1福建省肿瘤医院肿瘤免疫学研究室，福建省福州市　　　350014；2福建省泉州市中医院肿瘤科，福建省泉州市 362000

林 浩★，男，1975年生，福建省福州市人，汉族，2007年福建医科大学毕业，硕士，主要从事异基因造血干细胞移植方面的研究。
bibi21000@
yahoo.com.cn zzf2004312@
tom.com

通讯作者：陈 强，教授，主任医师，福建省肿瘤医院，福建省福州市 350014
cqiang8@pub5.
fz.fj.cn

福建省科技厅重点科技项目（2006Y0011）、福建省自然基金资助项目（C0310035）、福建省医学创新课题（2003-CX-
16）***

中图分类号: R730.26
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)03-00456-04

收稿日期: 2007-09-19
修回日期：2007-10-28
(07-50-9-4813/GW Q)

Analysis on graft versus tumor effect induced by haploidentical transplantation in mice

Ａｂｓｔｒａｃｔ

ＡＩＭ: Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation is a efficient way to cure malignancies, but how to remaining and strengthen graft-versus-tumor effect when reduce graft-versus-host disease in the course of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation is a big topic for present clinic. This test proves into the role of infusion of haploidentical cells radiated with 60Co in the cure of solid tumors to ease the graft-versus-host disease through observing the clinical features of graft-versus-host disease in the cure of hepatoma cells (H22) of F1 mice by infusion of haploidentical cells respectively with and without radiation of 60Co among groups.
ＭＥＴＨＯＤＳ:Experiments were conducted at the Department of Tumor Immunology of Fujian Tumor Hospital and Fujian Center for Disease Control and Prevention from March 2006 to March 2007. ①Hepatoma cells (H22) from BABL/C mice were provided by China Center for Type Culture Collection of Wuhan University. SPF inbred line mice were offered by Beijing Vital River Company. Animal intervention met the animal ethical standard. ②Female CB6F1 mice (F1 mice in short) which had been hypodermically inoculated with hepatoma cells (H22) were as recipients, and the C57BL/6 mice were as the donors. CB6F1 mice received intraperitoneal chemotherapy with cyclophosphamide. Fresh bone marrow and spleen cells from C57BL/6 mice were as donor cells, which were divided into with or without radiation of 60Co. F1 mice were randomly assigned into a simple chemotherapy group, a chemotherapy plus non-60Co irradiated group and a chemotherapy plus 60Co irradiated group. The characteristics of graft-versus-host disease were observed， and the clinical grades were determined. ③Pathological changes in the skin, intestines, liver and spleen of mice were detected after transplantation at day 17. The pathological grades of graft-versus-host disease were determined. The weight of the tumor and the anti-tumor rate of different groups were inspected.
ＲＥＳＵＬＴＳ:①The graft-versus-host disease clinical performance of chemotherapy plus 60Co irradiated group was apparently weaker than that of chemotherapy plus non-60Co irradiated group. ②Chemotherapy plus 60Co irradiated group showed weaker graft-versus-host disease performance in the skin, intestines, liver and spleen than those of chemotherapy plus non-60Co irradiated group. ③There were significant differences in the average weight of tumor in the simple chemotherapy group with chemotherapy plus non-60Co irradiated group and chemotherapy plus 60Co irradiated group [（1.34±0.45） g，（0.6±0.38） g，（0.28±0.15） g，P < 0.05]. The anti-tumor rate was 55.22% in the chemotherapy plus non-60Co irradiated group, whereas 79.22% in the chemotherapy plus 60Co irradiated group.
ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ:The haploidentical cells irradiated with 7.5Gy 60Co as the donor's cells cause the graft-versus-tumor effect of recipient mice with H22 and decrease the performance of graft-versus-host disease.

Lin H, Ye YB, Li XF, Chen Q.Graft-versus-tumor effect induced by haploidentical transplantation in mice.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(3):456-460(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-3/3k-456(ps).pdf]

摘要
目的：异基因造血干细胞移植是治疗恶性肿瘤的一种有效方法，但在异基因造血干细胞移植时，如何在减轻移植物抗宿主病的同时保留并加强移植物抗肿瘤效应是目前临床面临的一大课题。观察输注经与未经60Co照射的单倍体相合细胞治疗CB6F1小鼠肝癌模型中移植物抗宿主病临床表现，探讨输注经照射单倍体相合细胞在治疗实体瘤中减轻移植物抗宿主病的作用。
方法：实验于2006-03/2007-03在福建省肿瘤医院肿瘤免疫学研究室和福建省疾病预防控制中心动物房完成。①实验材料：来源于BABL/C小鼠的肝癌H22细胞株由武汉大学中国典型培养物保藏中心提供。SPF近交系小鼠由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：以皮下接种肝癌细胞（H22）的CB6F1（BABL/C×C57BL/6杂交鼠，简称F1）雌性小鼠为受体鼠，经环磷酰胺腹腔化疗后，取C57BL/6小鼠的新鲜骨髓及脾脏细胞作为供体细胞，供体细胞分为经60Co照射和未经60Co照射。将F1小鼠随机分为3组：单纯化疗组、化疗+未经60Co照射细胞组、化疗+经60Co照射细胞组。观察3组小鼠移植物抗宿主病表现，并给予临床评分。③实验评估：于移植后第17天取小鼠皮肤、肠、肝、脾组织制备病理切片，观察移植物抗宿主病病理学改变所反应的情况，并检测小鼠瘤重和抑瘤率。
结果：①化疗+经60Co照射细胞组小鼠移植物抗宿主病的临床表现明显轻于化疗+未经60Co照射细胞组（P < 0.05）。②化疗+经60Co照射细胞组小鼠的皮肤、肠、肝、脾组织移植物抗宿主病的细胞病理学改变轻于化疗+未经60Co照射细胞组。③单纯化疗组与化疗+未经60Co照射细胞组、化疗+经60Co照射细胞组瘤重比较差异显著[（1.34±0.45） g，（0.6±0.38） g，（0.28±0.15） g，P < 0.05]。化疗+未经60Co照射细胞组抑瘤率为55.22%，化疗+经60Co照射细胞组抑瘤率为79.22%。
结论：供体细胞经7.5Gy 60Co照射的单倍体相合移植能诱发荷H22实体瘤小鼠产生移植物抗肿瘤效应，同时降低移植物抗宿主病的程度。
关键词：单倍体相合移植；移植抗宿主病；移植物抗肿瘤；NST

林浩，叶韵斌，李晓峰，陈强.单倍体相合细胞移植诱发小鼠移植物抗肿瘤效应的分析[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(3):456-460 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-3/3k-456(ps).pdf]

0 引言

异基因造血干细胞移植(Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation， Allo-HSCT)是一种特殊形式的免疫疗法，通过诱发移植物抗肿瘤效应，提供一个有效治疗恶性肿瘤的手段，近年来成为治愈某些恶性血液性肿瘤疾病的主要手段之一[1-2]。但由于供受体间组织相容性的不同所引发的移植物抗宿主病和由于缺乏有效的的移植物抗肿瘤/移植物抗白血病(Graft-versus-tumor/ Graft-versus leukemia,GVT/GVL)效应所导致的肿瘤复发，一直限制了Allo-HSCT的应用[3]。移植物抗宿主病是由移植物中所含供者T细胞识别宿主抗原而攻击宿主组织器官所产生的病理损伤，并导致宿主多脏器损伤的一个疾病过程[2]。GVT特指对血液等恶性疾病进行Allo-HSCT后供体中成熟的T淋巴细胞识别肿瘤细胞表面抗原引起免疫并杀伤肿瘤细胞的一种重要的免疫介导现象。这种反应能有效清除微小残留病灶，从而大大减少肿瘤的复发率[4]。因此在应用Allo-HSCT减轻移植物抗宿主病的同时保留并加强GVT效应成为临床面临的一大课题[5]。

1 材料和方法

设计：对照观察动物实验。
单位：福建省肿瘤医院免疫学研究室。
材料：实验于2006-03/2007-03在福建省疾病预防控制中心（实验动物使用许可证号：SYXK（闽）2005-0002，适用范围：清洁级鼠类）动物房清洁级层流柜内和福建省肿瘤医院免疫学研究室完成。细胞株来源于BABL/C小鼠的肝癌H22细胞，购于武汉大学中国典型培养物保藏中心（CCTCC编号：GDC091）。小鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号：SCXK：2002-0003。其中SPF级近交系杂交小鼠CB6F1(BABL/C×C57BL/6，简称 F1，♀)，6~8周龄，体质量19~22 g；SPF级近交系小鼠(C57BL/6,♂)，6~8周龄，体质量20~ 23 g；SPF级近交系BABL/C(♀)小鼠，6~8周龄，体质量17~19 g。实验过程中对动处置符合动物伦理学标准。
设计、实施、评估者：实验设计为全部作者，干预实施为第一、二作者，评估为第二、四作者，均经过系统培训，未使用盲法评估。
方法：
H22细胞株的传代及荷瘤鼠制备：将冻存于液氮中的来源于BABL/C小鼠的肝癌H22细胞株复苏后，常规培养6 d。用生理盐水将H22细胞调整成1×1010 L-1，抽0.2 mL注入BABL/C小鼠腹腔，7 d后将小鼠颈椎脱臼处死，抽取含有H22肿瘤细胞的腹水，用NS稀释5倍后，取 0.2 mL注于另1只BABL/C小鼠腹腔里，再培养 7 d。再次抽取BABL/C小鼠腹水，按一定比例加入生理盐水，配制成1×1010 L-1的瘤细胞悬液。抽取H22瘤细胞0.2 mL（约2×106个细胞），接种到CB6F1小鼠右腋下皮下，共接种30只。
实验动物分组：根据实验的目的，将接种了H22瘤细胞的CB6F1小鼠按治疗方案不同随机分为3组，每组10只。单纯化疗无移植（空白对照）组（A组）、化疗+移植未经60Co照射的单倍体相合细胞（化疗+移植未照射）组（B组）、化疗+移植经60Co照射的单倍体相合细胞（化疗

+移植经照射）组（C组）。
荷瘤CB6F1小鼠的预处理：于接种H22肿瘤细胞后第3天开始给予预处理。A、B、C组小鼠均给予环磷酰胺腹腔化疗，用生理盐水将环磷酰胺稀释成10 g/L， 80 mg/(kg d)腹腔注射，连续注射4 d。
单倍体相合供体（鼠）细胞（脾+骨髓细胞）的制备：以健康的雄性C57BL/6为单倍体相合供体（鼠），无菌条件下提取骨髓和脾细胞制成悬液，按1∶1体积混合，分成2份，1份不经60Co照射，1份用60Co照射。照射方案为：面积：20 cm×20 cm，SSD=100 cm，深度1 cm，剂量7.5 Gy，照射时间：12.44 min，剂量率 0.602 9 Gy/min。制备的细胞用于尾静脉注射，随用随备。
移植单倍体相合供者细胞：在CB6F1小鼠（受鼠）经过预处理结束后第3、5、7天分别进行3次的尾静脉注射。按实验分组，A组为，给予尾静脉注射无血清RPMI 1640，每只给予输注300 μL；B组为给予输注未照射的单倍体相合供者（鼠）细胞（含有脾、骨髓细胞各1.5×107、1.0×107），每只给予输注300 μL；C组为给予输注经60Co照射的单倍体相合供体（鼠）细胞，每只给予输注300 μL。
小鼠移植物抗宿主病病理和瘤重、抑瘤率采样时间的选择：以本次实验A、B、C组小鼠中有1只小鼠自然死亡时间为信号，处死所有的小鼠。处死的小鼠取肝、肠、皮肤、脾等组织病理切片，进行移植物抗宿主病病理分级并计算瘤重和抑瘤率。抑瘤率=（A组瘤重－其他组瘤重）/A组瘤重×100%。实验时B组有1只小鼠于移植后第17天死亡，故在移植后第17天处死全部小鼠。
采用临床上多沿用的1975年Thomas等提出的移植物抗宿主病分度诊断方法，结合Xun等[6]对小鼠移植物抗宿主病的分级标准，将各组得到的肝、肠、皮肤、脾等病理组织切片给予分级。
主要观察指标：①实验小鼠移植物抗宿主病临床观察。②小鼠移植物抗宿主病表现。③小鼠瘤重和抑瘤率。
统计学方法：由第一作者采用SPSS 12.0统计软件进行统计计算。计量资料采用x(_)±s表示，样本均数间的比较应用完全随机方差分析。多个独立等级资料样本间的比较采用Nemenyi法检验。

2 结果

2.1 实验动物数量分析 30只CB6F1小鼠（受鼠）全进入结果分析，无脱失。
2.2 实验的病理学观测结果
2.2.1 肝组织病理学观察结果 移植后第17天A组小鼠肝组织病理片表现为汇管区仅有少量淋巴细胞侵润，胆管未见或偶见炎症，未见嗜酸性坏死细胞，叶间胆小管退行性变和/或坏死< 25%，移植物抗宿主病评级为0-I级，大部分病理片为0级；B组小鼠肝组织病理片表现为汇管区大量淋巴细胞侵犯，胆管见炎症，个别胆管消失，肝细胞见变性或坏死，可见嗜酸性坏死细胞，叶间胆小管退行性变和/或坏死25%~50%，移植物抗宿主病评级为Ⅰ-Ⅱ级；C组小鼠肝组织病理片表现为汇管区少量淋巴细胞侵润，胆管可见炎症，个别胆管消失，偶见嗜酸性坏死细胞，叶间胆小管退行性变和/或坏死 < 25%，移植物抗宿主病评级为0-J级，但大部分病理片评分为Ⅰ级，高于A组，见图1。

2.2.2 肠组织病理学观察结果 移植后第17天A组小鼠肠组织病理片表现为肠黏膜完整，未见明显上皮细胞坏死，与正常小鼠肠黏膜表现相近，移植物抗宿主病评级为0级；B组小鼠肠组织病理片表现为部分肠黏膜糜烂，隐窝腺体扩张，黏膜和黏膜下层充血水肿，个别上皮细胞坏死，伴肠腺坏死或脱落，局灶性炎症细胞浸润，移植物抗宿主病评级为Ⅰ-Ⅱ级；C组小鼠肠组织病理片显示肠黏膜病理表现介于A、B两组之间，程度比B组明显减轻，移植物抗宿主病评级为0-Ⅱ级之间，个别显示为Ⅱ级，见图2。
2.2.3 皮肤组织病理学观察结果 移植后第17天A组小鼠皮肤组织病理片表现为表皮完整，无坏死细胞，无明显的淋巴细胞浸润，与正常小鼠皮肤组织病理相近，无明显的移植物抗宿主病表现；B组小鼠皮肤组织病理片表现为基底层空泡样退行性变和/或坏死，部分上皮细胞坏死，炎症细胞浸润，灶性上皮与真皮分离，表皮变薄，部分毛囊和附属腺体退化和消失，移植物抗宿主病评级为Ⅱ-Ⅳ级之间；C组小鼠皮肤组织病理片显示皮肤病理表现介于A、B两组之间，程度比C组明显减轻，可见基底层空泡样退行性变和/或坏死，部分上皮细胞坏死，炎症细胞浸润，无毛囊和附属腺体退化和消失，移植物抗宿主病评级为0-Ⅱ级之间，见图3。

2.2.4 脾组织病理学观察结果 移植后第17天A组小鼠脾组织病理片表现为被膜下个别细胞坏死，炎性渗出，与正常小鼠皮肤组织病理相近，移植物抗宿主病评级为0-Ⅰ级之间；B组小鼠脾组织病理片表现为脾组织结构破坏，脾小体、脾小梁消失，大量的巨噬细胞和淋巴细胞浸润，大量纤维组织增生，并见坏死，移植物抗宿主病评级为Ⅰ-Ⅲ级之间；C组小鼠脾组织病理片被膜下炎症细胞浸润，少量细胞坏死，见少量巨噬细胞，可见脾组织结构破坏，纤维组织增生但不明显，移植物抗宿主病评级为Ⅰ-Ⅱ级之间，见图4。

2.2.5 实验小鼠移植物抗宿主病病理学分级 见表1。

2.3 小鼠的临床移植物抗宿主病评分 根据小鼠体质量下降、活动度、姿势、翘毛、皮肤溃疡五项情况，做为观察临床移植物抗宿主病的指标[7]，并给予临床评分。A组小鼠为（1.4±1.1）分；B组为（7.8±0.8）分；C组为(3.4±0.5)分。A、B组及A、C组间差异有显著性意义 （P < 0.05）；B、C组间有差异显著性意义（P < 0.05）。
采用多个独立等级资料间样本两两比较的Nemenyi法检验。肝病理结果：A、C两组间无显著性差异（P > 0.05），A、B及B、C两组间有显著性差异 （P < 0.05）；小肠病理结果：A、C两组间无显著性差异（P > 0.05），A、B及B、C两组间有显著性差异（P < 0.05）；皮肤病理结果: A、C两组间无显著性差异（P > 0.05），A、B及B、C两组间有显著性差异（P < 0.05）；
脾病理结果：在A、C两组间无显著性差异（P > 0.05），A、B及B、C两组间有显著性差异（P < 0.05）。
2.4 实验小鼠的瘤重和抑瘤率 A组小鼠的平均瘤重为（1.34±0.45） g；B组小鼠的平均瘤重为（0.6± 0.38） g；C组小鼠的平均瘤重为（0.28±0.15） g。A、B及A、C两组间瘤重比较有显著性差异（P < 0.05），而B、C两组间瘤重比较无显著性差异（P > 0.05）。B组抑瘤率为55.22%，C组抑瘤率为79.22%。

3 讨论

在异基因造血干细胞移植过程中，只有20%~30%需要接受该治疗的患者才可以找到HLA完全相合的亲缘供者，而大部分患者是进行HLA不相合或不全相合的异基因造血干细胞移植，该方法更会引起严重的移植物抗宿主病，并且移植失败率高、造血及免疫重建慢、移植相关死亡率高[8-9]。
在对清髓性allo-HSCT治疗血液系统恶性疾病的研究中发现，即便是致死剂量的化放疗也不能完全根除恶性肿瘤细胞；在接受异基因骨髓移植的患者中，伴有移植物抗宿主病的患者比没有移植物抗宿主病患者的复发率要显著降低；同基因或去除T细胞的异基因骨髓移植患者的复发率最高；复发患者中接受供者淋巴细胞输注可诱导完全缓解[10]。这些证据表明,植入的供者异基因的免疫细胞可产生抗恶性肿瘤细胞的效应,即GVT效应在对恶性肿瘤细胞的清除中起着重要作用[11]。NST是指移植前采用降低预处理强度的预处理方案，再移植入异基因造血干细胞，促进完全性或混合性嵌合体植入，增强GVT效应以清除受者残留的肿瘤细胞，提高长期无病生存期[12]。近来不断有报道NST在治疗恶性肿瘤上取得一定的临床疗效[13-16]。
本实验结果说明经照射组小鼠的移植物抗宿主病症状明显轻于未经照射组。同时B、C两组小鼠均与A组有差别，表明B、C两组小鼠均产生了移植物抗宿主病症状，只是B组小鼠的症状重于C组。通过移植后第17天的小鼠病理切片观察，表明B、C两组小鼠的肝、小肠、皮肤、脾组织均出现了移植物抗宿主病反应，统计学分析表明，供者淋巴细胞经过60CO照射再输注，可以减轻移植物抗宿主病反应的程度。
实验的B、C两组小鼠的平均瘤重分别为0.6 g和0.28 g，与A组相比，P均小于0.05，说明输注经与未经7.5Gy的60CO照射后单倍体相合细胞移植均可产生抗肿瘤效应。B、C组的抑瘤率分别为55.22%和79.22%，但B、C两组间瘤重比较，差异不显著。说明B、C两组间抗肿瘤效果相似。考虑到B组小鼠出现严重的移植物抗宿主病反应，而C组小鼠移植物抗宿主病表现明显轻于B组，虽然B、C两组在抗肿瘤效果上相同，但C组移植物抗宿主病反应明显减轻了。

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