1河北医科大学第四医院神经外科，河北省石家庄市 050012；2中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所，天津市
300020；3北京大学人民医院神经外科，北京市 100044

刘海英☆，男，1971年生，河北省石家庄市人，汉族，2006年河北医科大学毕业，博士，主治医师，主要从事干细胞移植研究。
liuhy1230@163.com

河北省自然科学基金资助项目 (302508)*

中图分类号: R743
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)03-00451-05

收稿日期: 2007-08-17
修回日期：2007-10-06
(07-50-8-4485/GW A)

Effect of human umbilical cord blood derived CD34+ cells transpantation on the neurological recovery of rats with cerebral ischemia

Ａｂｓｔｒａｃｔ

ＡＩＭ: CD34+ stem cells are unique primitive cell populations with the characters of self-renewal, multi-differentiation and reconstruction of hematopoietic and immune function. Recent studies have indicated that it has significant effect on myocardial ischemia and physically vascular occlusion. It is known that for a long time the clinical effects of cerebral ischemia were poor, so, we observe the neurological functional recovery after transplanting human umbilical cord blood derived CD34+ cells into rats with middle cerebral artery occlusion (MCAO), and detect the survival, migration and neural differentiation of CD34+ cells.
ＭＥＴＨＯＤＳ: The experiment was performed in the Institute of Hematology, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College since May 2002. ①Sixty adult male SD rats of 250-350 g were provided by the Fourth Department of Academy of Military Medical Sciences. All experimental procedures were accorded with the standards of animal ethics. Human umbilical cord blood was provided by cord blood stem cell bank of Tianjin and its application was agreed by the puerperas. ②Rats were randomly divided into three groups (n =20): CD34+ cells group, in which CD34+ cells were transplanted 24 hours after the establishment of models of MCAO using intraluminal thread approach; normal saline group, in which normal saline was injected 24 hours after the establishment of models; sham operation group, in which only models of MCAO were established. ③Functional outcome measurements were performed using the modified neurological severity score after transplantation. Meanwhile, the survival and migration of BrdU-labeled CD34+ cells and the expression of astrocytic marker-GFAP (glial fibriliary acidic protein) and the neuron marker-NeuN (neuronal nuclei) were detected by immunohistochemical and immunofluorescent staining.
ＲＥＳＵＬＴＳ:①There was no significant difference in the modified neurological severity score 24 hours after transplantation between CD34+ cell group and other groups (P > 0.05). From 1 to 4 weeks after operation, the neurological function of three groups showed improvement in different degrees, but the rats in CD34+ group had the best recovery (P < 0.05). ②The infarct volume of rats in CD34+ group had no significant decrease compared with the other two groups. ③Transplanted CD34+ cells survived in cerebral tissues of rats, and partial of them expressed GFAP or NeuN maker and migrated towards ischemic tissue.
ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ:CD34+ cells can survive,migrate and differentiate towards astrocytes or neurons after transplantation. Moreover, they improve the neurological recovery after MCAO.

Liu HY, Li JF, Li HJ, Zhang QJ, Han ZC.Effect of human umbilical cord blood derived CD34+ cells transplantation on the neurological recovery of rats with cerebral ischemia.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(3):451-455(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-3/3k-451(ps).pdf]

摘要
目的：CD34+造血干细胞具有自我更新、多向分化及重建长期造血和免疫的生物学功能，针对心肌缺血性损伤、肢体血管闭塞引起的组织缺血等治疗有显著的疗效。由于中枢神经系统缺血性损伤临床治疗康复效果不佳，观察人脐带血CD34+细胞移植对大鼠大脑中动脉栓塞后神经功能恢复的影响及CD34+细胞的存活、迁移以及向神经细胞分化的情况。
方法：实验于2002-05起在天津市中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所进行。①实验材料：雄性SD大鼠由解放军军事医学科学院第四研究所提供，体质量250~350 g，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。人脐带血由天津脐血干细胞库提供，产妇及家属对实验知情同意，并符合医学伦理学标准。②实验方法：将大鼠随机分为3组：CD34+细胞移植组：用线栓法建立大鼠左侧大脑中动脉栓塞模型后24 h移植CD34+细胞；生理盐水组：左侧大脑中动脉栓塞后24 h后注射等量的生理盐水；假手术组：仅行左侧大脑中动脉栓塞。③实验评估：采用改良神经功能损害评分观察大鼠神经功能恢复情况，应用免疫组织化学和免疫荧光双标记技术检测BrdU标记的CD34+细胞存活、迁移及其GFAP蛋白和NeuN蛋白的表达。
结果：①CD34+细胞移植组与其它各组在移植完成24 h 改良神经功能损害评分差异无显著性（P > 0.05）; 移植后1周到第4周，各组动物均有神经功能不同程度的恢复，CD34+细胞移植组神经功能恢复明显优于另两组（P < 0.05）。②CD34+细胞移植组与另两组比较，大鼠脑梗死体积无明显变化。③移植的CD34+细胞可在大鼠脑组织中存活，部分CD34+细胞同时表达GFAP蛋白或NeuN蛋白，并向缺血区域迁移。
结论：CD34+细胞可在大鼠脑缺血区域中存活、迁移并向星形胶质细胞或神经元分化，同时促进神经功能恢复。
关键词：胎血；CD34+细胞；脑缺血；移植；大鼠

刘海英，李建峰，李洪均，张庆俊，韩忠朝.人脐血CD34+细胞移植对局灶性脑缺血大鼠神经功能恢复的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(3):451-455 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-3/3k-451(ps).pdf]

0 引言

近年来，干细胞广泛应用于中枢神经系统发育、可塑性和再生研究，研究表明，胚胎干细胞和神经干细胞移植能够在中枢神经系统缺血、变性及损伤性疾病中可发挥显著的神经再生、修复和功能重建作用[1-3]。然而，由于上述干细胞来源困难及伦理学问题等原因，其进一步临床应用受到很大限制。研究证实CD34+造血干细胞具有自我更新、多向分化及重建长期造血和免疫的生物学功能，成为当今造血调控、造血干细胞移植、基因治疗和造血细胞体外扩增理想的靶细胞[4-5]。新近研究表明，CD34+造血干细胞在针对心肌缺血性损伤、肢体血管闭塞引起的组织缺血等治疗上有显著的疗效，并实验性应用于临床取得令人满意的结果[6-8]。

1 材料和方法

设计：分组对照实验。
单位：河北医科大学第四医院、中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所。
材料：实验于2002-05在天津市中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所进行。SD大鼠（解放军军事医学科学院第四研究所提供），实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准，人脐带血来源于天津脐血干细胞库正常分娩胎儿新鲜脐带血，产妇及家属对实验知情同意，并符合医学伦理学标准。
设计、实施、评估者：设计、实施由全体作者完成，评估由不相关人员完成，盲法评估。
方法：
实验动物分组：采用雄性SD大鼠60只，体质量250~350 g，随机分为3组：CD34+细胞移植组（n =20）：用线栓法建立大鼠左侧大脑中动脉栓塞模型后24 h移植CD34+细胞；生理盐水组（n =20）：左侧大脑中动脉栓塞后24 h后注射等量的生理盐水；假手术组（n =20）：仅行左侧大脑中动脉栓塞。
CD34+细胞的制备：无菌条件下，取足月妊娠、正常分娩的新鲜脐带血（内加抗凝剂），按5∶1比例加入6.0%（终浓度为1.2%）的羟乙基淀粉沉淀红细胞。用Ficoll淋巴细胞分离液梯度离心分离单个核细胞，采用Mini MACS免疫磁性吸附柱分离装置，应用MASC CD34+细胞分选试剂盒分选CD34+细胞。应用标记FITC的CD34+抗体标记细胞，FACS检测CD34+细胞阳性率，按5×106接种于100 mL玻璃培养瓶中，加入IL-3 50 μg/L、IL-6 100 μg/L、SCF 100 μg/L及BrdU 20 μmol/L进行标记， 37 ℃饱和湿度的CO2孵箱培养，倒置显微镜观察。72 h后取部分细胞用BrdU单抗标记细胞，FACS检测BrdU标记阳性率。移植前用PBS洗涤细胞3次，0.3%台盼蓝检测细胞活力，调终浓度至5×1010 L-1备用。
大脑中动脉栓塞模型制作、细胞移植：大脑中动脉栓塞模型制作参照Longa[9]法，随机抽取健康雄性大鼠，10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔麻醉，置37 ℃恒温水浴垫上，颈部脱毛，常规皮肤消毒，颈部正中切口，分离左侧颈总动脉，游离结扎左颈外动脉，用直径0.2 mm尼龙线从颈外动脉插入，进入颈内动脉，深度为（18.0±0.5） mm，保留2 h后，将尼龙线抽出，缝合伤口。24 h后行神经功能评分，选择评分在7~12之间大鼠，重新麻醉，将其固定于立体定向架上，顶部正中切开皮肤，牙科钻颅骨钻孔，于左侧纹状体区（AP=0 mm, ML=2.0 mm, DV=4.5 mm）和大脑皮质（AP=0 mm, ML= 2.0 mm, DV=2.0 mm）分别注射CD34+细胞

10 μL (5×1010 L-1)，留针5 min防止细胞逆流，拔出注射器，医用生物蛋白胶封闭注射针孔，缝合伤口。
行为学评价：移植后第1、7、14、21、28天由不了解实验人员采用改良神经功能损害评分对动物进行行为学检查[10]。改良神经功能损害评分见表1。

改良神经功能损害评分总分为18分，1~6分为轻度损害，7~12分为中度损害，13~18分为重度损害。
大鼠脑梗死面积的测定：于移植后28 d，每组取5只大鼠，麻醉后断头，3 min内取出鼠脑，立即置 -20 ℃冰箱20 min，自额极每隔2 mm切取脑组织，置2%红四氮唑（TTC）溶液中，37 ℃避光孵育30 min后置甲醛溶液固定24 h，根据苍白区确定梗塞灶范围。染色后切片用多媒体病理图像分析系统计算各切片梗死面积及总面积，根据梯形公式计算梗死体积及脑总体积。
免疫组织化学分析：大鼠于移植后7，14，21 d各组分别随机选取2只动物处死行免疫组化观察，28 d时处死全部动物。重新用10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉，行胸主动脉插管以等渗盐水灌注。快速取出脑组织，置-196 ℃液氮中30 min，冰冻切片机连续切为5 μm厚冠状切片，每间隔20 μm行免疫组织化学。切片晾干后，依次进行0.2% Triton X-100透化、2NHCl变性和0.1 mol/L Na2B4O7中和。经3%过氧化氢去除内源性过氧化物酶、正常血清封闭非特异性反应后，抗BrdU单克隆抗体（1∶100稀释）4 ℃孵育过夜，再加入HRP标记兔抗小鼠lgG二抗室温1 h，DAB显色，苏木精复染，光镜下观察BrdU阳性细胞及其迁移情况，记数BrdU阳性细胞数，计算平均数。
为了观察移植细胞的神经分化，采用免疫荧光双标记法检测移植细胞BrdU和GFAP标志：在免疫酶法检测BrdU阳性细胞基础上，加入抗GFAP（1∶400稀释）单克隆抗体室温作用1 h，加入FITC标记第二抗体 （1∶200稀释）进行双标记；采用免疫荧光双标记法检测移植细胞的BrdU和NeuN标志：切片首先如上所述用抗BrdU单克隆抗体处理，二抗换为TRITC标记山羊抗小鼠lgG（1∶100稀释），然后用抗NeuN（1∶1 000稀释）单克隆抗体处理室温两小时，再以FITC标记兔抗小鼠lgG(1∶400稀释）处理。荧光显微镜观察，荧光分别为488 nm（FITC）和543 nm（TRITC）激光束激发。记数双标记细胞占BrdU阳性细胞百分数。随机记数20个视野，计算平均数。
主要观察指标：①免疫组织化学显微镜下BrdU阳性细胞计数及其向缺血区域迁移情况。②免疫荧光显微镜下计数BrdU-GFAP和BrdU- NeuN双阳性细胞及其分化比率。
统计学方法：由第一作者采用SPSS 10.0软件，数据以x(_)±s来表示，不同时间点神经功能评分、阳性细胞数及梗死体积均采用双侧t检验进行比较，以P < 0.05为差异显著性标准。

2 结果

2.1 CD34+细胞纯度及标记阳性率 脐血CD34+细胞制备后，FACS检测CD34+细胞纯度达97.7%；倒置显微镜观察细胞大小均匀一致，胞质、胞核清晰，与BrdU孵育72 h后，FACS检测Brdu标记阳性率为64.5%。移植前应用椎虫蓝拒染法检测活细胞比率为97.3%。
2.2 各组大鼠术后行为学评价 见表2。造模后，大鼠均出现右侧前肢或前后肢肌力减退，倒提时右前肢贴附于前胸，行走时向右侧倾倒且不能直线行走，并且不能在平衡木上稳定平衡。在细胞移植前和脑梗死后24 h，各组动物的改良神经功能损害评分均无显著性差异（P > 0.50）。脐血CD34+细胞移植组与其它各组在移植完成24 h 改良神经功能损害评分无显著性差异（P > 0.05）；移植后1周到第四周处死前，各组动物均有神经功能的不同程度的恢复，其中CD34+细胞移植组神经功能恢复明显优于另两组，改良神经功能损害评分比较存在显著性差异（P < 0.05），见图1。

2.3 移植后28 d各组大鼠梗死体积的比较 见表3。

CD34+细胞移植组与另两组比较，大鼠脑梗死体积无明显变化，统计学分析无显著性差异（P > 0.05）。
2.4 各组大鼠组织学检查 组织切片免疫组织化学光镜下观察，可见梗死区与正常脑组织界限较明显，神经元变性坏死，部分成三角形，细胞周围间隙增大，有空泡形成；于左侧基底节区及皮质下可见深褐色的BrdU阳性移植细胞，部分细胞向周围迁移，见图2。7~ 28 d免疫组织化学观察均可观察到移植细胞存活，但BrdU阳性细胞数逐渐下降，细胞向周围迁移范围逐渐增大，移植后第7、14、21、28天时平均阳性细胞数分别为205.30±38.24、192.36±29.71、152.45±26.83和147.67±22.52。

应用免疫荧光双标记染色，激光共聚焦显微镜下观察，在BrdU- NeuN荧光染色切片中，可见部分FITC标记的绿色BrdU阳性移植细胞同时表达TRITC标记神经元特异性抗原NeuN（红色），显示为黄色，见图3。

在BrdU-GFAP荧光染色切片中，可见部分TRITC标记的红色BrdU阳性移植细胞同时表达FITC标记胶质细胞特异性抗原GFAP（绿色），以胞核最为显著，见图4。在移植后第7天即可见到部分BrdU阳性移植细胞同时表达NeuN或GFAP抗原，并随移植时间的延长，双标记阳性细胞数目逐渐增多，28 d时，BrdU-GFAP双标记阳性细胞比率为（8.91±1.57）%，BrdU-NeuN双标记阳性细胞比率为（2.82±0.52）%。

3 讨论

研究表明，人脐血中含有丰富的造血干/祖细胞，主要存在于CD34+细胞亚群中，是一种具有分化潜能的原始细胞，具备自我更新和增殖的能力，并能在特定因素的影响和诱导下，向各种细胞或组织分化[11-12]，其在体外培养中形成集落的能力、刺激后进入细胞周期的速度以及自分泌生长因子的能力均较骨髓和外周血强，其端粒及端粒酶活性均长于和高于骨髓及外周血，细胞凋亡配基CD95/Fas低表达或不表达，因此，脐血来源干细胞较骨髓和外周血更为原始、寿命更长，并具有很强的增殖和分化能力[13-14]。Zigova 等[15]证明脐血干细胞可在体内微环境下分化为神经元和神经胶质细胞。
本实验采用线栓法制作左侧大脑中动脉栓塞脑缺血再灌注模型，其致病因素、病理改变均与人中风相似，且无开颅创伤。本文将CD34+细胞直接注射到缺血区域，移植后7~28 d均可检测到移植细胞存活，并向周围损伤区域迁移。其中约8.91%的BrdU阳性细胞同时GFAP阳性，约2.82%的BrdU阳性细胞同时NeuN阳性，表明部分移植细胞可向神经细胞分化，这与体外实验结果是一致的。结果表明移植脐血来源的CD34+细胞可有效减轻脑梗死带来的神经功能缺失。同时局部注射脑内移植途径减少了机体免疫排斥反应，所需移植细胞数较少，所以作者认为其效率和安全性优于经静脉途径。
脐血干细胞移植后在体内的作用机制尚未阐明，Garbuzova-davis等[16]认为通过对运动神经元的替代和保护作用，脐血具有对肌萎缩侧索硬化非侵袭性治疗的潜能，但替代损坏的神经元可能不是唯一的机制，因为只有一小部分细胞分化为神经元或神经胶质细胞，脐血可能通过调节自体免疫过程来实现神经保护功能。也有研究认为修复机制与脐血干细胞通过自分泌的形式产生各种细胞因子，进一步激活人自身干细胞和内源性修复机制有关[17]。最近研究者通过CD34+干细胞在治疗心肌缺血损伤中的观察发现，CD34+干细胞移植会引起明显的血管新生化，减少心肌梗死面积，促进大鼠恢复[18-19]。

4 参考文献

1 Akiyama Y, Honmou O, Kato T, et al. Transplantation of clonal neural precursor cells derived from adult human brain establishes functional peripheral myelin in the rat spinal cord. Exp Neurol 2001；167(1):29-39
2 Freed CR, Greene PE, Breeze RE, et al. Transplantation of embryonic dopamine neurons for severe Parkinson's disease. N Engl J Med 2001；344（10）:710-719
3 Su H, Chu TH, Wu W. Lithium enhances proliferation and neuronal differentiation of neural progenitor cells in vitro and after transplantation into the adult rat spinal cord. Exp Neurol 2007；206(2):296-307
4 Graf T. Differentiation plasticity of hematopoietic cells. Blood 2002； 99(9):3089-3101
5 Sosnova M, Bradl M, Forrester JV. CD34+ corneal stromal cells are bone marrow-derived and express hemopoietic stem cell markers. Stem Cells 2005；23（4）:507-515
6 Kajiguchi M, Kondo T, Izawa H, et al. Safety and efficacy of autologous progenitor cell transplantation for therapeutic angiogenesis in patients with critical limb ischemia. Circ J 2007;71(2):196-201
7 Kawamoto A, Iwasaki H, Kusano K, et al. CD34-positive cells exhibit increased potency and safety for therapeutic neovascularization after myocardial infarction compared with total mononuclear cells. Circulation 2006；114(20):2163-2169
8 Jaime-Perez JC, Ruiz-Arguelles GJ, Gomez-Almaguer D. Haematopoietic stem cell transplantation to treat aplastic anaemia. Expert Opin Biol Ther 2005；5(5):617-626
9 Longa EZ, Weinstein PR, Calson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rat. Stroke 1989；20:84-91.
10 Chen J, Sanberg PR, Li Y, et al. Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats. Stroke 2001；32（11）:2682-2688
11 Zeng F, Chen MJ, Baldwin DA, et al. Multiorgan engraftment and differentiation of human cord blood CD34+ Lin- cells in goats assessed by gene expression profiling. Proc Natl Acad Sci U S A 2006;103(20):7801-7806
12 Porat Y, Porozov S, Belkin D,et al.Isolation of an adult blood-derived progenitor cell population capable of differentiation into angiogenic, myocardial and neural lineages. Br J Haematol 2006；135(5):703-714
13 Lansdorp PM. Telomere length and proliferation potential of hematopoietic stem cells. J Cell Sci 1995；108:1-6
14 Zimmermann S, Glaser S, Ketteler R, et al. Effects of telomerase modulation in human hematopoietic progenitor cells. Stem Cells 2004;22(5):741-749
15 Zigova T, Song S, Willing AE, et al. Human umbilical cord blood cells express neural antigens after transplantation into the developing rat brain. Cell Transplant 2002;11(3):265-274
16 Garbuzova-Davis S, Willing AE, Zigova T, et al. Intravenous administration of human umbilical cord blood cells in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis: distribution, migration, and differentiation. J Hematother Stem Cell Res 2003;12(3):255-270
17 Nishio Y, Koda M, Kamada T, et al. The use of hemopoietic stem cells derived from human umbilical cord blood to promote restoration of spinal cord tissue and recovery of hindlimb function in adult rats. J Neurosurg Spine 2006；5(5):424-433
18 Zhang S, Ge J, Zhao L, et al. Host vascular niche contributes to myocardial repair induced by intracoronary transplantation of bone marrow CD34+ progenitor cells in infarcted swine heart. Stem Cells 2007；25(5):1195-1203
19 Grote K, Salguero G, Ballmaier M, et al. The angiogenic factor CCN1 promotes adhesion and migration of circulating CD34+ progenitor cells: potential role in angiogenesis and endothelial regeneration. Blood 2007;110(3):877-885