酒精性股骨头坏死股骨干骺端骨髓间充质干细胞细胞周期的变化****☆

酒精性股骨头坏死股骨干骺端骨髓间充质干细胞细胞周期的变化****☆

孙伟，王佰亮，李子荣，史振才，石少辉，程立明，王冉东

孙伟☆，男，1974年生，山东省青岛市人，汉族，2004年中国协和医科大学毕业，博士，副主任医师，主要从事骨坏死、关节外科、组织工程的研究。 sun887@163.com

首都医学发展基金重大联合项目（2002-1007）*；国家自然科学基金面上项目（30672117）*；中日友好医院博士启动课题（20056150）*；北京医学会骨科分会-默沙东骨质疏松科研项目*

中图分类号: R394.2
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)03-00469-04

Cycle of mesenchymal stem cells from femoral metaphysis in patients with alcohol-induced osteonecrosis of the femoral head

Ａｂｓｔｒａｃｔ

ＡＩＭ: Mesenchymal stem cells (MSCs) can play important roles in the pathogenesy of alcohol-induced osteonecrosis of femoral head. This study was aimed to detect MSCs cycle and proliferation activity in the region of proximal femoral head and neck and femoral metaphysis of the patients with alcohol-induced osteonecrosis with flow cytometry (FCM).
ＭＥＴＨＯＤＳ:From February to May 2005, the research was performed in Bone Circulation and Osteonecrosis Institute of China-Japan Friendship Hospital. Totally 10 patients diagnosing as having alcohol-induced osteonecrosis of femoral head were enrolled in the experimental group (ARCO Ⅱ,Ⅲ A), including 8 males and 2 females, averagely 36.9 years (28-46 years). Eleven femoral neck fracture (less then 1 week) patients without the history of osteonecrosis of femoral head and alcohol drinking were enrolled in the control group, including 8 males and 3 females, averagely 60 years (55-65 years). The bone marrow blood (3-5 mL) was collected with the agreement of patients. MSCs were harvested and centrifugated by density gradient centrifugation, and then selected by the adhesive method. Proliferation and cycle of second-generation MSCs were detected with FCM.
ＲＥＳＵＬＴＳ:Totally 21 testees were involved in the result analysis. The results indicated that percentage of cells at the G0/G1 phase was higher, but lower at the (S+G2/M) phase and the proliferation ability was reduced in the experimental group as compared with the control group (P < 0.05).
ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ:①The proliferation ability of MSCs may decrease in the alcohol-induced osteonecrosis of femoral head. ②Alcohol can result in osteonecrosis by decreasing proliferation activity or differentiation of MSCs to change the differentiating direction.

Sun W，Wang BL, Li ZR, Shi ZC, Shi SH, Cheng LM, Wang RD.Cycle of mesenchymal stem cells from femoral metaphysis in patients with alcohol-induced osteonecrosis of the femoral head.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(3):469-472(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-3/3k-469(ps).pdf]

摘要
目的：酒精性股骨头坏死发病机制中骨髓间充质干细胞可能起作用。实验采用流式细胞仪检测酒精性股骨头坏死患者股骨头颈及股骨干骺端骨髓间充质干细胞的细胞周期，观察其增殖活性。
方法：选择2005-02/2005-05在中日友好医院骨坏死与关节保留重建中心经临床及影像学确诊的酒精性股骨头坏死患者10例作为实验组（ARCO分期Ⅱ，ⅢA），男8例，女2例，平均36.9岁（28~46岁）；对照组：无股骨头坏死，无酒精饮用史的新鲜股骨颈骨折患者(< 1周)11例，男8例，女3例，平均60岁（55~65岁）。在患者知情同意条件下，手术抽取股骨头颈部骨髓血3~5 mL。采用密度梯度离心法分离人股骨头骨髓间充质干细胞，再经贴壁筛选法筛选，采用流式细胞仪法测定第2代骨髓间充质干细胞生长增殖水平及细胞周期。
结果：21例受试者均进入结果分析。流式细胞仪测定的细胞周期结果显示，与对照组比较，实验组G0/G1细胞比例升高，S+G2/M期细胞比例降低，增殖指数降低，两者差异有显著性意义(P < 0.05)。
结论：①酒精性股骨头坏死的股骨干近端骨髓间充质干细胞增殖活性下降。②酒精可能是通过降低骨髓间充质干细胞的增殖活性或增殖分化能力及改变其分化方向从而引起骨坏死。
关键词：骨坏死；骨髓间充质干细胞；发病机制

孙伟,王佰亮,李子荣，史振才,石少辉，程立明，王冉东.酒精性股骨头坏死股骨干骺端骨髓间充质干细胞细胞周期的变化[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(3):469-472 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-3/3k-469(ps).pdf]

非创伤性股骨头坏死的主要原因有激素性和酒精性，尽管存在许多学说，但其发病机理仍不十分并不清楚[1-5]。而骨髓间充质干细胞是一种多能干细胞，能够分化为成骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞及软骨细胞等多种细胞，并且在成骨细胞及脂肪细胞分化之间呈反向变化[6-7]。酒精性股骨头坏死的自行修复能力有限可能与这些患者股骨头颈及股骨干骺端骨髓间充质干细胞数量少，增殖活性弱有关。本实验拟检测此类患者骨髓间充质干细胞的数量与增殖活性，探讨酒精性骨坏死的成因及修复能力减弱的病因学。

设计：病例－对照观察。
单位：中日友好医院骨科骨坏死与关节保留重建中心，骨坏死与骨循环实验室。
对象：选择2005-02/2005-05在中日友好医院骨坏死与关节保留重建中心经临床及影像学确诊的酒精性股骨头坏死患者10例（ARCO分期Ⅱ，ⅢA），男8例，女2例，平均36.9岁（28~46岁）；对照组：无股骨头坏死，无酒精饮用史的新鲜股骨颈骨折患者(< 1周)11例，男8例，女3例，平均60岁（55~65岁）。在患者知情同意条件下，手术中抽取股骨头颈部骨髓血3~5 mL。主要试剂和仪器：LG-DMEM培养基购于美国GIBCO公司。胎牛血清（FBS），四甲基偶氮唑蓝(MTT)，胰蛋白酶，二甲基亚砜(DMSO)购于Sigma公司。酶标仪（Athnos 2010）购于澳大利亚Salzburg公司。流式细胞仪（Beckman Counter）。
设计、实施、评估者：设计评估为第一、二、三作者，实施为第二、五、六作者，均受过专业培训。
方法：
人骨髓间充质干细胞的分离培养和鉴定：无菌条件下由股骨头颈处（坏死区周围的正常区）采集骨髓3~5 mL，肝素抗凝，与PBS液1∶1混匀，叠加到等量密度为 1.073 g/mL Percoll分离液上，2 500 r/min离心25 min，收集单个核细胞层,用PBS液洗涤两次， 1 500 r/min离心10 min。细胞重悬于含体积分数为0.20胎牛血清的LG-DMEM培养液，按1.0×108 L-1密度接种于25 mL培养瓶，置 37 ℃，5%二氧化碳，饱和湿度的二氧化碳孵箱培养。48 h后更换培养液，弃取非贴壁细胞，以后三四天换液1次。于倒置相差显微镜下观察细胞培养全过程。待细胞长至瓶底的90%后,进行传代培养。贴壁细胞约80%~90%融合后用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化，胎牛血清中止，离心去除上清，加入20 %FBS LG-DMEM完全培养基悬浮，反复吹打后计数，以1×107 L-1的密度传代接种于25 mL培养瓶。
骨髓间充质干细胞的细胞周期检测：流式细胞仪测定细胞的生长周期：当第2代细胞长满瓶底的90%时，同上法消化，制成1×109 L-1的悬液。加入到浓度为80%的预冷乙醇中，于4 ℃环境中固定过夜，再经PBS洗涤及离心 5 min后，去除上清，加入PC缓冲液100 μL，于室温下混匀并放置30 min，继续离心加PBS洗涤，去上清后加PI(100 g/L)，RNA酶(100 mg/ L)各10 μL，PBS 40 μL避光30 min后，采用流式细胞仪分析细胞增殖周期。
检测指标：以增殖指数分析骨髓间充质干细胞分裂增殖水平，PI=[(S+G2/M) /(G0/G1+S
+G2/M)]×100%，同时进行DNA倍体分析。分别记录病例组和对照组研究对象的数据。
主要观察指标：骨髓间充质干细胞分裂增殖水平。
统计学方法：统计学处理由第二作者完成，各组数据用x(_)±s表示，采用Student's t 检验评价组间差异。应用SPSS 10.0软件进行统计学分析，P < 0.01为差异具有显著性意义。

2.1 参与者数量分析 21例受试者均进入结果分析，无脱失。
2.2 人骨髓间充质干细胞的分离培养在倒置显微镜下,实验组和对照组的细胞生长状态有很明显的不同。实验组和对照组的骨髓间充质干细胞原代培养于24 h后都开始有细胞贴壁现象发生, 细胞伸展成长梭型或多角型；48 h后开始有细胞集落形成,贴壁细胞增多，但实验组的细胞集落明显少于对照组;而对照组 3 d后细胞成典型的成纤维细胞形态，实验组
5 d后才有此形态改变；7 d后细胞集落不断扩大而融合成单层实验组10 d后才渐进融合为单层。传代后对照组的细胞均匀分布生长，于 2 h后开始有细胞贴壁；24 h内细胞完全贴壁，成条索状；六七天后长满瓶底；而实验组生长速度非常缓慢，10~12 d才长满瓶底。
2.3 流式细胞仪测定细胞的生长周期在流式细胞术中，通常用S期或G2/M+S期的百分比作为增殖指数，来表征细胞的增殖情况。据病例组和对照组相比，实验组G0/G1细胞比例明显高，而S+G2/M期细胞比例低，增殖指数较对照组降低，差异有显著性意义(P < 0.01)，见表1。

骨坏死又称缺血性坏死（avascular necrosis,AVN），无菌性骨坏死等。按国际骨循环学会（association research circulation osseons,ARCO）的定义，骨坏死（osteonecrosis, ON）是指由于各种原因（机械、生物等）使骨循环中断，骨的活性成分死亡及随后修复的一系列复杂病理过程[8-12]。股骨头坏死是慢性、进展性疾病，晚期会引起股骨头的塌陷。而股骨头塌陷的晚期治疗措施只能是进行人工关节置换，虽然各种原因引起的股骨头坏死（激素、酒精、特发性骨坏死等等）的病因和发病机制仍还不清楚。目前研究发现股骨头坏死可能是一种骨髓基质细胞疾病，是由于骨髓间充质干细胞的增殖活性和或分化能力及分化方向发生改变而引起股骨头坏死[13-14]。骨髓间充质干细胞是一种多能干细胞，能够分化为成骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞及软骨细胞等多种细胞, 这些细胞在骨和软骨组织的平衡中起重要作用，并且对创伤后的组织再生起重要作用，例如骨折后的愈合[15]。本实验目的就是通过体外检测酒精性骨坏死患者骨髓间充质干细胞的增殖活性，分析观察骨髓间充质干细胞的增殖活性的改变在酒精性股骨头坏死发病中的作用。
本实验结果显示，来自于皮质类固醇激素性骨坏死患者股骨头颈处（坏死区周围正常区）的骨髓间充质干细胞细胞的增殖情况明显差于对照组。倒置显微镜观察，两组细胞的生长状态有很明显的不同，实验组细胞状态明显不如对照组细胞，实验组细胞常变的粗大，细长，胞质颜色浅淡，增殖缓慢且不均匀；而对照组细胞显的较为短梭、集落生长，胞质颜色较深，增殖迅速且均匀。
细胞的生长周期主要有生长前期(G1)、合成期(S)期及有丝分裂期(G2/M)。S期和G2/M期一般都很稳定，细胞周期所经历的时间差异主要取决于G1期的长短。在流式细胞术中，通常用S期或G2/M+S期的百分比作为增殖指数，来表征细胞的增殖情况。本实验结果表明，骨髓间充质干细胞细胞第2代培养病例组和对照组相比，实验组G0/G1细胞比例明显高，而S+G2/M期细胞比例低，对照组G1期比例均明显降低，增殖期细胞(S+G2/M)的比例明显比升高，两者有显著性意义(P < 0.01)。本实验结果表明，实验组增殖指数降低，病例组的增殖指数降低，说明实验组间充质干细胞的增殖能力下降。
从酒精性骨坏死的股骨近端处取得的骨髓间充质干细胞，其增殖分化能力下降，在酒精性骨坏死的发病中可能起到一定作用，然而并不能知道酒精对骨髓间充质干细胞影响的明确机制[16-17]。韩国的Suh等[18]通过性能染色检测酒精性骨坏死病例股骨近端骨髓间充质干细胞的分化能力，发现酒精性骨坏死病例股骨近端骨髓间充质干细胞的增殖能力明显下降，同时其成骨能力下降，而成脂能力却增加，与本实验结果一致。
本实验发现，在体外来自于实验组骨髓间充质干细胞增殖能力即使缺乏了酒精的作用也降低，可见骨髓间充质干细胞功能的改变在酒精性骨坏死发病中起到一定作用。实验结果证实，酒精可能是通过降低了骨髓间充质干细胞的增殖活性或增殖分化能力及改变其分化方向从而引起骨坏死，而酒精性骨坏死患者的股骨头坏死区周围正常区域内骨髓间充质干细胞增殖活性下降，并引起的修复能力下降，可能也是导致酒精性骨坏死发生的机制之一。

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