人工关节磨屑颗粒诱导巨噬细胞分泌细胞因子与依那西普干预的影响**★

陈志荣，张亮，吴兴临，陆志东，金群华

陈志荣★，男，1974年生，宁夏回族自治区中宁县人，汉族，宁夏医学院在读硕士，主治医师，主要从事脊柱、关节外科专业方面的研究。
rong5999@yahoo.
com.cn

通讯作者：金群华，教授，主任医师，博士，宁夏医学院附属医院骨科，宁夏回族自治区银川市 750004 jinqunhua@sina.
com

国家自然科学基金项目（30560155）*;教育部科学技术研究重点项目（206161）*

中图分类号: R318
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)04-00627-04

Interventional effect of etanercept on cytokine secretion from debris-induced macrophages

Ａｂｓｔｒａｃｔ

ＡＩＭ: It has been demonstrated that tumor necrosis factor alpha (TNF-α) plays an important pathogenetic role in the aseptic loosening of artificial prosthesis. This study explored the possibility for etanercept, anti-TNF-α agents, to prevent the aseptic loosening of prosthesis caused by TNF-α.
ＭＥＴＨＯＤＳ: The experiment was performed at the Generation and Heredity Laboratory of Ningxia Medical College (Ningxia Key Laboratory) from March to July 2007. ①The main agent and drugs involved etanercept (Enbrel, Amgen and Wyeth) and titanium particles (ZIM-MER Co, American; 3–5 μm in diameter). ②Twelve BALB/C mice aged 6–8 weeks of clean grade were executed under anesthesia, and 5 mL RPMI1640 serum-free culture solution was injected into the abdominal cavity. After 3–5 minutes, the abdominal cavity was opened to imbibe peritoneal fluid in sterile condition, then the cell count was performed after centrifugalization and ablution by microscope. After the density of cells was modulated to 3×109/L, the cells were evenly put in 24-well culture plate and cultivated in 0.05 volume fraction CO2 incubator of at 37 ℃ for 12 hours. The culture solution was replaced to remove the unattached cells and obtain macrophages. The disposition on experimental animal conformed to the animal ethical standards. ③Twenty-four hours later, the cultured cells were divided into 5 groups with 8 wells in each group: simple cells group, 1×1012 /L titanium particles group, 1×1012 /L titanium particles + etanercept (10 μg/L, ) group, 1×1012 /L titanium particles + etanercept (100 μg/L) group, and 1×1012 /L titanium particles + etanercept (1 000 μg/L) group. After cultivating for 18 hours, the concentrations of TNF-α, interleukin-1 (IL-1) and IL-6 in the culture supernatants of each group were detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).
ＲＥＳＵＬＴＳ: The concentrations of TNF-α, IL-1 and IL-6 in culture supernatants of 1×1012 /L titanium particles group were significantly higher than those in simple cells group, 1×1012 /L titanium particles + etanercept (100 μg/L) and (1 000 μg/L) groups (P < 0.001). Compared with 1×1012 /L titanium particles + etanercept group (10 μg/L), they were decreased significantly in 1×1012 /L titanium particles + etanercept (1 000 μg/L) group (P < 0.001).
ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ: Etanercept can significantly inhibit the cytokines secreted by debris-induced macrophages in a dose-dependent manner. It is promising to be a therapeutic candidate for the prevention of aseptic loosening of prosthesis.

Chen ZR, Zhang L, Wu XL, Lu ZD, Jin QH.Interventional effect of etanercept on cytokine secretion from debris-induced macrophages. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(4):627-630(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-4/4k-627(ps).pdf]

摘要
目的：已证实肿瘤坏死因子α在人工关节无菌性松动过程中发挥重要作用，依那西普为肿瘤坏死因子α拮抗剂，拟验证采用依那西普预防人工关节钛颗粒刺激巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子α等细胞因子导致无菌性松动的可能性。
方法：实验于2007-03/07在宁夏医学院生殖与遗传实验室完成(宁夏省部级重点实验室)。①主要试剂与药物：依那西普 (Enbrel, Amgen and Wyeth),钛颗粒(美国ZIM-MER公司提供,微粒直径为3~5 μm)。②小鼠腹腔巨噬细胞的分离、培养：麻醉后处死12只6~8周的清洁级BALB/C小鼠，腹腔注入无血清RPMI1640 培养液5 mL，3~5 min后,无菌条件下打开小鼠腹腔，吸取腹腔液，离心洗涤后显微镜下计数，调整细胞至3×109/L，均匀加入24孔培养板中，置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养。12 h后更换培养液,去掉未贴壁的细胞，得到巨噬细胞。实验过程中对动物处置符合动物伦理学要求。③评估指标：24 h后将培养细胞分为5组，每组有8个平行孔：单纯细胞组，1×1012/L钛颗粒组，1×1012 /L 钛颗粒+10 μg/L依那西普组，1×1012/L钛颗粒+100 μg/L 依那西普组，1×1012/L钛颗粒+1 000 μg/L依那西普组。继续培养18 h后，用酶联免疫法检测上述各组细胞上清液中肿瘤坏死因子α、白细胞介素1、白细胞介素6的浓度。
结果：1×1012/L钛颗粒组细胞培养上清液肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、白细胞介素1浓度明显高于单纯细胞组、1×1012/L钛颗粒+100，1 000 μg/L依那西普组（P < 0.001）。1 000 μg/L依那西普组低于10 μg/L依那西普组，差异有显著性(P < 0.001)。
结论：依那西普呈剂量依赖性的有效抑制磨屑颗粒诱导的巨噬细胞分泌细胞因子，有望成为预防人工关节无菌性松动的药物。
关键词：依那西普；巨噬细胞；磨屑；细胞因子；人工假体；组织工程

陈志荣，张亮，吴兴临，陆志东，金群华.人工关节磨屑颗粒诱导巨噬细胞分泌细胞因子与依那西普干预的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(4):627-630 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-4/4k-627(ps).pdf]

人工关节无菌性松动是人工关节置换术远期失败的主要原因。除翻修手术外,目前对关节假体无菌性松动尚无有效的防治手段,但是翻修手术难度大、费用高且长期疗效尚不肯定。依那西普是肿瘤坏死因子α拮抗剂临床上用于治疗与肿瘤坏死因子α相关的多种疾病，如类风湿性关节炎[1]、PsA[2]等。本实验通过观察依那西普对钛颗粒刺激的巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子α等细胞因子的影响，初步探讨依那西普预防人工关节无菌性松动的可能性。

设计：对比观察实验。
单位：宁夏医学院附属医院骨科。
材料：实验于2007-03/07在宁夏医学院生殖与遗传实验室完成(宁夏省部级重点实验室)。
实验动物：6~8周的清洁级BALB/C小鼠12只，体质量18~22 g，雌雄不限，由宁夏医学院动物实验中心提供（实验动物机构许可证号SCXK（宁）2005-0001），分组饲养并将温度控制在25 ℃左右。实验过程中对动物处置符合动物伦理学要求。
主要试剂与药物：依那西普 (Enbrel, Amgen and Wyeth)，钛颗粒(美国ZIM-MER公司提供，微粒直径为3~5 μm)，RPMI1640细胞培养液(GIBCO)，小牛血清(特级，杭州四季青)，24孔培养板(COSTA)，CO2细胞培养箱(LB-7，东京池本理化工业株式会社制造)。倒置显微镜及照相系统(Olympus，LX-50)，肿瘤坏死因子α，白细胞介素1，白细胞介素6酶联免疫吸附试剂盒(R&B，最小检测浓度< 8 ng/L)。
设计、实施、评估者：实验设计为通讯作者，实验资料收集与实施为第一、二、三作者，评估为第四作者，所有人员均经过正规培训，采用盲法评估。
方法：
小鼠腹腔巨噬细胞的分离、培养[3]：脱颈处死6~8周龄BALB/C小鼠，75%乙醇浸泡5 min后，倒立小鼠并腹腔注入无血清RPMI1640 培养液5 mL，仰卧平放并轻揉小鼠腹部2.0~3.0 min，静置3.0~5.0 min后，无菌条件下打开小鼠腹腔，用注射器抽取腹腔液约 4.0~5.0 mL。离心洗涤后显微镜下计数，常规10% RPMI1640培养液(含体积分数为0.1的胎牛血清, 青霉素100 U/mL，链霉素100 mg/L)调整细胞至3×109/L，锥虫蓝排除法检测细胞活力均大于95%。在2块24 孔培养板内滴加细胞悬液，每孔1 mL，置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养，12 h后换液,以去掉未贴壁的细胞，继续培养供实验用。
酶联免疫法检测巨噬细胞分泌细胞因子的量：24 h后将培养细胞分为5组，每组有8个平行孔：单纯细胞组，1×1012/L钛颗粒组，1×1012/L钛颗粒+10 μg/L依那西普组，1×1012/L钛颗粒+100 μg/L依那西普组， 1×1012/L钛颗粒+1 000 μg/L依那西普组。将上述细胞置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中继续培养18 h后取细胞上清液，离心去除钛颗粒，用ELISA法检测肿瘤坏死因子α、白细胞介素1、白细胞介素6的浓度。
主要观察指标：依那西普对巨噬细胞分泌的肿瘤坏死因子α、白细胞介素1、白细胞介素6浓度的影响。
统计学分析：数据以±s表示，由第一作
者采用SPSS 11.5统计学软件包进行单因素方差分析，检验水准为：α=0.05，P < 0.05为差异有显著性意义。

2.1 依那西普对磨屑诱导巨噬细胞分泌的肿瘤坏死因子α的影响 1×1012/L钛颗粒组细胞培养上清液肿瘤坏死因子α浓度明显高于单纯细胞组、1×1012/L钛颗粒+10，100，1 000 μg/L依那西普组[（27.319 8±4.475 9），（9.485 1±1.584 2），（19.195 2±4.721），（13.834 8±3.727 4），（10.817 1±3.872 1）ng/L，（P < 0.001）]； 10 μg/L依那西普组与100，1 000 μg/L依那西普组比较，差异有显著性意义（P < 0.001）；单纯细胞组和 100 μg/L依那西普组与1 000 μg/L依那西普组比较，差异无显著性意义（P > 0.05）。依那西普能够呈剂量依赖性的显著降低磨屑诱导巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子α的量。
2.2 依那西普对磨屑诱导巨噬细胞分泌白细胞介素6的影响 1×1012/L钛颗粒组细胞培养上清液白细胞介素6浓度明显高于单纯细胞组、1×1012/L钛颗粒+10，100，1 000 μg/L依那西普组[（418.927 7±31.978 7），（122.275 3± 37.783 1），（256.804 4±99.560 1），（242.383 7± 33.259 2），（195.170 4±48.821 7） ng/L，（P < 0.001）]；1 000 μg/L依那西普组与单纯细胞组和10 μg/L依那西普组比较，差异有显著性意义（P < 0.001）。依那西普能够呈剂量依赖性的显著降低磨屑诱导巨噬细胞分泌白细胞介素6的量。
2.3 依那西普对磨屑诱导巨噬细胞分泌白细胞介素1的影响 1×1012/L钛颗粒组细胞培养上清液白细胞介素1浓度明显高于单纯细胞组、1×1012/L钛颗粒+100，1 000 μg/L依那西普组[（36.711 2±7.578 1），（24.246 8± 5.249 8），（28.984 9±4.812 7），（25.765 6±5.230 6） ng/L，（P < 0.01）]；1 000 μg/L依那西普组与1×1012/L钛颗粒组、1×1012/L钛颗粒+10 μg/L依那西普组比较，差异有显著性意义（P < 0.001）。依那西普能够呈剂量依赖性的显著降低磨屑诱导巨噬细胞分泌白细胞介素1的量。

1977 年Willert 和Semlitsch提出巨噬细胞对磨损颗粒的反应是导致假体周围骨质吸收及无菌性松动的重要因素。此后，许多学者[4-7]对磨损颗粒与假体周围骨质丢失及无菌性松动关系进行了研究，认为磨损颗粒刺激巨噬细胞和成纤维细胞释放多种具有骨吸收作用的细胞因子如肿瘤坏死因子α，后者引发假体周围的骨吸收、骨溶解，最终导致假体无菌性松动。目前认为, 肿瘤坏死因子α是巨噬细胞吞噬磨屑后最早释放的炎性细胞因子[8]，位于促炎性细胞因子级联反应的上游[9]。孙嗣国等[10]试验证实，肿瘤坏死因子α在体外能够诱导小白鼠外周血单核细胞分化为 TRAP阳性的具有骨吸收活性的多核细胞，而且象牙磨片上虫蚀样骨吸收陷窝的面积随肿瘤坏死因子α的剂量增加而增大。Merkel等[11]动物实验证实，缺乏肿瘤坏死因子受体的小鼠对磨屑可以产生炎症应答，但不能产生破骨细胞，因而也就不能导致骨溶解。这实验再次证实了肿瘤坏死因子α在假体无菌性松动发病机制中起着中枢作用。
研究发现松动假体周围组织反应在产生局限性细胞因子介导骨吸收趋势方面和类风湿性关节炎血管翳相似[12]，肿瘤坏死因子α在诱导形成类风湿性关节炎的细胞因子级联反应中也处于核心地位[13]。在类风湿性关节炎的治疗中抗肿瘤坏死因子α已经成为一项历史性突破[14]。实验证实在类风湿性关节炎滑膜炎症反应中，增加抗肿瘤坏死因子α抗体，可以抑制滑膜分泌的其他前炎性细胞因子的产生如白细胞介素1、白细胞介素6 、白细胞介素8和粒细胞–巨噬细胞集落刺激因子[15]。1998年11月，美国食品药品监管局(FDA)批准依那西普(Etanercept，p75TNF受体:Fc融合蛋白)用于治疗类风湿性关节炎。依那西普是一种重组的人可溶性肿瘤坏死因子受体蛋白，为二聚体融合蛋白，由人类Mr75 000肿瘤坏死因子受体的细胞外配体结合部分与人类IgG Fc段连接而成，其作用机制为竞争性地与血肿瘤坏死因子α结合，阻断肿瘤坏死因子α和细胞表面肿瘤坏死因子受体结合，降低肿瘤坏死因子α活性[16]。研究表明用依那西普治疗类风湿性关节炎，可使70%以上对传统药物耐药的患者得到明显的症状改善，从X射线片及MRI上可见骨质侵袭性破坏有明显的改善[17-19]。基于上述研究，作者猜想依那西普对于预防磨屑诱导的骨吸收、骨溶解可能有效。
本实验将小鼠腹腔巨噬细胞和钛颗粒及依那西普共同培养，来观察依那西普对磨屑诱导巨噬细胞分泌细胞因子的影响。实验发现1×1012/L钛颗粒组的肿瘤坏死因子α、白细胞介素1 及白细胞介素6含量明显高于单纯细胞组，表明钛颗粒可以诱导巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子α、白细胞介素1及白细胞介素6；钛颗粒组与钛颗粒+100，1 000 μg/L依那西普组比较差异有显著性，表明依那西普可以抑制磨屑诱导的巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子α、白细胞介素1 及白细胞介素6；1 000 μg/L依那西普组和10 μg/L依那西普组比较差异有显著性，表明依那昔普能够呈剂量依赖性的显著降低磨屑诱导巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子α、白细胞介素1 及白细胞介素6；作为肿瘤坏死因子受体拮抗剂，依那西普不仅抑制了磨屑诱导巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子α，而且还抑制了磨屑诱导巨噬细胞分泌白细胞介素1 及白细胞介素6，这也印证了肿瘤坏死因子α在磨屑诱导骨溶解中居于上游地位，可以调节其他细胞因子的释放[20]。
肿瘤坏死因子受体拮抗剂依那西普在体外可以有效地抑制磨屑诱导巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子、白细胞介素1 及白细胞介素6，有望成为预防人工关节无菌性松动的药物。实验将进一步研究依那西普在动物体内抑制磨屑诱导骨溶解的情况，为用依那西普预防磨屑诱导骨溶解提供实验依据。

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