丹参对原位肝移植大鼠供肝冷保存再灌注损伤的保护作用☆

王宇1，周杰1，蒋晓青2

课题背景：相关研究表明，丹参对心、脑、肝等重要器官的缺血再灌注损伤有保护作用。动物实验亦表明术前应用丹参对肝门阻断再开放所致肝脏再灌注损伤具有改善作用。但其是否对异体肝移植术后移植肝脏缺血再灌注损伤具有明确的保护作用，检索Pubmed、万方数据库目前尚无报道。

应用要点：①参照改良Kamada法制备大鼠异体原位肝移植模型，首次采用含有丹参的林格灌注液灌注保存肝移植大鼠供体肝脏。 ②课题开展传统中药丹参对异体肝移植肝脏缺血再灌注损伤影响的分析，为中医药在肝移植领域的应用开辟了新思路。

同行评价：目前常用的器官保存液如UW液在试验条件下已经能使肝脏保存超过24 h，而临床也观察到保存肝脏的活性长达12 h甚至更长。国内也在上世纪末开始用中药研究器官保存，但目前还没有一种中药的保存时间能超过UW液的。因此中药只能作为保存液的其中一个成分，其保存效果和意义目前还是一个未知数。丹参的器官保存作用在大鼠肝移植实验模型上的应用目前万方数据库还未见相关报道，文章有一定的价值。

南方医科大学南方医院， 1肝胆外科，2麻醉科SICU，广东省广州市 510515

王宇☆，男，1973年生，辽宁省营口市人，汉族，南方医科大学在读博士，主治医师，讲师，主要从事肝脏移植的临床与基础研究。wangyu@fimmu. com

通讯作者：周杰，教授，主任医师，博士生导师，南方医科大学南方医院肝胆外科，广东省广州市 510515 jacky@fimmu.
com

摘要
目的: 研究表明，丹参对心、脑、肝等重要器官的缺血再灌注损伤有保护作用。制备大鼠异体原位肝移植模型，验证丹参对大鼠肝移植缺血再灌流损伤的保护作用。
方法：实验于2006-10/2007-08在南方医院中心实验室及动物实验中心完成，动物实验方法符合动物伦理学要求。①实验材料及分组：选用SD大鼠40只，按随机数字表法分为假手术组、模型对照组和丹参注射液组，假手术组8只，模型对照组、丹参注射液组各8对（供体与受体）。②实验方法：建立原位肝移植模型，在供肝灌注冷保存时，以4 ℃ 乳酸林格氏液为基液，丹参注射液组灌注保存液中加60 mL/L丹参注射液；模型对照组不加丹参。③实验评估：移植术后6 h处死各组大鼠取样，检测血清谷草转氨酶、谷丙转氨酶及乳酸脱氢酶活性；测定肝组织中丙二醛含量及超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性，并对比观察移植肝病理形态学改变。
结果：模型对照组和丹参注射液组16只受体大鼠及假手术组8只大鼠全部进入结果分析，无脱失。①丹参注射液组和模型对照组移植肝再灌注后血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶及乳酸脱氢酶活性均高于假手术组(P < 0.01)；丹参注射液组低于模型对照组(P < 0.01)。②丹参注射液组肝组织中丙二醛含量较模型对照组明显下降(P < 0.01)，超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性则明显升高 (P < 0.01)。③丹参注射液组较模型对照组肝组织肝细胞坏死程度减轻，炎性细胞浸润减少，肝组织再灌注损害程度减轻。
结论：丹参对原位肝移植肝脏的缺血再灌注损伤有保护作用，从而减轻氧自由基及脂质过氧化，保护细胞膜，改善肝功能。
关键词：肝移植；丹参；再灌注损伤；疾病模型，动物

王宇，周杰，蒋晓青.丹参对原位肝移植大鼠供肝冷保存再灌注损伤的保护作用[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(5):801-804 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/12-5/5k-801(ps).pdf]

中图分类号:R657.3
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)05-00801-04

Effects of radix salvia miltiorrhiz on protecting donor liver against cold preservation and reperfusion injury during orthotopic liver transplantation in rats

AIM:Studies reveal that radix salvia miltiorrhiz can protect critical organs such as heart, brain and liver, etc. from ischemia/reperfusion injury. This study established orthotopic liver transplantation model in rats and investigated the protective effect of radix salvia miltiorrhiz on the ischemia/reperfusion injury.
METHODS: The experiment was carried out in the Central Laboratory and Animal Experimental Center of Nanfang Hospital between October 2006 and August 2007. And the experimental procedures were in accordance with the ethical standard of animals.①Forty SD rats were randomly divided into radix salvia miltiorrhiz experimental group (n=16), model control group (n=16) and pseudo-treatment group (n=8).②Rat orthotopic liver transplantation model was established. Perfusion and preserving solution at 4 ℃ were miltiorrhiz Ringer's lactate solution (60 mL/L) in the miltiorrhiz experimental group and Ringer's lactate solution without miltiorrhiz in the model control group.③Six hours after reperfusion, the recipients were sacrificed, then serum alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST) and lactate dehydrogenase (LDH) activities were measured. The changes of malondialdehyde (MDA), superoxide dismutase (SOD) and glutathion peroxidase (GSH-Px) in the liver tissues were observed. The histopathological changes were also compared.
RESULTS: All of 40 rats were involved in the result analysis without loss.①Serum ALT, AST, LDH levels in the miltiorrhiz experimental group and model control group were higher than those in the pseudo-treatment group after the grafts reperfusion (P < 0.01), and these levels were lower in the miltiorrhiz experimental group than in the model control group (P < 0.01).②Compared with model control group, the liver MDA levels were significantly lower (P < 0.01), while SOD and GSH-PX levels were significantly higher in the miltiorrhiz experimental group (P < 0.01).③Compared with model control group, the hepatic cell necrosis lessened, inflammatory cell infiltration decreased and the liver tissue reperfusion injury relieved in the miltiorrhiz experimental group.
CONCLUSION: Radix salvia miltiorrhiz can decrease oxygen-derived free radical and lipid peroxidation, protect cell membrane, and improve hepatic function by the protective effect on the ischemia/reperfusion injury in orthotopic liver transplantation.

Wang Y, Zhou J, Jiang XQ.Effects of radix salvia miltiorrhiz on protecting donor liver against cold preservation and reperfusion injury during orthotopic liver transplantation in rats.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(5):801-805(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-5/5k-801(ps).pdf]

如何降低移植肝脏缺血缺氧再灌流损伤，改善移植肝质量，提高肝移植的成功率是目前肝移植研究领域的重要课题之一。丹参对重要器官的缺血再灌注损伤有保护作用，能防止肝细胞内钙超载，并具有减轻氧自由基及脂质过氧化，保护细胞膜等功能[1-2]。但对异体肝移植供肝冷保存再灌注损伤的保护作用研究目前尚无报道。本课题应用含有丹参的灌注液对大鼠供肝进行灌注和冷保存，行原位肝移植后检测缺血再灌注损伤相关指标变化，分析丹参对移植肝脏缺血再灌注损伤的保护作用。

设计：随机对照动物实验。
单位：南方医科大学南方医院肝胆外科。
材料：实验于2006-10/2007-08在南方医院中心实验室及动物实验中心（均为省一级实验室）完成。选用SD系雄性大鼠40只，SPF级，体质量(220±30) g，鼠龄10~12周，由南方医科大学实验动物饲养中心（实验动物许可证号：SCXK（粤）2006A051）提供。将40只大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型对照组和丹参注射液组，假手术组8只，模型对照组、丹参注射液组各8对（供体与受体）。动物实验方法符合动物伦理学要求。
设计、实施、评估者：设计、实施均为第一作者，评估为第二作者，均经过正规培训，未使用盲法评估。
方法：
动物模型的制备：参照改良Kamada法[3]制备大鼠原位肝移植模型，灌洗保存液以4 ℃乳酸林格氏液（LR）为基液，每500 mL加肝素50 U；丹参注射液组灌洗保存液中加丹参注射液60 mL/L，模型对照组不加丹参。取供肝后经门脉插管持续低压相应灌洗液20 min后，于4 ℃ 保存液保存5 h后原位植入受体。假手术组方法同肝移植受体的肝脏游离，结扎左膈下静脉及右肾上腺静脉，只是不作肝切除，目的是进行正常对照，以排除手术因素对实验的影响。
样本的采集：各组大鼠分别于再灌注后6 h经下腔静脉取血4 mL，麻醉后取血处死大鼠，分别取肝中叶组织适量，快速置于液氮及40 g/L中性甲醛中保存待测。
标本检测：
肝功能测定：将腔静脉血离心(4 ℃，3 000 r/min)10 min后，取上清，采用全自动生化分析仪测定谷丙转氨酶、谷草转氨酶及乳酸脱氢酶活性。
氧自由基代谢相关指标检测：取各组大鼠再灌注后肝组织标本约1 g，制成匀浆后，分别采用硫代巴比妥酸法、黄嘌呤氧化酶法及比色法测定丙二醛含量、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性（测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所）。
病理学检查：行石蜡包埋的肝组织切片，苏木精－伊红染色，光学显微镜下观察肝组织的病理学变化。
主要观察指标：①大鼠原位肝移植术后血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶及乳酸脱氢酶活性及肝组织中丙二醛含量、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性。②大鼠原位肝移植术后肝组织病理学改变。
统计学分析：由第三作者采用SPSS 11.0软件进行统计处理，各指标用_x±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，P < 0.05为差异具有显著性意义。

2.1 实验动物数量分析纳入40只大鼠，模型对照组和丹参注射液组16只受体大鼠及假手术组8只大鼠全部进入结果分析，无脱失（经前期预实验熟练掌握方法，手术成功率已达96%以上）。
2.2 血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶活性变化见表1。

如表1所示，与假手术组比较, 丹参注射液组和模型对照组肝移植术后血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶及乳酸脱氢酶活性均升高(P < 0.01)。但丹参注射液组再灌注后6 h的血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶及乳酸脱氢酶活性均低于模型对照组(P < 0.01)。
2.3 肝组织丙二醛、超氧化物歧化酶及谷胱甘肽过氧化物酶变化见表2。

如表2所示，与假手术组比较，丹参注射液组和模型对照组移植术后丙二醛含量升高(P < 0.01)，超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性降低(P < 0.01)。移植肝血流再灌流后6 h丹参注射液组丙二醛含量较模型对照组降低(P < 0.01)，超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性较模型对照组升高(P < 0.01)。说明氧自由基主要产生于再灌流后，但用丹参灌注保存供肝可减少丙二醛含量的增加和超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性的下降程度。
2.4 病理学检查结果光镜下假手术组肝组织结构基本正常（图1a），模型对照组术后6 h可见肝细胞灶性坏死，伴大量中性粒细胞及单核细胞浸润，肝窦内皮细胞肿胀受损，与Disse间隙脱离，库氏细胞增生明显（图1b）。丹参注射液组可见部分肝细胞呈空泡变性，肝细胞坏死减轻，炎性细胞浸润明显减少，库氏细胞增生，肝组织的损害程度较模型对照组明显减轻（图1c）。

自1963年Starzl施行第1例人体原位肝移植以来，至今已有40余年的肝移植历史。近年来随着新型器官保存液及新型强有力的免疫抑制剂的应用，临床肝移植已在全世界范围内广泛开展，其作为终末期肝病、急性肝功能衰竭、先天性及代谢性肝病和部分肝脏肿瘤的最为有效手段的地位已被公认。移植早期并发移植肝术后无功能的发生率为2%~23%[4]，是导致肝移植失败的主要原因之一。其发生原因错综复杂，但与肝移植体保存期间组织缺血缺氧再灌注损伤有极为密切的关系[5-7]。供肝在进行冷灌注前灌注后及保存时都会造成缺血性损害，冷保存再恢复血流灌注后将发生更为严重的损伤即再灌注损伤，因为贮存肝脏再灌注可导致氧依赖的肝脏微循环紊乱等，从而造成移植肝的缺血坏死病灶，这也是导致术后移植肝功能不良的重要因素。移植肝缺血再灌注损伤的防治是肝移植为稳定术后移植肝脏功能，提高肝移植成功率的肝移植领域研究热点之一。大量研究表明，缺血再灌注损伤与肝细胞能量代谢障碍、氧气自由基增多、细胞内钙超载及由炎症细胞介导的炎症因子反应有密切关系[8-11]。因此，防止细胞内能量代谢障碍，减轻氧自由基增多及细胞内钙超载，对减轻移植肝缺血再灌注损伤具有重要意义。
近年来研究表明[1-2，12-13]，丹参除具有改善微循环方面的作用，丹参中所含主要活性成分丹参酚等酚类成分，具有很强的抗氧化活性，可作为天然抗氧化剂，抑制细胞匀浆丙二醛，诱导细胞色素P450合成，降低血清脂质过氧化物，防治脂质过氧化所致的细胞损伤。丹参对重要器官的缺血再灌注损伤有保护作用，认为丹参能防止肝门部阻断再开放所致的肝脏缺血再灌注损伤期肝细胞内钙超载，并具有减轻氧自由基及脂质过氧化作用，增加ATP含量，保护细胞膜等功能。丹参保护细胞膜结构的完整性从超微结构观察中已得到证实[14-15]。但对丹参用于供肝灌注冷保存对异体肝移植术后移植肝脏缺血再灌注损伤的保护作用目前尚未见报道。大鼠肝脏在4 ℃ 平衡液中保存的安全时限为2~4 h[16]，为探讨丹参对异体肝移植供肝冷缺血再灌注损伤是否有保护性作用，作者采用将供肝于移植术前置于加有丹参注射液的4 ℃ 灌注液中保存5 h，再移植入丹参组受体的大鼠原位肝移植模型，而模型对照组灌注保存液中不含丹参注射液，两组大鼠供肝的热缺血和冷缺血时间有无统计学差异(P < 0.01)，术后6 h取样检测，评价丹参对移植术后供肝再灌注损伤的保护作用。由于缺血再灌注损伤存在两个重要阶段：缺血再灌注始动阶段(再灌注后1~3 h)，在4~6 h达到高峰，主要与产生氧自由基和激活Kuffer细胞的活化有关；缺血再灌注损伤晚期阶段(再灌注后18~24 h)，主要与中性粒细胞侵蚀流入肝内有关[17-18]。而丹参主要活性成分丹参酚作为一种抗氧化剂，其作用主要是减轻氧自由基及脂质过氧化作用，因此本实验选择在术后6 h氧自由基损伤高峰期间进行检测，而远期生存率及效果由于影响因素较多，未列入此次观察范围。结果显示，供肝经过丹参组灌注冷保存后，较模型对照组可明显减少移植肝脏再灌流后丙二醛的产生，阻止超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的下降，肝功能指标损伤程度亦较模型对照组减轻，肝组织病理学检查损害程度亦明显减轻。改善肝脏缺血再灌注时能量代谢应是丹参有效保存肝脏的重要因素之一，在肝脏缺血再灌注时氧化系统被激活，抗氧化系统受抑制，氧自由基大量生成而清除减少，体内氧自由基水平升高，从而引起脂质过氧化反应，进一步导致肝脏缺血再灌注损伤。丹参实验组减低保存期间能量的消耗，促进能量的产生，对保存效果甚为重要。在林格氏液中含有丹参能使肝组织超氧化物歧化酶活性明显升高，而丙二醛含量明显下降，丹参增加内源性超氧化物歧化酶活性，有效清除氧自由基，减低肝组织脂质过氧化反应。由此可见丹参在移植肝脏缺血再灌注中具有抗氧自由基的作用。
本实验表明，丹参对异体原位肝移植供肝冷保存再灌注损伤亦具有较好的保护作用，其保护移植肝脏的缺血再灌注损伤的机制可能与减轻能量代谢障碍，氧自由基损伤及钙超载损伤3个方面作用有关，从而减轻细胞膜脂质过氧化损伤，稳定细胞膜，减轻再灌流时的肝脏损伤。因此，丹参在肝移植供肝再灌注损伤防止中可能有较好的应用前景，但在临床肝移植中应用添加丹参的灌注液国内外迄今还未见报道，还有待于进一步深入研究。

4 参考文献
1 Lu QP, Shi CR, Wu ZD, et al. Zhonghua Waike Zazhi 1996;34(2): 98-101
卢绮萍,史陈让,吴在德,等.丹参防治肝缺血再灌注期肝细胞内钙超载的实验与临床研究[J]. 中华外科杂志,1996, 34(2): 98-101
2 Chang PN, Mao JC, Huang SH, et al. Analysis of cardioprotective effects using purified Salvia miltiorrhiza extract on isolated rat hearts. J Pharmacol Sci 2006;101(3): 245-249
3 Wang X, Yang JM, Yan YQ, et al. Zhonghua Shiyan Waike Zazhi 1997;14(1):59-60
王轩, 杨甲梅, 严以群, 等. 大鼠原位肝移植模型术式的改进[J]. 中华实验外科杂志,1997,14(1):59-60
4 Claven PA, Harvey PR, Strasberg SM, et al. Preservation and reperfusion injuries in liver allografts. Transplantation 1992;53(5):957-978
5 Ploeg RJ, D'Alessandro AM, Knechtle SJ, et al. Risk factors for primary dysfunction after liver transplantion-a multivariate analysis. Transplantation 1993;55(4):804-813
6 Ramalho FS, Fernandez MI, Rosello CJ, et al. Hepatic microcirculatory failure. Acta Cir Bras 2006;21(Suppl 1):48-53
7 Franco GR, Mosbah IB, Serafin A, et al. New preservation strategies for preventing liver grafts against cold ischemia reperfusion injury. J Gastroenterol Hepatol 2007;22(7):1120-1126
8 Ploeg RJ, D'Aless AM, Knechtle SJ, et al. Risk factors for primary dysfunction after liver transplantion-a multivariate analysis. Transplantation 1993;55(4):807-813
9 Puhl G, Schaser KD, Pust D, et al. Initialhepatic microcirculation correlates with early graft function in human orthotopic liver transplantation. Liver Transpl 2005;11:555-563
10 Nieuwenhuijs VB, DeBruijn MT, Padbury RT, et al. Hepatic ischemia-reperfusion injury: roles of Ca2+ and other intracellular mediators of impaired bile flow and hepatocyte damage. Dig Dis Sci 2006;51(6):1087-1102
11 Riddle TE, Nagasaki K, Lopez J, et al. Mutations to bid cleavage sites protect hepatocytes from apoptosis after ischemia/reperfusion injury. Transplantation 2007;84(6):778-785
12 Sun B, Jiang HC, Zhao JP, et al. Zhonghua Shiyan Waike Zazhi 2000;17(3):233-234
孙备,姜洪池,赵金鹏,等.丹参对大鼠肝脏低温保存损伤的保护作用[J]. 中华实验外科杂志,2000,17(3):233-234
13 Xing HC, Li LJ, Xu KJ, et al. Effects of Salvia miltiorrhiza on intestinal microflora in rats with ischemia/reperfusion liver injury. Hepatobiliary Pancreat Dis Int 2005;4(2):274-280
14 Deng HJ, Ma XH, Xu RL, et al. Zhongguo Zhongyao Zazhi 1992;17(4):233-234
邓和军,马学惠,许瑞龄,等.丹参护肝机理的研究[J].中国中药杂志,1992,17(4):233-234
15 Zhong L, Hong ZQ, Lu L, et al. Zhongguo Gushang 2007;20(2): 97-99
张俐, 洪振强, 鲁力, 等. 丹参改善骨骼肌缺血再灌注损伤的超微结构观察[J].中国骨伤, 2007, 20(2):97-99
16 Suatimoto R, Jamieson NV, Wake K, et al. 24-hour rat liver preservationusing UW solution and some simplified variants. Transplantation 1989;48(1):1-5
17 Arii S, Teramoto K, Kawamura T. Current progress in the understanding of and therapeutic strategies for ischemia and reperfusion injury of the liver. J Hepatobiliary Pancreat Surg 2003;10(3):189-194
18 Kupiec-Weglinski JW, Busuttil RW. Ischemia and reperfusion injury in liver transplantation. Transplant Proc 2005;37(4):1653-1656