1沧州市人民医院骨三科，河北省沧州市 061000； 2天津市天津医院脊柱外科，天津市
300211

曹希武，男，1964年生，河北省沧州市人，汉族，1987年唐山煤矿医学院毕业，主治医师，主要从事脊柱外科、关节外科研究。
czhcxwg-3@
163.com

通讯作者：苗 军，博士，天津市天津医院脊柱外科，天津市
300211 mj6688@163.com

国家自然科学基金资助项目（30500516）*

中图分类号: R394.2
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)03-00465-04

收稿日期：2007-07-23
修回日期：2007-09-27
(07-50-7-3964/GW Q)

Proliferation and phenotype characteristics of goat bone marrow mesenchymal stem cells cultured in vitro

Ａｂｓｔｒａｃｔ

ＡＩＭ: Studies on bone marrow mesenchymal stem cells are mostly in small animals such as mice or rabbits, but few in big animals. This study researched the biological features of bone marrow mesenchymal stem cells from goat used in tissue engineering.
ＭＥＴＨＯＤＳ:Experiments were conducted at Tianjin Hospital from January 2006 to January 2007. ①A Chinese goat aged ten month was offered by Animal Experiment Center of Tianjin Hospital. Animal intervention met the animal ethical standard. ②The mononuclear cells were isolated from 5 mL of fresh bone marrow by gradient centrifugation, and then inoculated in dishes. Cells were cultured and expanded with Dulbecco's modified Eagle's medium containing 0.10 volume fraction fetal bovine serum. Cell growth curve was determined with multiple-well culture plate. Phenotype of bone marrow mesenchymal stem cells was determined by immunohistochemical method with antibody of CD44.
ＲＥＳＵＬＴＳ:①Cultured bone marrow mesenchymal stem cells adhered to the wall, appeared morphologically as spindle and had many prominences.②Growth cycle of three generations of bone marrow mesenchymal stem cells at common inoculated density was similar. Two or three days before culture was growth lag phase. Three days later, cells grew rapidly and entered logarithmic phase. Seven or eight days later, the amount of cells was maximal and entered growth platform phase, and then cells grew slowly. ③Immunocytochemical staining showed bone marrow mesenchymal stem cells were positive for CD44.
ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ:The cultured bone marrow mesenchymal stem cells are not hematopoietic stem/progenitor cells. Bone marrow mesenchymal stem cells are a homogenous population of cells that have unique growth and phenotype characteristics.

Cao XW, Xu XK, Miao J, Wang XF, Kou BZ, Zuo BG, Xie CX, Ding GN, Cao FY, Yang L.Proliferation and phenotype characteristics of goat bone marrow mesenchymal stem cells cultured in vitro.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(3):465-468(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08/3/3k-465(ps).pdf]

摘要
目的：关于鼠、兔等小动物骨髓间充质干细胞的研究较多，而对大动物骨髓间充质干细胞研究较少。实验拟了解体外培养的羊骨髓间充质干细胞的生物学特性，以便于组织工程研究使用。
方法：实验于2006-01/2007-01在天津市天津医院完成。①实验材料：天津医院动物实验中心提供的健康中国山羊，10月龄，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：抽取羊骨髓5 mL，梯度离心制备单个有核细胞，并接种于无菌的50 mL塑料培养瓶中，培养体系为含体积分数为0.10 FBS的DMEM。利用多孔培养板对培养的骨髓间充质干细胞进行细胞生长曲线测定。选用抗CD44单克隆抗体，应用免疫组化学方法对培养的骨髓间充质干细胞进行表型鉴定。
结果：①培养的骨髓间充质干细胞黏附贴壁、呈纺锤状，并有多个突起。②一般细胞接种密度下的骨髓间充质干细胞，三代细胞生长周期基本一致，均为接种培养后前二三天，生长较缓慢，为生长迟滞期。3 d后细胞生长加速，有一快速增长过程，达到对数生长期，于七八天时，细胞数达最高值，为生长平台期，其后生长速度减缓。③免疫细胞化学染色后显示所培养细胞的细胞膜抗原CD44有阳性表达。
结论：培养的骨髓间充质干细胞具有较强的遗传稳定性和增殖能力，培养的细胞不是骨髓造血干/祖细胞，而是一群均一的间充质干细胞，具有独特的增殖和表型特征。
关键词：羊；骨髓间充质干细胞；体外培养；鉴定

曹希武，许效坤，苗军，王秀芬，寇炳祯，左炳光，谢晨学，丁光宁，曹富余，杨利.体外培养羊骨髓间充质干细胞增殖及表型特征[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(3):465-468
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-3/3k-465(ps).pdf]

0 引言

骨髓间充质干细胞具有容易获取、体外培养稳定、扩增能力强等优点，目前已成为组织工程种子细胞的首选[1-3]。本实验旨在建立成人骨髓间充质干细胞的体外培养体系，检测其基本的生物学特性，为以骨髓间充质干细胞为基础的骨组织工程提供实验基础。

1 材料和方法

设计：观察性实验。
单位：天津市天津医院。
材料：实验于2006-01/2007-01在天津市天津医院完成。天津医院动物实验中心提供的健康中国山羊，10月龄，体质量20 kg，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。
设计、实施、评估者：实验设计由第三作者完成，实施由第一、二、四、五、六、七、八、九、十作者完成，实验评估由第一、三作者完成，均经过培训。
方法：
羊骨髓间充质干细胞的分离和培养：山羊麻醉后,16 号骨穿针于髂后上棘处骨髓腔穿刺，待进针感觉到有明显的落空感后，用 10 mL注射器抽取骨髓5 mL，与等量的 DMEM培养液充分混匀（其中含肝素200 U/mL 抗凝）。将骨髓 1 000 r/min 离心5 min、弃含油脂的上清；加入DMEM 液吹匀至 15 mL，沿管壁缓慢均匀加入到含有等量淋巴分离液，以1 800 r/min 离心 15 min，可见离心管分为清晰的五层：最上层脂肪层；第2层血小板DMEM培养液层；第3层处于界面的很薄的乳白色云雾状单核细胞层；第4层淋巴细胞分离液；第5层红细胞和巨噬细胞层。吸取中间含有骨髓间充质干细胞的单核细胞层有核细胞层；再加入 DMEM 5 mL 吹打漂洗、 1 500 r/min 离心 5 min去上清，重复 3 次。在沉淀中加入原代培养液 10 mL，反复吹打制成单细胞悬液，接种到 50 mL培养瓶，每瓶加细胞混悬液 5 mL，置37 ℃、体积分数为0.05的CO2、饱和湿度孵箱内孵育，3 d后首次全量换液，以后每三四天换液1次。倒置显微镜下观察细胞变化，待 85%左右的瓶底细胞融合成单层后，用0.25%胰蛋白酶消化，离心收集，洗涤后再以5×107 L-1的密度接种，称为第一继代（P1）。待细胞再次长至90%汇合时，同法传代，称为P2、P3、P4……。
羊骨髓间充质干细胞的生长曲线测定：选择制作好P3、P5、P7细胞悬液以2×107 L-1 接种于24孔培养板，每孔1 mL，每天各取3孔消化贴壁细胞并计数，每孔计数3次，计算均值连续8 d。以培养时间为横轴，细胞数为纵轴，描绘细胞传代后生长曲线。
羊骨髓间充质干细胞的免疫组化学鉴定：取P3代的羊骨髓间充质干细胞的细胞悬液接种到加有盖玻片经多聚赖氨酸涂片的24孔板，当盖玻片上的细胞密度达 1×108 L-1时，取出盖玻片，4%多聚甲醛固定过夜，PBS振洗；3%双氧水灭活内源性活性酶，滴加正常兔血清，室温封闭 20 min；滴加一抗工作液（小鼠抗山羊CD44），4 ℃过夜，PBS振洗；滴加生物素化二抗兔抗小鼠IgG 37 ℃作用1 h；PBS振洗，滴加辣根酶标记的链酶卵白素37 ℃作用1 h；PBS振洗，用 DAB室温显色25 min；脱水、透明、中性树胶封固，光学显微镜下观察，拍照记录。
主要观察指标：①羊骨髓间充质干细胞形态学特征。②羊骨髓间充质干细胞的生长曲线。③羊骨髓间充质干细胞的免疫组织化学鉴定。

2 结果

2.1 羊骨髓间充质干细胞的形态学特征 刚接种的原代细胞在培养瓶底散在分布，呈圆形，胞体透亮，折光性好，细胞核呈卵圆形，有较多的骨髓造血系细胞混杂。3 d后换液可去掉大部分悬浮细胞，可见少量散在贴壁细胞，形态不均一，为梭形或不规则细胞，带有多个长的胞浆突起。9 d换液后悬浮细胞基本去除，瓶底散在的成聚集生长的细胞群落，细胞形态以不规则的多角形为主。15 d可见多处大片聚集生长的细胞群落，中心细胞为梭形可见二三个突起，并可见部分亮园形的向外围迁徙生长的细胞，见图1。

根据生长情况每4~7 d进行一次传代，传代细胞从瓶底消化下来后变为圆形，折光性好。传代细胞接种后 2~4 h即迅速贴壁、伸展，6~10 h左右活细胞基本完成贴壁，见图2；第2~5天细胞呈梭形或不规则的三角形，也有扁平形带突起的细胞，胞内可见2~4个核，细胞呈大体均匀分布，但有多个明显的梭形细胞集落呈克隆样生长；传代细胞的生长较原代快些，多于接种后7 d即可铺满整个培养瓶底，细胞密集单层排列，生长抑制，未见明显的钙化结节形成，见图3。

2.2 羊骨髓间充质干细胞生长曲线测定 一般细胞接种密度下的骨髓间充质干细胞自然生长情况，三代细胞生长周期基本一致，均为接种培养后前二三天，生长较缓慢，为生长迟滞期。3 d后细胞生长加速，有一快速增长过程，达到对数生长期，于七八天时，细胞数达最高值，为生长平台期，其后生长速度减缓，见图4。

2.3 羊骨髓间充质干细胞的免疫组织化学鉴定 培养细胞形态为梭形或不规则形态，可见多个突起；胞浆为深褐色，显示免疫细胞化学染色后的细胞膜抗原 CD44有阳性表达，见图5。

3 讨论

骨髓间充质干细胞是有多向分化潜能的原始骨髓细胞，在特定的条件下可向成骨细胞、软骨细胞、肌健、脂肪细胞、骨髓基质细胞、椎间盘细胞、血管内皮细胞及神经星状细胞分化，且易于获得及扩增，同时还易于转染基因，是作为骨组织工程种子细胞合适选择[4-9]。其次，其独特的细胞增殖分裂模式，使外源基因易于导入和表达，因此，骨髓间充质干细胞是潜在的基因治疗靶细胞[10-12]。此外，与胚胎干细胞相比，不存在法律、道德等因素限制。既往对鼠和兔间充质干细胞研究较多[8-9,13-14]，而大动物羊骨髓间充质干细胞研究较少。
具有多向分化潜能的骨髓间充质干细胞一般认为只占骨髓有核细胞的1/104~1/105[15-18]。Service [19]更是通过铺板培养比较不同年龄人群骨髓间充质干细胞与骨髓有核细胞的比率，结果显示：新生儿1/1万，年轻成人1/10万，50岁成人1/40万，80岁时为1/100万。为了得到组织工程学需要的单一细胞，人们尝试用各种方法分离、纯化骨髓间充质干细胞。目前较为常用的方法是利用各种细胞的密度差异，将所抽取的骨髓细胞进行梯度密度离心，吸取包含骨髓间充质干细胞的单个核细胞层进行培养。梯度密度离心法获得的细胞纯度较高，无血细胞等影响，便于早期观察。但与全骨髓法相比，此法所获细胞贴壁较晚，推测分选细胞的同时剔除了骨髓富含的各种豁附分子和生长因子，及分离液和长时间的室温操作对细胞造成损伤有关[20]。通过流式细胞仪、免疫磁珠分离系统等进行分选可获得高纯度的骨髓间充质干细胞，但对骨髓间充质干细胞的活性影响较大，甚至可能导致细胞完全失去活性。此外，目前还没找到敏感性和特异性都很高的骨髓间充质干细胞表面抗原[21-22]。
本实验选用10月龄中国山羊，采用梯度密度离心法，以密度为1.073 g/mL淋巴分离液分选骨髓间充质干细胞，操作简便，成本低廉。原代培养时经梯度密度离心法所获的单核细胞层中含骨髓间充质干细胞量较少，有较多的骨髓造血系细胞混杂。但其在体外培养时具有底物黏附特性，造血细胞等因无法贴壁而随换液被清除，3 d后换液可去掉大部分悬浮细胞，见少量散在贴壁细胞，形态不一，为纺锤型或不规则细胞，带有多个长的突起，核较大；9 d换液后悬浮细胞基本去除，骨髓间充质干细胞在瓶底呈散在成聚集生长的细胞群落，形态以不规则的多角形为主。经过二三代传代后即可得到纯度较高的骨髓间充质干细胞。
目前骨髓间充质干细胞没有发现高度特异的表面抗原，其表面能表达多种非特异性抗原，以及多种细胞因子和生长因子的受体，如CD29、CD44、CD120a等，而作为造血干细胞典型的表面抗原CD45，CD34和CD14则表达阴性[22-23]。
在本实验中，作者主要从以下几个方面来推断所培养细胞的干细胞属性：①形态学特征：作者所培养的细胞为纺锤型伴有多个突起形成；贴壁，呈集聚群落生长。原代培养时通过换液清除了“鹅卵石”样的造血系干细胞；在传代过程中作者通过对胰酶消化时间的控制，清除了贴壁黏附力很强的成纤维细胞，在二三代后即得到了高纯度、形态均一的细胞群落。②生长特性：作者选择P3、P5、P7代细胞制作生长曲线，三代细胞的生长曲线基本一致，潜伏期、对数增长期、平台期培养时间基本同步，表明其为同一干细胞的细胞来源。③表面抗原标记：免疫细胞化学检测结果显示所培养细胞的细胞膜抗原CD44有阳性表达，而这些抗原是造血干细胞表面没有的，说明培养的细胞不是骨髓中另一大类细胞——造血干细胞。通过对本实验的回顾性分析，证实本文所培养的细胞不是骨髓造血干/祖细胞、成纤维细胞，是处于未分化阶段的均一的骨髓间充质干细胞。

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