解放军总医院妇产科，北京市 100853

闫志风☆，女，1978年生，山东省招远市人，汉族，解放军总医院在读博士，医师，主要从事胚胎干细胞应用方面的研究。
yanzhifeng2002@
163.com

通讯作者：李亚里，硕士，教授，博士生导师，解放军总医院妇产科，北京市 100853
li_yali@hotmail.
com

全军医药卫生科研基金课题（06G101）*

中图分类号: R394.2
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)03-00485-05

收稿日期: 2007-08-17
修回日期：2007-11-06
（07-50-8-4464/ZS Q）

Isolation and identification of stem cells from fetal islets

Ａｂｓｔｒａｃｔ

ＡＩＭ:Stem cells or progenitor cells from the pancreas can differentiate into insulin-producing cells in vitro or in vivo, but the stem cells from adult pancreas had bad proliferation. We aimed to isolate and identify stem cells from in fetal islet-like cell clusters, and to find available cell resource for diabetes cell-transplantation therapy.
ＭＥＴＨＯＤＳ:Experiments were performed at the Laboratory of Stem Cell and Regeneration, Beijing Institute of Transfusion Medicine, Military Medical Academy of Science from October 2006 to July 2007. ①Human fetal pancreata at 14-20 gestational weeks were provided by Department of Obstetrics and Gynecology, General Hospital of Chinese PLA after the termination of pregnancy. Pregnants signed an informed consent. The experimental procedures were approved by hospital ethical committee. ② The human fetal pancreata were taken out in sterile station and were digested by 0.5 g/L collagenase type V at 37 ℃, then the fetal islet-like cell clusters were obtained for suspension culture. Islet-like cell clusters were plated on Petri dish in RPMI 1640 medium containing 0.1 volume fraction of fetal calf serum, 1 mmol/L sodium pyruvate, 1 mmol/L glutamine, 71.5 μmol/L β-mercaptoethano, 100 U/mL penicillin and 100 mg/L streptomycin, and the dishes were changed everyday to remove the attached cells. After cultured in suspension for 72 hours, the islet-like cell clusters were handpicked out and plated on tissue culture dishes, when the cells grew out form islet-like cell clusters and became monolayer epithelium-like cell clones the cells were passaged. ③Islet-like cell clusters were treated with dithizone staining. A small quantity of islet-like cell clusters and the fourth passage cells were plated on 24- and 96-well plates respectively. The expression of several kinds of molecular markers such as proliferating cell nuclear antigen, PDX-1, Nestin, keratin-19, Vimentin, Insulin, Glucagon and CD29 were identified by immunofluorescence staining. The growth curve of the 6th passage cells was measured by MTT.
ＲＥＳＵＬＴＳ:①The isolated islet showed cluster-shape, with irregular edge, and islet-like cells were scattered. Monolayer epithelium-like cell colonies were obtained in islet-like cell clusters. After passage, cells were fusiform or branch-shape, and amplified rapidly. ②The isolated islet-like cell clusters were DTZ-staining positive. ③Majority of the attached first passage cells expressed proliferating cell nuclear antigen, PDX-1, Nestin and Vimentin, whereas minority of them expressed Insulin and Glucagon, but none of them expressed keratin-19. After passage, the cells still expressed proliferating cell nuclear antigen, PDX-1, Nestin and Vimentin, slenderly expressed keratin-19, but did not express Insulin and Glucagon. None of the cells express CD29. ④The third passage cells were in logarithmic growth phase. At day 6, the cells entered into plateau phase. The growth curve shape was "S".
ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ:The self-renewable cells can be obtained from fetal islet, which express multifold characteristic markers of pancreatic stem cells, but not islet markers. It is indicated that islet-like cell clusters can be used as pancreatic stem cells in the treatment of diabetes mellitus.

Yan ZF, Li YL, Wang J, Peng HM, Yang YZ, Guan Z.Isolation and identification of stem cells from fetal islets.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(3):485-489(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-3/3k-485(ps).pdf]

摘要
目的：已证实胰腺来源的干细胞或祖细胞在体内外均能分化为胰岛素分泌细胞，但成人胰腺来源的干细胞增殖潜能较差。实验旨在分离并鉴定胎儿胰岛样细胞团中的干细胞，为糖尿病细胞移植治疗寻找可用的种子细胞。
方法：实验于2006-10/2007-07在解放军军事医学科学院输血研究所干细胞与再生医学研究室完成。①对象：所用胰腺标本取自流产胎儿，胎龄14~20周，由解放军总医院妇产科提供，胎儿组织的使用得到孕妇本人的知情同意，实验经医院医学伦理委员会批准。②实验方法：无菌条件下取出胎儿胰腺，37 ℃下用0.5 g/L的V型胶原酶进行消化，分离得到胎儿胰岛样细胞团，悬浮培养，加入含体积分数为0.1胎牛血清、1 mmol/L丙酮酸钠、1 mmol/L谷氨酰胺、71.5 μmol/L β-巯基乙醇、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI1640培养基，每日转皿除去贴壁细胞，72 h后挑选出悬浮生长的胰岛样细胞团予以贴壁培养，待长成上皮样单层细胞克隆时传代。③实验评估：将悬浮培养的胰岛样细胞团行双硫腙染色。另将少部分胰岛样细胞团及第4代细胞种植于24，96孔板中，采用免疫荧光染色检测细胞表面分子标志物增殖细胞核抗原、胰十二指肠同源盒基因1、Nestin、角蛋白19、波形蛋白、胰岛素、胰高血糖素、CD29的表达情况。MTT法分析第6代细胞的生长曲线。
结果：①悬浮及贴壁培养的胰岛形态：刚分离出的胰岛呈簇状，边缘不规整，细胞排列较疏松。贴壁后胰岛样细胞团由簇状逐渐展开形成上皮样单层细胞克隆。传代后细胞形态发生改变，呈梭形或分支样，增殖较快。②悬浮培养的胰岛双硫腙染色检测：分离得到的胎儿胰岛样细胞团双硫腙染色呈阳性表达。③细胞表面标志免疫荧光染色检测：贴壁的第1代细胞大部分呈增殖细胞核抗原、胰十二指肠同源盒基因1、Nestin、波形蛋白阳性，极少数细胞呈胰岛素、胰高血糖素阳性，而角蛋白19为阴性。传代后仍呈增殖细胞核抗原、胰十二指肠同源盒基因1、Nestin、波形蛋白阳性，角蛋白19弱阳性，而胰岛素、胰高血糖素为阴性，所有细胞均不表达CD29。④细胞生长曲线：传代第3天细胞进入对数生长期，第6天进入平台期，细胞生长曲线呈“S”形。
结论：由胎儿胰岛成功分离并培养出具有自我更新和良好增殖能力的干细胞，稳定表达多种胰腺干细胞特征性标志，而不表达胰岛细胞标志物，提示该细胞可作为候选的胰岛干细胞用于糖尿病细胞移植治疗。
关键词：胰岛样细胞团；干细胞；胎儿胰腺；糖尿病

闫志风，李亚里，王晶，彭红梅，杨怡卓，关铮.胎儿胰岛中干细胞的分离与鉴定[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(3):485-489 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-3/3k-485(ps).pdf]

0 引言

糖尿病是以慢性高血糖伴随因胰岛素分泌及/或作用缺陷引起的一种多病因代谢疾病，Edmonton方案的成功[1]，使胰岛移植成为治愈糖尿病最有希望的方法，但广泛开展仍受供体来源匮乏和免疫排斥的限制。
近年来干细胞领域研究为多种疾病的细胞移植治疗提供了新的种子细胞，包括胚胎干细胞[2]和成体干细胞[3-4]。理论上成体干细胞更易于向具有分泌功能的胰岛细胞分化，已有学者证实胰腺来源的干细胞或祖细胞在体内外均能分化为胰岛素分泌细胞[5-7]，但成人胰腺来源的干细胞增殖潜能较差。人胎胰腺形态学研究显示[8]，14~20周是胰岛发育的高峰，此期胰岛干细胞的增殖分化功能最活跃。本实验分离出14~20周人胎儿胰腺的胰岛样细胞团，贴壁培养后对其增殖能力、表面标志物表达进行分析鉴定，以期从胎儿胰岛中获得干细胞，为糖尿病细胞移植治疗提供可选择的种子细胞，并为胚胎干细胞定向诱导分化为胰岛细胞提供实验基础。

1 材料和方法

设计：细胞观察实验。
单位：解放军总医院妇产科。
材料：实验于2006-10/2007-07在解放军军事医学科学院输血研究所干细胞与再生医学研究室完成。①对象：所用胰腺标本取自流产胎儿，胎龄14~20周，由解放军总医院妇产科提供，胎儿组织的使用得到孕妇本人的知情同意，实验经医院医学伦理委员会批准。②试剂：RPMI-1640，谷氨酰胺，β-巯基乙醇（Gibco）；胎牛血清（Hyclone）；V型胶原酶，胰酶，EDTA，丙酮酸钠，双硫腙，二甲亚砜（Sigma）；羊抗人胰十二指肠同源盒基因1单抗（Santa Cruz）；CD29-PE单抗（R&D）；兔抗人Nestin抗体，小鼠抗人增殖细胞核抗原，抗人波形蛋白，抗人角蛋白19，抗人胰岛素，抗人胰高血糖素多抗（武汉博士德）；羊抗兔IgG-FITC，羊抗小鼠IgG-FITC，兔抗羊IgG-TRITC荧光二抗（北京中杉金桥）。
设计、实施、评估者：实验设计为第一、二、四作者，干预实施为第一、三、五、六作者，结果评估为第二、四作者，均经过系统培训，未使用盲法评估。
方法：
胎儿胰岛的分离与培养：胎儿娩出后2 h内无菌条件下取出胰腺，冷D-Hanks联合双抗漂洗两三次，去除包膜，眼科剪剪碎成约1 mm3的小块，加入适量浓度V型胶原酶，37 ℃消化20~30 min，加入冷D-Hanks液终止消化，并反复吹打成组织悬液，200目筛网滤过除去组织块，300 r/min离心漂洗5 min，弃上层单细胞悬液，重复一遍，除去大部分单细胞，加入含体积分数为0.1的胎牛血清、1 mmol/L丙酮酸钠、1 mmol/L谷氨酰胺、71.5 μmol/L β-巯基乙醇、100 U/mL青霉素、 100 mg/L链霉素双抗的RPMI 1640培养基，接种于 100 mm细菌培养皿中，置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度孵箱中，胰岛悬浮生长，非胰岛细胞贴壁。24 h后吸出上清液及悬浮胰岛样细胞团，低速离心后半量更换培养液，接种于新培养皿，每隔24 h重复转皿操作，共三四次，非胰岛细胞基本消失。72~96 h后镜下挑选出悬浮生长的胰岛样细胞团，添加新培养基，取少量接种于24孔板，其余接种于100 mm组织培养皿中，隔日换液。自分离出胰岛进行培养开始，每日用倒置显微镜观察悬浮胰岛样细胞团或贴壁细胞生长状态，贴壁细胞展开呈良好单层后，用2.5 g/L胰酶+0.1 g/L EDTA液消化传代。
胰岛双硫腙染色：称取双硫腙粉末10 mg溶于1 mL二甲亚砜液，取20 μL加入到2 mL KRBB(pH=7.4)缓冲液中，滤过除菌。吸取部分培养24，48 h的胰岛，低速离心弃上清，磷酸盐缓冲液漂洗1次后各加入上述双硫腙溶液 1 mL，37 ℃孵育15~20 min，磷酸盐缓冲液洗两遍，倒置显微镜下观察着色情况。
细胞表面标志物免疫荧光染色检测： 对接种于24孔板中的胰岛样细胞团贴壁后形成的上皮样细胞克隆进行免疫荧光染色，第4代细胞以3×103/孔种植于96孔板，培养4 d后同样进行免疫荧光染色。荧光显微镜下观察着色情况、拍照。
细胞生长曲线MTT法测定：取生长状态良好的第6代细胞，胰酶消化制成细胞悬液，以2×103个/孔种植于96孔板，200 μL/孔，5孔/组，分7组，连续培养 7 d，隔日换液，每天取一组，加入5 g/L的MTT溶液20 μL，37 ℃孵育4 h，弃上清后每孔加入DMSO 150 μL，振荡10 min使甲臜结晶溶解，在酶联仪上以参比波长650 nm、测量波长490 nm测定各孔吸光度值（A），并求出均值，以细胞生长时间为横轴、吸光度均值为纵轴绘制生长曲线。
主要观察指标：①悬浮及贴壁培养的胰岛形态。②悬浮培养的胰岛双硫腙染色检测。③细胞表面标志免疫荧光染色检测。④细胞生长曲线。

2 结果

2.1 悬浮及贴壁培养的胰岛形态 刚分离出的胰岛呈簇状，边缘不规整，细胞排列较疏松，随着培养时间延长，细胞团逐渐增大，边缘规整，细胞排列紧密；更换为组织皿后胰岛贴壁，上皮样细胞从周边到中心逐渐展开生长，24 h后边缘细胞展开，中央细胞仍呈簇状，48 h后大部分细胞展开，72 h后绝大部分细胞展开成单层（图1a），四五天胰岛细胞团充分展开并形成良好的上皮细胞单层，六七天后细胞传代，传代后细胞形态发生改变，呈梭形或分支样（图1b）。

2.2 悬浮培养的胰岛双硫腙染色检测 胰岛β细胞含有高浓度锌，锌螯合剂双硫腙能与β细胞中的锌结合呈现棕红色，故可作胰岛的染色剂。悬浮培养24，48 h的胰岛样细胞团，双硫腙染色呈阳性，细胞团呈现棕红色（图2）。

2.3 细胞表面标志免疫荧光染色检测
2.3.1 胰岛贴壁后细胞标志物检测 种植于24孔板中的胰岛样细胞团四五天后展开形成上皮样细胞克隆，细胞排列较紧密，免疫荧光染色显示大部分细胞呈增殖细胞核抗原、胰十二指肠同源盒基因1、Nestin阳性（图3a，b，c），部分细胞呈波形蛋白阳性（图3d），极少量细胞仍表达胰岛素、胰高血糖素，但角蛋白19、CD29均为阴性。

2.3.2 第4代细胞标志物检测 种植于96孔板中的第4代细胞，呈增殖细胞核抗原、胰十二指肠同源盒基因1、Nestin、波形蛋白阳性，CK19弱阳性（图4a，b，c，d，e），不表达胰岛素、胰高血糖素。证明细胞可持续表达增殖细胞核抗原、胰十二指肠同源盒基因1、Nestin，而波形蛋白表达有所增强，角蛋白19微量表达，胰岛素、胰高血糖素传代后表达消失，仍未检测到CD29的表达。

2.4 细胞生长曲线 传代后第1~3天细胞增殖较慢，第4天开始细胞进入快速增殖期，第6天进入平台期，根据吸光度值绘制细胞生长曲线呈“S”形，见图5。

3 讨论

胰岛细胞移植治疗是近年来在分子生物学、免疫学及生物工程学基础上发展起来的一种治疗糖尿病的新方法，因其具有简便、微创、可重复等优点逐渐成为糖尿病治疗的热点，但受到胰岛来源匮乏的制约。近年来干细胞领域取得的研究进展为解决胰岛细胞来源的难题带来了希望，包括成体干细胞和胚胎干细胞。对于胰岛而言，成体干细胞包括胰腺导管细胞、Nestin+胰岛前体细胞及胎儿/新生儿胰岛中的干细胞等，理论上胰岛干细胞的培养和诱导分化可获得大量的胰岛细胞，从而有望解决胰岛细胞来源缺乏的问题。但关于胰腺/胰岛干细胞的来源、分子标志物仍存在争议。因成人胰腺组织成分复杂，胰岛细胞增殖能力较差，而20周前的胎儿胰腺外分泌部尚未发育完全，胰岛细胞增殖能力强，故本实验以14~20周胎儿胰岛为对象，对其进行贴壁培养，待形成单层上皮细胞后进行传代扩增，继而获得了具有良好增殖能力的细胞，并对其分子标志物和生长特性进行检测。
胰十二指肠同源盒基因1，又名胰岛素启动子因子1，具双功能：其一，早期在胰腺原基中表达，对胰腺发生发育过程起到至关重要的作用[9]，其缺失可致胰腺不发育[10]；其二，维持成熟β细胞形态和正常功能，是调控胰岛素基因转录、胰岛素颗粒成熟和分泌的重要转录因子，若突变灭活一条胰十二指肠同源盒基因1等位基因，胰岛素分泌水平则下降[11]，同时灭活两条胰十二指肠同源盒基因1等位基因，会导致胰腺发育不全和严重的糖尿病[9,12]，故胰十二指肠同源盒基因1已成为目前公认的胰腺干细胞的重要标志，而增殖细胞核抗原主要显示细胞的增殖能力，本实验获得的细胞稳定表达胰十二指肠同源盒基因1和增殖细胞核抗原，可以认为具备了胰腺干细胞的基本特性。
胰腺再生模型研究证实[13-14]，胰腺导管中存在干细胞，成年机体的胰导管组织中部分细胞经体外培养能快速增殖，失去导管上皮细胞特异性表型，具多向分化潜能，在合适的外源刺激下可分化成胰岛细胞，称之为胰腺干细胞。Ramiya等[7]从未发病的糖尿病小鼠胰腺分离出的导管细胞具干细胞特征，在体外培养诱导后呈典型的胰岛样结构，分泌胰岛素受葡萄糖调节，并表达许多胰岛细胞的标志，可完全逆转小鼠的糖尿病状态。Bonner-Weir等[15]在体外成功分离培养人胰腺导管细胞，将其诱导分化为有组织结构的胰岛样细胞团，其中具有角蛋白19阳性的导管细胞和胰岛素阳性的胰岛细胞。Gmyr等[16]发现成人角蛋白19阳性细胞在体外能再次表达胰岛素启动子因子1，表明角蛋白19可能成为胰腺干细胞的标志之一。本实验获得的第1代贴壁细胞无角蛋白19表达，在传代后失去上皮细胞的形态，但免疫荧光染色显示呈弱角蛋白19表达。
哺乳动物早期胚胎发育过程中，神经元和胰岛细胞的表型有相似之处，发育中的胰岛细胞表达多种神经元特有的标志物，如Nestin。近年发现的胰腺Nestin+细胞也是与胰腺发育密切相关的一种多能干细胞，在体外可自发形成胰岛样细胞团，经诱导产生胰岛素阳性的类β细胞。胰腺导管中存在的Nestin+胰岛前体细胞，不表达角蛋白19或成熟胰岛细胞标志，但表达胰十二指肠同源盒基因1，是不同于导管的胰岛前体细胞。Zulewski等[17]从成年大鼠胰岛分离得到了能分化为胰腺内、外分泌细胞和肝细胞的Nestin+多潜能干细胞；Kim等[18]发现部分切除的在体胰腺中，Nestin+导管细胞大量增生形成胰岛样细胞团，转分化为能分泌胰岛素的β细胞；Huang等[19]证实胎胰来源的Nestin+胰岛前体细胞也能分化为有功能的胰岛β细胞，形成的胰岛样细胞团可纠正糖尿病小鼠的高血糖；Yue等[20]将灵长类胚胎干细胞来源的Nestin+细胞进一步诱导得到胰岛样细胞簇，表达大量的β细胞基因，移植到糖尿病小鼠能逆转其高血糖。以上证明胰腺源性和胚胎干细胞源性Nestin+细胞为多潜能细胞，能诱导分化为胰岛素分泌细胞。但也有学者认为Nestin+细胞非胰岛前体细胞，如Zhang等[21]研究显示，胎儿胰腺中Nestin阳性细胞与间充质干细胞具有相同的标志；Lardon[22]、Shimizu 等[23]认为，胰腺中的Nestin+细胞是间充质来源，Nestin表达于血管内皮细胞，与波形蛋白共表达；Hao等[24]研究提示，胰腺非内分泌来源的角蛋白19+上皮细胞贴壁培养表达Nestin和波形蛋白，缘于上皮-间充质转化。本实验中胎儿胰岛来源的细胞贴壁后也稳定表达Nestin和波形蛋白，且波形蛋白传代后表达增强，与该研究结果一致，但是否由上皮－间充质转化所致需进一步检测相关细胞标志而定，而获得的Nestin+细胞是否胰岛干细胞，需视其能否分化为胰岛素分泌细胞而定。另外，Qiao等[25]研究显示，由胎儿胰岛样细胞团纯化出的上皮样细胞系胰腺导管来源，除角蛋白19有较强表达外，还表达CD29，而本实验获得的第1代细胞不表达角蛋白19，传代后角蛋白19微弱表达，且所有细胞并未检测到CD29，故有别于Qiao等获得的细胞。
本实验从引产胎儿的胰腺中分离得到双硫腙阳性的胰岛样细胞簇，贴壁培养后获得具有良好增殖能力的干细胞，稳定表达增殖细胞核抗原、胰十二指肠同源盒基因1、Nestin，传代后波形蛋白表达增强，角蛋白19显现，而胰岛素和胰高血糖素表达消失，获得的细胞传代前后均未检测到CD29表达。该细胞可作为候选的胰岛干细胞，深入研究可为糖尿病细胞移植治疗提供来源，还能为胚胎干细胞诱导为功能性胰岛素分泌细胞提供实验依据。

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