治疗脊髓损伤是神经科学领域的重要研究方向之一。神经干细胞的主要特征为增殖能力强，免疫原性低，利于进行细胞移植和基因调控[1-2]。同时神经干细胞因具有与脊髓组织同源、分化后易与宿主整合等特点，使其在中枢神经系统疾病的治疗方面具有重要意义[3-5]。本实验将分离培养的神经干细胞于-70 ℃冻存，复温后移植于大鼠损伤的脊髓，通过形态学方法观察移植细胞的存活、迁移，以及轴浆运输的重建，为神经干细胞移植治疗脊髓损伤提供实验依据。

设计：对照观察性实验。
单位：中国医科大学实验动物中心。
材料：实验于2005-06/2006-06在中国医科大学实验动物中心完成。选取Wistar成年大鼠36只，雌雄不限，体质量250~300 g，由中国医科大学实验动物部提供（许可证号：SCXK（辽）2003-0009）。新生大鼠10只，用作神经干细胞的分离与培养。将36只大鼠分成3组制作脊髓横断损伤模型。12只为神经干细胞移植组（A组），12只为DMEM培养液填充组（B组），12只作为空白对照组（C组）。实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。试剂：DMEM（Dulbecco's modified Eagle medium）/F12培养基、胰蛋白酶、胎牛血清（BSA）、二甲基亚砜（DMSO）；5－溴脱氧尿嘧啶核苷（Brdu）检测试剂盒、辣根过氧化物酶（HRP）检测试剂盒，DAB显色剂，二抗及SABC试剂盒。
设计、实施、评估者：设计、实施及评估为全部作者，均接受正规医学培训。
方法：
神经干细胞培养参见文后参考文献[6]。
神经干细胞的冻存与复苏：将含有体积分数为5%的二甲基亚砜(DMSO)和10%的小牛血清的高糖DMEM配成冻存液，调整神经干细胞的浓度为108 L-1，将冻存液与细胞移至冻存管中，梯度降温并移至 -70 ℃深低温冰箱中。2周后取出，以快速复温法在至37~42 ℃水浴中解冻，放入培养液中，吹打为细胞球，计算存活率。培养1周后调整细胞密度约为5×1010 L-1以备移植。
脊髓横断损伤模型的建立：参见文后参考文献[7]的方法，Wistar雄性大鼠，麻醉后打开椎板，无菌条件下用尖刀全横断T10节段脊髓，以鼠尾痉挛性摆动、双下肢瘫为损伤标准，缝合切口。脊髓损伤后第7天A组（12只）以微量注射器缓慢注入复苏后的神经干细胞悬液5 μL到脊髓断端；B组（12只）注入等量DMEM培养液，逐层缝合，术后每日膀胱挤尿；C组未制作脊髓损伤（空白对照组，12只）。术后因麻醉过量死亡4只，感染死亡5只，予补足。
Brdu及HRP示踪的免疫组织化学检测：移植后第7、14、28天取材，取材前36 h大鼠在麻醉下显露单侧的坐骨神经，用微量注射器将25%的HRP 3 μL缓慢注入坐骨神经束内，留针3 min，逐层缝合，术后常规腹腔注射抗生素。Brdu呈色：大鼠在深麻醉下，心脏灌流固定，取脊髓，包埋，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，磷酸盐缓冲液漂洗，胰酶滴片，胎牛血清封闭，弃封闭液，加入一抗Brdu小鼠抗大鼠单克隆抗体，二抗孵育30 min，PBS阻断内源性过氧化物酶，SABC液滴片，PBS液冲洗，DAB显色，苏木精复染，脱水，二甲苯透明，封固，镜下观察。HRP呈色：冰冻切片干燥，室温1 h，PBS阻断内源性过氧化物酶，室温10 min，PBS液洗，DAB显色，蒸馏水洗涤，苏木精复染，冲洗，脱水，二甲苯透明，封固，镜下观察。细胞标记及移植后Brdu标记细胞的迁移和HRP示踪下阳性细胞数量，二者可以反应出移植细胞的存活、迁移，以及轴浆运输的恢复程度。
主要观察指标：①细胞的培养与鉴定。②细胞标记及移植后Brdu标记细胞的迁移和HRP示踪下阳性细胞数量。
统计学方法：指标以x(_)±s表示，用SPSS 10.0统计软件作t 检验。P < 0.05表示差异有显著性意义。实验数据的统计学处理由第一作者完成。

2 结果

2.1 实验动物数量分析 36只脊髓横断损伤模型中，术后因麻醉过量死亡4只，感染死亡5只，予补足。
2.2 复苏神经干细胞的形态学观察复苏细胞平均存活率为61.5%，复苏早期的细胞胞体较小，折光性较好，细胞呈圆形，部分细胞有聚集生长的趋势。2 d后，死亡细胞增多，另有部分细胞胞体增大，折光性增强，出现分裂相，渐形成细胞构成的细胞团，7 d时形成较大的克隆球，见图1。

2.3 Brdu阳性细胞的检测神经干细胞移植组Brdu阳性细胞在移植术后第7天可检测到，为棕黄色核标记的细胞，见图2，临近损伤区阳性细胞增多，向头尾端及脊髓前后角放射状排列过程中阳性细胞趋于减少,远处可达1 cm。DMEM填充组及空白对照组均未见阳性细胞。第14天神经干细胞移植组Brdu阳性细胞平均每高倍镜视野阳性细胞数为14.5+5, DMEM填充组与空白对照组无阳性细胞，组间比较差别有统计学意义（P < 0.01）。移植术后第28天，随着细胞分化，神经干细胞移植组Brdu阳性细胞逐渐减少并消失。

2.4 HRP阳性细胞的检测神经干细胞移植组术后第 14天于近端可检测到少量的HRP阳性细胞，DMEM组未见有阳性细胞，空白对照组可见较多的阳性细胞，棕色颗粒定位于神经元的胞浆中。移植术后第28天，神经干细胞移植组的阳性神经细胞较多，见图3，平均每高倍镜视野阳性细胞数为（12.5+2.5）个，DMEM缓冲液组平均阳性细胞数为（2.0个+2.0）个，组间差别有统计学意义（P =0.006，P < 0.01）。

研究脊髓损伤的治疗目前包括:①应用药物及神经营养因子控制继发性损伤。②移植神经干细胞,嗅球鞘细胞,骨髓基质细胞，胚胎组织或基因调控的功能细胞并桥接损伤部位。③研究细胞信号的转导机制，刺激或调节细胞内生长锥的信号途径。④消除抑制脊髓再生的多种因素，如降解胶质瘢痕、消除抑制轴突再生的蛋白多糖等。⑤使脱髓鞘的轴突重新髓鞘化[8-10]。研究发现神经干细胞在移植到脊髓损伤区域后可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等，桥接脊髓断端并且重建神经传导通路，改善了损伤平面以下的运动及感觉功能[11-14]。Lu等[15]研究证实将神经干细胞在脊髓损伤后直接移植到大鼠的脊髓损伤区，可观察到脊髓神经营养因子表达的上调。有研究证明，将神经干细胞体外分化为星形胶质细胞后移植，可促进脊髓损伤区空洞的修复，并认为幼稚的星形胶质细胞与反应性的胶质瘢痕对脊髓的作用机制不同，胶质细胞对轴突的生长起到支持作用，而胶质瘢痕表面较多的硫酸软骨素蛋白多糖是轴突再生失败的主要原因。而将神经干细胞诱导分化为少突胶质细胞后移植到脊髓损伤区，可明显促进损伤区脱髓鞘神经的髓鞘化[16-18]。
本实验在将神经干细胞后移植到大鼠脊髓损伤区，并于伤后检测到移植的细胞存活、迁移。Brdu是胸腺苷类似物，可通过碱基互补配对的原则整合到处于S期的原始干细胞双链DNA中，在半保留复制过程中逐渐消减。Brdu标记简单、方便，检测手段与常规组化反应类似[19]。缺点在于随着移植后细胞的分化，标记强度逐渐减弱，无法追踪细胞的转归。本实验仅证实移植的细胞可以存活于脊髓损伤区域，并且可迁移到距离损伤断面1.0 cm的脊髓前、后角，随着标记强度的减弱，脊髓组织结构也趋于恢复，可以认为移植的细胞起到了一定的修复作用。HRP示踪始于70年代，机制系通过轴浆的逆行运输将标记物带到损伤处[20]。实验组在移植后4周检测到HRP阳性的神经细胞，而对照组未见有阳性细胞存在，表明神经干细胞在移植后可能通过桥接及分泌神经营养因子等方式重建脊髓结构，从而将损伤的神经传导通路重建。
本实验在形态学方面证实神经干细胞移植可促进轴浆运输的恢复，具体治疗机制及肢体功能的恢复还有待于深入研究。

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