青岛大学医学院内分泌科， 山东省青岛市
266003

杨 芬★，女，1966年生，河南省安阳市人，汉族，青岛大学医学院在读硕士，主治医师，主要从事骨髓干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞的研究。
qdyangfen2005@
126.com

通讯作者：杨乃龙，教授，主任医师，青岛大学医学院内分泌科，山东省青岛市
266003

中图分类号: R394.2
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)03-00473-04

收稿日期: 2007-09-03
修回日期：2007-10-26
(07-50-9-4822/GW Q)

Comparison between two isolation methods of human mesenchymal stem cells in vitro

Ａｂｓｔｒａｃｔ

ＡＩＭ: There is no standard isolation method of mesenchymal stem cells. Percoll density gradient centrifugation is treated as the traditional method among numerous methods but it is so complicated. This study compares whole bone marrow culture to traditional Percoll density gradient centrifugation in order to establish a better method in vitro.
ＭＥＴＨＯＤＳ:Experiments were conducted at Central Laboratory of Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College from September 2006 to June 2007. Bone marrow was supported by patients who had autologous stem cell transplantation by endocrinology department for diabetes treatment. The experiments had known by the patients and authorized by the hospital ethic committee. The two different methods, whole bone marrow culture and Percoll density gradient centrifugation, were compared in the number of cell clone, cell morphology, cell superficial mark, the differentiation into fat cell.
ＲＥＳＵＬＴＳ:① The number of clone cell by whole bone marrow culture was more than by Percoll density gradient centrifugation（P < 0.05）. There was no remarkable differentiation of morphological expression about mesenchymal stem cells using the two methods. They were both like long shuttle, clone growth. ②Immunofluorescence showed that positive CD44 expression and negative CD34 expression in the third generation of mesenchymal stem cells cultured by the whole bone marrow method was less than by Percoll density gradient centrifugation (t =2.639,P < 0.01). ③The third generation of mesenchymal stem cells gotten by the two methods could differentiate into fat cell by insulin and dexamethasone.
ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ:Compared with the Percoll density gradient centrifugation method, whole bone marrow method with advantages of rapid adherence, operated simply and high gain ratio is better isolation method of mesenchymal stem cells.

Yang F, Yang NL.Comparison between two isolation methods of human mesenchymal stem cells in vitro.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(3):473-476(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-3/3k-473(ps).pdf]

摘要
目的：目前尚缺乏标准的骨髓间充质干细胞分离方法，虽然Percoll密度梯度离心法被认为是较经典的方法，但该方法操作较复杂。比较全骨髓培养法与常用的Percoll密度梯度离心法分离成人骨髓间充质干细胞的差异，以寻找一种简便、经济、实用的人骨髓间充质干细胞体外分离方法。
方法：实验于2006-09/2007-06在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成。实验材料：行自体干细胞移植治疗的糖尿病患者骨髓由青岛大学医学院附属医院内分泌科提供，患者对实验知情同意，并经医院伦理委员会批准。实验方法：采用全骨髓培养法与Percoll密度梯度离心法从成人骨髓中分离骨髓间充质干细胞，比较两种方法所获得的贴壁细胞克隆数、细胞形态、细胞表面标志及向脂肪细胞的分化情况。
结果：①全骨髓培养法获得的贴壁细胞克隆数明显多于Percoll密度梯度离心法（P < 0.05）。两种方法获得的人骨髓间充质干细胞形态无明显差异，均为长梭形，克隆样生长。②免疫荧光显示，全骨髓培养法分离培养的第3代骨髓间充质干细胞 CD44阳性表达率和CD34 阴性表达率均略低于Percoll密度梯度离心法, 但两者之间的差异无统计学意义(t =2.639,P < 0.01)。③两种方法获得的第3代骨髓间充质干细胞经地塞米松、胰岛素诱导后均可分化脂肪细胞。
结论：与传统的Percoll密度梯度离心法比较, 全骨髓培养法获得的骨髓间充质干细胞贴壁较快，传代时间略早，细胞数量多。
关键词：成人骨髓间充质干细胞；种子细胞；细胞培养

杨芬，杨乃龙.两种体外分离成人骨髓间充质干细胞方法的比较[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(3):473-476
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-3/k-473(ps).pdf]

0 引言

种子细胞是是临床组织工程中最重要的环节之一[1-2]。骨髓间充质干细胞为存在于骨髓腔内的多潜能干细胞,可在体内外分化为各种类型的细胞[3]，如脂肪细胞、骨细胞、神经细胞[4-6]，也有人将其诱导分化为胰岛素分泌细胞等[7-8]。可为临床组织工程中软骨组织的损伤修复、神经系统的损伤修复及糖尿病等的干细胞移植治疗提供种子细胞。但与造血干细胞相比，骨髓中间充质干细胞含量并不丰富，很有必要建立一种简便、经济、实用的人骨髓间充质干细胞体外分离方法。在众多分离人骨髓间充质干细胞的方法中，Pittenger等[3]报道的Percoll(1.073 g/mL)密度梯度离心法被认为是经典的方法，但该方法操作较为复杂,本实验应用全骨髓培养法分离人骨髓间充质干细胞,并将其与Percoll (1.073 g/mL)密度梯度离心法进行了详细的比较。

1 材料和方法

设计：以细胞为对象，对比观察实验。
单位：青岛大学医学院附属医院内分泌科。
材料：实验于2006-09/2007-06在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成。骨髓来源于青岛大学医学院附属医院内分泌科行自体干细胞移植治疗的糖尿病患者10例，均为男性,年龄20~50岁，平均年龄（35±10）岁，均无造血系统疾病，患者及家属均同意捐献，并经医院伦理委员会批准。低糖DMEM培养基、高糖DMEM 购自美国GIBCO公司;胎牛血清(FBS) 购自杭州四季清；Percoll细胞分离液、 FITC标记鼠抗人CD44 单克隆抗体、PE标记鼠抗人CD34单克隆抗体均购自美国Sigma公司；其它常规试剂为国产分析纯或进口分装。
设计、实施、评估者：实验的设计、评估为第一、二作者，实施为第一作者。
方法：
骨髓的获取：自体干细胞移植术中，留取患者的肝素化骨髓血4 mL，在超净工作台内分为0.5 mL(A)和3 mL（B）两组，分别加入A、B两支离心管中进行以下两种方法分离培养。
骨髓间充质干细胞的体外分离培养：全骨髓培养法：于A管的0.5 mL骨髓血中加入5 mL含体积分数为10%FBS的LG-DMEM培养液, 以吸管混匀后, 直接接种于50 mL 培养瓶中，于5%CO2、37 ℃培养箱进行培养；48 h首次换液,以后每3 d换液1次。均为全量换液。细胞长至80%融合后以0.25%胰酶消化传代。传至第3代后计数获得的有核细胞数并进行细胞标志物及诱导鉴定。
Percoll密度梯度离心法：于B管的3 mL骨髓中加入等量的PBS混匀,缓慢叠加到另一装有9 mL Percoll (11 073 g/mL)分层液的15 mL离心管中，20 ℃， 1 500 r/min，离心30 min；收集中间的白膜层, 加入 10 mL PBS吹打均匀，20 ℃，1 000 r/min，离心20 min,弃上清;再加入5 mL PBS冲洗积2遍，每遍均为20 ℃, 1 000 r/min, 离心20 min, 弃上清；将有核细胞加入含体积分数为10%FBS的LG-DMEM培养 液,以吸管混匀后，以1×109 L-1密度接种于50 mL 培养瓶中，置体积分数为0.05的CO2培养箱37 ℃培养；48 h首次换液，此后每隔3 d换液1次，均为全量换液；相差显微镜下观察贴壁细胞的集落数及形态，细胞达80% 融合后以0.25%胰酶消化传代。传至第3代后计数获得的有核细胞数并进行细胞标志物及诱导鉴定。
骨髓间充质干细胞的鉴定 ：
骨髓间充质干细胞表面标志物鉴定：取第3代细胞，等密度接种于培养瓶中，经CD44 抗体、CD34 抗体标记免疫荧光鉴定。
骨髓间充质干细胞体外成脂诱导鉴定：成脂诱导：取第3代细胞，用10-8 mmol/L的地塞米松、10 mg/L的胰岛素的无血清HG-DMEM诱导，于诱导的14 d后行油红O染色。
主要观察指标：①细胞形态。②有核细胞计数。③骨髓间充质干细胞的表面标志物表达。 ④骨髓间充质干细胞体外成脂诱导。
统计学方法：由第一作者采用SPSS 10.0统计学软件进行统计处理，所有数据均用x(_)±s表示，组间比较采用 t 检验。

2 结果

2.1 骨髓间充质干细胞形态、生长情况的观察 全骨髓培养法:接种后红细胞很多,覆盖整个培养瓶底。首次换液后大量血细胞被除去,，可见散在贴壁的梭形或多角形细胞,分布不均,部分呈巢状生长。6~8 d 可见形成多个成纤维样细胞集落，集落周围可见少量其他圆形细胞生长，12~16 d 成纤维样细胞增多汇集成片可以传代。传二三代之后形成较为均一的长梭形细胞，见图1。
Percoll密度梯度离心法:刚接种的细胞呈球形悬浮于培养液,并混有少量血细胞。第一二天可见部分细胞形态开始变形并贴壁，第2天全量换液,可见贴壁细胞变成梭形，分布不均，6~12 d 沿贴壁细胞逐渐增多，部分呈巢状生长,形成多个成纤维样细胞集落，15~20 d 细胞逐渐汇集成片可以传代。传代后细胞生长速度快,形成较为均一的长梭形,其他形态的细胞极少见，见图2。

上述两种方法分离培养的骨髓间充质干细胞在传一二代后, 生长速度、传代次数无差别，1∶3传代可以连续传代8代。2~4代骨髓间充质干细胞生长迅速，平均四五天传代1 次；5~7代以后增殖变慢，10~12 d传代1次；至第8 代左右，细胞生长缓慢，13~19 d 才长满瓶底,细胞伸展较大，不规则,胞质稀薄，细胞中出现颗粒，折光性弱，同时伴细胞崩解、死亡。
骨髓间充质干细胞扩增至第3代，计数两种方法获取的细胞数，5 mL骨髓分离培养的骨髓间充质干细胞数全骨髓培养法平均可达（0.67±0.28）×108，而密度梯度离心法的平均细胞数为（0.75±0.21）×107，两者之间差异具有统计学意义(t =2.639，P < 0.01) 。
2.2 骨髓间充质干细胞表面标志测定 免疫荧光结果表明，全骨髓培养法和密度梯度离心法分离培养的第3代骨髓间充质干细胞均较强表达CD44，低表达CD34。阳性表达率的差异无统计学意义(P > 0.05)，见表1。

2.3 骨髓间充质干细胞体外成脂诱导分化鉴定 两种方法分离培养的第3代骨髓间充质干细胞用地塞米松、胰岛素均能诱导为脂肪细胞,油红O染色镜下可见细胞内染成橙红色的脂肪滴，见图3，4。

3 讨论

3.1 骨髓间充质干细胞的体外分离方法 自1966年Friedenstein等[9]首先从骨髓中分离培养出骨髓间充质干细胞之后，人们提出了多种从骨髓中分离骨髓间充质干细胞的方案，其基本思路是利用物理、化学方法和的贴壁特性，将骨髓血中的大量红细胞、白细胞、造血干细胞等与骨髓间充质干细胞分离[10-11]。常用的方案主要有：全骨髓培养法、密度梯度离心法和流式细胞仪分选法。全骨髓培养法:将抽取的骨髓不经任何处理加入完全培养基稀释后进行培养,其中的外周红细胞、白细胞和造血干细胞等可随着换液而逐渐被清除, 而骨髓间充质干细胞则黏附于培养瓶底得以纯化；Percoll或Ficooll密度离心法[12]：利用骨髓中各种细胞的密度不同, 通过密度梯度离心分离并吸取单个核细胞层进行培养；免疫磁珠或流式细胞仪分选法[13-15]：通过骨髓间充质干细胞表面带有或缺失的抗原成分进行正选或负选而获得相对纯化的骨髓间充质干细胞。 然而到目前为止,还没有一种方法被视为是分选骨髓间充质干细胞的标准方法。Percoll密度梯度离心法被认为是最经典的方法，但该方法操作较为复杂。免疫磁珠或流式细胞仪分选法则价格昂贵。虽有报道说全骨髓培养法由于造血谱系细胞的影响很难得到比较
纯的骨髓间充质干细胞，但该实验用全骨髓培养法分离的骨髓间充质干细胞，用含10%血清的低糖DMEM培养，定期换液和传代后，发现全骨髓培养法分离出的骨髓间充质干细胞虽然原代形态不如Percoll密度梯度离心法得到的细胞形态一致性好，纯度较低，但传二三代后纯度增高，与Percoll密度梯度离心法并无明显差异。且该方法具有操作简便、经济、细胞得率高等优点，值得推广应用。
3.2 骨髓间充质干细胞的鉴定 一般认为 CD44 (一种细胞表面黏附分子)是骨髓间充质干细胞一个较特异性标志[16-17]，骨髓间充质干细胞不表达造血细胞表面抗原，如造血前体细胞标志抗原 CD34[18]，因此免疫荧光测CD44和CD34表达情况可作为骨髓间充质干细胞的鉴定方法之一[19-20]。另外骨髓间充质干细胞是一种很有潜力的多功能干细胞,具有分化为脂肪细胞、神经细胞、胰岛细胞、肝细胞等的能力[3-5]，如果分离骨髓血得到的细胞可诱导分化为其他细胞，也说明它具有分化潜能，具有干细胞的特性，此为逆推法鉴定[21]。本实验采用两种方法分离骨髓血得到的细胞均为克隆样生长，第3代细胞免疫荧光显示大部分细胞CD44阳性，CD34阴性。用地塞米松、胰岛素能诱导为脂肪细胞，油红O染色阳性，用碱性成纤维细胞生长因子诱导后能形成神经网格样结构、NSE染色阳性的神经细胞。证明分离培养的细胞均为具有多项分化潜能的骨髓间充质干细胞。
3.3 两种方法比较的结果 本实验的结果表明，与传统的Percoll密度梯度离心法比较，全骨髓培养法获得的骨髓间充质干细胞贴壁较快，传代时间略早，细胞数量明显多于Percoll密度梯度离心法，推测可能是全骨髓培养法保存了骨髓微环境中的丰富的生长因子，而离心法可能去除了这些因子，并且分离液和长时间的常温操作可能对细胞有损伤，影响了骨髓间充质干细胞 快速生长。 两种方法得到的骨髓间充质干细胞在传代后细胞形态、生长速度、生命周期、表面标志物及诱导分化能力等方面均无明显的差别。
综上所述，与传统的Percoll l密度梯度离心法相比，全骨髓培养法操作步骤简单，既降低了离心对细胞的损害，又减少了污染机会，具有培养时间较短，细胞得率较多的优点。另外，全骨髓培养法只需少量的骨髓即可获取大量的骨髓间充质干细胞，减少了临床抽取骨髓的工作量和骨髓穿刺对患者的损伤，可以较好地满足临床需要。因此认为全骨髓培养法是一种较为简便、经济、实用的人骨髓间充质干细胞体外分离方法，可作为临床组织工程中软骨组织的损伤修复、神经系统的损伤修复及糖尿病等的干细胞移植治疗中获得种子细胞的有效途径。

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