1河北医科大学第二医院骨科，河北省石家庄市 050000；2河北医科大学解剖教研室，河北省石家庄市 050017；3河北医科大学第二医院耳鼻喉科，河北省石家庄市 050000；4北方医学院解剖教研室，河北省张家口市 075000；5河北省人民医院泌尿外科，河北省石家庄市 050000

宋永周☆，男，1973年生，河北省深泽县人，汉族，河北医科大学在读博士，主治医师，主要从事干细胞与神经再生方面的研究。
yongzhousong@
126.com

中图分类号: R394.2
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)03-00461-04

收稿日期: 2007-10-10
修回日期：2007-11-07
(07-50-10-5437/GW Q)

Effects of brain homogenate on the differentiation of rat bone mesenchymal stem cells into neuron-like cells following traumatic brain injury

Ａｂｓｔｒａｃｔ

ＡＩＭ: The bone mesenchymal stem cells can transform into neuron-like cells in vitro induced by brain homogenate. There are growth factors secreted from brain tissue extracts and bone mesenchymal stem cells in the cultural liquids, which can induce the bone mesenchymal stem cells into neuron-like cells. In this study, the different effects between traumatic brain tissue extracts and normal brain tissue extracts on the differentiation of rat bone mesenchymal stem cells were observed.
ＭＥＴＨＯＤＳ:Experiments were conducted in the Cell Laboratory of Department of Anatomy of Hebei Medical University from March to August in 2007. ①One healthy clean SD rat weighting 100-150 g aged 4-6 weeks was provided by Animal Experimental Center of Hebei Medical University. Experimental procedures were accorded with the Animal Ethical Standards. ②One SD rats were anaesthetized and tibias and femurs were dissected out, and then bone marrow was flushed out with L-DMEM. After it was centrifuged, the supernatant was discarded. The extracted cells were resuspended and seeded in L-DMEM supplemented with fetal bovine serum of 0.10 volume fraction. The bone mesenchymal stem cell morphologies were observed under an inverted phase microscope. Rat models of moderate brain injury were established by Modified Gruncr Method. The traumatic brain tissue extracts acquired on the point about 24 hours after the injury and normal brain tissue extracts were used to induce 3rd passage of bone mesenchymal stem cells in vitro. ③The morphological changes of the stem cells were observed with the inverted phase microscope. The expression of neuron-specific enolase was identified by immunocytochemical technique. The different effects between traumatic brain tissue extracts and normal brain tissue extracts on the differentiation of bone mesenchymal stem cells were observed.
ＲＥＳＵＬＴＳ:After 24-hours induction with traumatic brain tissue extracts, the cellular bodies changed large, 36 hours later, part of the bone mesenchymal stem cells body contracted into round or spindle shape. 48 hours later, neuron-like cells with two or more prominence could be seen. The immunocytochemical method showed that the ratio of neuron-specific enolase expressing was (54.28±6.03)%. The differential ratio of bone mesenchymal stem cells induced with normal brain tissue extracts was lower, and ratio of neuron-specific enolase expressing was (32.76±3.25)%.
ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ:Bone mesenchymal stem cells can be induced differentiating into neuron-like cells. The induction proportion induced with traumatic brain tissue extracts is higher than with normal brain tissue extracts.

Song YZ, Cui HX, Lü Z, Wang XS, Wang ZX, Shi ZL.Effects of brain homogenate on the differentiation of rat bone mesenchymal stem cells into neuron-like cells following traumatic brain injury.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(3):461-464(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-3/3k-461(ps).pdf]

摘要
目的：骨髓间充质干细胞在脑组织匀浆诱导环境下可以转化为神经元样细胞，损伤脑组织匀浆的骨髓间充质干细胞培养液中，不仅有脑组织中提取的生长因子，而且有骨髓间充质干细胞分泌的多种生长因子，共同刺激骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化。实验观察了创伤后24 h和正常脑组织匀浆诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的差别。
方法：实验于2007-03/08在河北医科大学解剖教研室细胞培养中心完成。①实验材料：体质量100~150 g的健康SD大鼠由河北医科大学实验动物中心提供，4~6周龄,清洁级。实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：取1只 SD大鼠，麻醉后分离股骨和胫骨，用培养基冲洗骨髓腔，离心弃上清液，加入含体积分数为0.10胎牛血清的L-DMEM培养基重悬，接种于培养瓶培养并传代，于倒置显微镜下观察细胞形态。采用Gruncr改良法制作中度脑损伤大鼠模型，取伤后 24 h和正常大鼠脑组织匀浆，对体外培养的第3代骨髓间充质干细胞进行诱导。③实验评估：在倒置显微镜下观察细胞形态学变化，并应用免疫细胞化学技术检测细胞内神经元特异性烯醇化酶的表达，比较创伤后和正常脑组织匀浆两组诱导率差别。
结果：骨髓间充质干细胞经创伤性脑组织匀浆培养基诱导24 h后，细胞的胞体变大，36 h后部分细胞分化，回缩成圆形或梭形，48 h后部分细胞可见两个或多个突起伸出，类似神经元。免疫细胞化学技术检测显示，创伤性脑组织匀浆培养基诱导组神经元特异性烯醇化酶阳性表达为（54.28±6.03）%，正常脑组织匀浆诱导分化率较前者低，神经元特异性烯醇化酶阳性表达为（32.76±3.25）%，细胞生长状态略差。
结论：脑组织匀浆可诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化，创伤性脑组织匀浆可明显促进其分化。
关键词：脑组织匀浆；骨髓间充质干细胞；神经元样细胞

宋永周，崔慧先，吕哲，王新生，王振显，史正亮.创伤性脑组织匀浆对大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(3):461-464
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-3/3k-461(ps).pdf]

0 引言

神经创伤及神经退行性变所导致的神经元损伤后的再生问题是困扰医学界并急需解决的难题之一。骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells ,BMSCs)具有多向分化潜能，来源广泛，取材方便，危险性低，无免疫排斥反应，而且不存在伦理问题，并且具有良好的组织相容性，是基因移植及携带的优良的种子细胞。这为临床上神经元再生的研究提供了新的方向和思路。

1 材料和方法

设计：细胞对照观察。
单位：河北医科大学解剖教研室。
材料：实验于2007-03/08在河北医科大学解剖教研室细胞培养中心完成。4~6周龄,体质量100~150 g健康SD大鼠1只购自河北医科大学实验动物中心（动物质量合格证号：SCXK（冀）2003-1-003），清洁级，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。
设计、实施、评估者：实验设计为第一、二作者，实施和评估由全体作者共同完成，均经过系统科研培训。
方法：
BMSCs的分离培养：选取4~6周龄，体质量100~150 g健康SD大鼠，麻醉后无菌条件下立即取下双侧下肢股骨、胫骨。剪断股骨、胫骨两端，暴露骨髓腔，用培养基（含有青霉素100 U/mL、链霉素100 U/mL+10%FBS的L-DMEM）冲出骨髓于离心管中，吹打制成单细胞悬液。1 000 r/min，离心5 min，弃上清液。用含10% FBS、100 U/ mL青霉素、100 U/mL链霉素的L-DMEM 培养基重悬。将细胞接种于培养瓶中，置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养。3 d后进行半量换液，5 d后全量换液，以后每隔3 d换液1次。倒置显微镜下观察，待细胞生长已铺满瓶底的95%以上时用0.125%胰蛋白酶-0.02%的EDTA混合消化液消化传代。
创伤性和正常脑组织匀浆的提取：大鼠称重，麻醉后固定于特制手术台上，显露颅顶骨，使用OHBISIK打击器，按Gruncr改良法制作中度脑损伤模型（将40 g砝码于100 cm高处通过导向管坠落，撞击置于人字缝与矢状缝之间的圆锥上，致中度脑损伤）[1]。伤后24 h取出损伤脑组织置于冰上，称取湿重，按150 g/L比例加入培养基，再用匀浆器将脑组织匀浆，离心(2 500 r/min，5 min)后吸取上清液。用0.22 μｍ微孔滤膜过滤后储存-200 ℃ 备用。正常脑组织匀浆的制备为直接取大鼠脑组织，其余方法同上。
脑组织匀浆诱导BMSCs分化：将制备的脑组织匀浆（创伤性和正常脑组织匀浆2组）与培养基按等体积混匀，作为诱导分化的培养液。将培养的第3代BMSCs制成单细胞悬液，滴加于6孔板中，孔内预先铺有经多聚赖氨酸处理的载玻片，待细胞贴壁伸展后加入诱导液，并以正常培养的细胞作对照。倒置显微镜下观察细胞形态变化，诱导后3 d，取出载玻片，PBS冲洗，4%多聚甲醛中固定30 min，PBS冲洗后按SABC免疫组织化学说明书进行染色鉴定NSE的表达。
分化细胞的鉴定：吸弃6孔板内的培养液，PBS冲洗；4%多聚甲醛固定至少30 minPBS冲洗；3%H2O2 甲醇溶液浸泡15 min，以灭活内源性过氧化物酶，PBS冲洗2 min×3次；滴加正常山羊血清封闭液，室温10 min；滴加1∶100稀

释的兔抗大鼠NSE，37 ℃孵育60 min，PBS冲洗2 min×3次；滴加生物素化山羊抗兔IgG，37 ℃ 10 min，PBS冲洗2 min×3次；滴加三抗，37 ℃ 10 min，PBS冲洗2 min×3次；DAB显色，蒸馏水冲洗，脱水透明封固。对照组采用PBS代替一抗。
主要观察指标：①大鼠骨髓间充质干细胞生长情况和形态变化。②诱导后细胞生长情况和形态变化。③分化后细胞内神经元特异性烯醇化酶的表达情况。
统计学方法：每组细胞在显微镜下随机选取10个非重叠的视野进行计数，计算出诱导的百分率，阳性率＝阳性细胞数／(阳性细胞数＋阴性细胞数)，结果以x(_)±s表示。

2 结果

2.1 间充质干细胞生长情况 原代培养的骨髓细胞成分复杂，一二天开始有少量细胞贴壁，形状不规则，有长梭形、多角形等。半量换液后，克隆生长的细胞团块开始迅速增殖，以集落形式生长为主。7~9 d细胞可长满培养瓶底，达95%以上融合，主要呈纺锤形，其中散在少量折光性强的小圆形细胞。细胞整体排列更趋于规律性，呈漩涡状，辐射状或鱼群样排列。传代后的细胞贴壁及生长更加迅速，2 h后部分细胞即开始贴壁，24 h内即可完全贴壁，六七天可铺满培养瓶底。细胞形态更均一，纺锤形生长，整体呈现漩涡状，辐射状或鱼群样排列，见图1。苏木精-伊红染色示胞体以纺锤形居多，有突起。细胞核大、居中深染，嗜碱性，核仁明显；胞质着色浅,呈弱嗜酸性，见图2。

2.2 脑组织匀浆诱导BMSCs后的形态变化 BMSCs经创伤性脑组织匀浆培养基诱导 24 h后，细胞的胞体变大，细胞形态变化不大，36 h后部分细胞分化，原来宽大扁平的细胞胞质逐渐向中央的细胞核收缩，回缩成圆形或梭形，胞质紧贴胞核，呈典型的核质体形态，致密而折光性强，并随着时间的延长此现象更加趋于明显。48 h后部分细胞可见两个或多个突起伸出，类似神经细胞。突起不断延长，有的呈简单的双极，有的呈现复杂的多极细胞。有些细胞突起甚至长出2~3级分支，类似于树突结构。3 d后分化率基本无变化，见图3。正常脑组织匀浆培养基诱导的BMSCs分化率较前者低，细胞生长状态略差。而正常培养的细胞未见细胞形态变化。

2.3 免疫细胞化学法检测BMSCs分化的神经细胞的表面标志物 部分细胞呈NSE阳性表达，见图4。创伤性脑组织匀浆培养基诱导组分化率为（54.28±6.03）%，正常脑组织匀浆培养基诱导组分化率为（32.76± 3.25）%。一抗为PBS的对照组则无阳性表达。

3 讨论

BMSCs是存在于骨髓中的一类具有自我更新和增殖能力的干细胞，可以在体内和体外特定条件下转化为神经细胞[2-8]、成骨细胞[9]、软骨细胞[10]、心肌细胞等[11]。早在2000年，Woodbury等[12]应用β－ME、DMSO和bFGF以及Sanchez-Ramos等[13]应用ATRA和BDNF等诱导因子分别在体外成功诱导骨髓间充质细胞转化成神经元，并表达NSE，阳性率达78%。国内相继有不同学者分别应用不同中药对BMSCs进行向神经元的诱导[14-16]，也分别取得了不错的结果。本课题组前期应用黄芪诱导BMSCs向神经干细胞分化成功[2]。神经元的诱导分化至少有两方面的意义：一方面，揭示细胞的基因机制具有可塑性，外环境的变化能够激发出细胞的多能性，从而超越起源胚层的固有限制，分化为携带本胚层及其他胚层标志物的细胞；另一方面，作为产生移植用神经元的新途径，为临床治疗提供机会。
许多学者应用组织匀浆诱导干细胞向特定方向分化，即为干细胞营造类似体内生长的局部微环境来促进细胞生长、诱导其向特定方向分化[17-19]。牛朝诗等[20]应用大鼠闭合性颅脑损伤后24 h脑组织匀浆诱导BMSCs，诱导24~36 h后开始出现形态学变化，诱导三四天后NSE表达率为（23.2%±6.09）%，GFAP表达率为（14.3%±3.27）%。
关于脑组织匀浆液诱导分化机制，牛朝诗等[20]认为可能是脑组织细胞通过分泌的生长因子如神经生长因子、脑源性神经牛长因子、胶质源性神经营养因子等生长因子，刺激间充质干细胞向神经细胞分化。损伤脑组织匀浆之所以能诱导骨髓间充质干细胞分化，原因是神经组织在受到损伤后，产生相应的反应，随后出现一系列相应的变化。部分神经元因损伤而死亡，还有神经元随后出现凋亡。同时，神经组织在损伤后各种神经生长因子的分泌明显增加。这些生长因子能够促进神经组织增生，保护神经功能。有学者认为损伤脑组织匀浆的间充质干细胞的培养液中，不仅有脑组织中提取的生长因子，而且有间充质干细胞分泌的多种生长因子，共同刺激间充质干细胞向神经元样细胞的分化。有报道，双侧皮质挫伤时,在伤后12 h即有神经生长因子mRNA升高，伤后24 h与对照组相比可以增加6倍；至伤后36 h，尽管神经生长因子mRNA水平有所下降，但仍为对照组的3倍，而且损伤与非损伤部位无明显差异。损伤后12 h之前或12 h就有脑源性神经生长因子mRNA瞬时上调，到伤后24 h，虽然有所下降，但仍明显高于对照组；脑源性神经生长因子比神经生长因子有更快的应答，但到36 h两者都回到基线水平。因此，在本实验中选择脑创伤后24 h的组织匀浆来进行诱导。

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